Extracto
Antecedentes
periostina es una importante proteína de la matriz extracelular implicado en el desarrollo celular y la adhesión. Anteriormente, hemos identificado periostina a ser de hasta reguladas en el cáncer de próstata agresivo (PAC) usando glycoproteomics cuantitativos y espectrometría de masas. La expresión de la periostina se evaluó adicionalmente en la prostatectomía radical primaria (RP), los tumores de próstata y tejidos de próstata no tumorales adyacentes mediante inmunohistoquímica (IHC). Nuestros resultados IHC mostraron un fondo de bajo periostina niveles en los tejidos de la próstata no tumorales adyacentes, pero sobreexpresa niveles periostina en el estroma peritumoral de los tumores primarios de CaP.
Métodos
En este estudio, la expresión periostina en cáncer de próstata, se examinó en varios microarrays de tejidos (TMA), que se realizaron en cuatro laboratorios. Para lograr tinción coherente, todas las TMA se tiñeron con mismo protocolo y calificadas por la imagen misma herramienta de cálculo para determinar las intensidades de tinción total de periostina. El TMA se anotó más por los patólogos para caracterizar la tinción estromal y tinción epitelial.
Resultados
La tinción periostina se observó principalmente en las células del estroma peritumoral y en algunos casos en las células epiteliales tumorales, aunque el más fuerte la tinción se encuentra en las células del estroma peritumoral. Tanto la tinción del estroma periostina y tinción epitelial pueden diferenciar de BPH de CaP incluyendo la capa de bajo grado (puntuación de Gleason ≤6), con significativa p-valor de 2.2e-16 y 0.001, respectivamente. Periostina epiteliales tinción PIN diferenciada de CaP de bajo grado (puntuación de Gleason ≤6) (p = 0,001), mientras que la tinción del estroma periostina diferenciado de bajo grado (puntuación de Gleason ≤6) Cap de alta calidad (puntuación de Gleason ≤6) Cap (p = 1.7e -05). Además, se observó una correlación positiva entre la tinción periostina total y la puntuación de Gleason (r = 0,87, p = 0,002).
Conclusiones
Los resultados mostraron que la tinción periostina se correlacionó positivamente con el aumento de Gleason la puntuación y la agresividad de la enfermedad de la próstata
Visto:. Tian y, Choi CH, Li QK, Rahmatpanah FB, Chen X, Kim SR, et al. (2015) La sobreexpresión de periostina en Stroma positivamente asociado con el cáncer de próstata agresivo. PLoS ONE 10 (3): e0121502. doi: 10.1371 /journal.pone.0121502
Editor Académico: Varda Rotter, Instituto de Ciencia Weizmann, ISRAEL
Recibido: 3 de octubre de 2014; Aceptado: February 1, 2015; Publicado: 17 Marzo 2015
Derechos de Autor © 2015 Tian et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por los Institutos nacionales de Salud, Instituto Nacional del cáncer, la Red de Investigación de Detección temprana (EDRN, U01CA152813) a HZ y Detección temprana de la Red de Investigación del NCI CA86366 a DC. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
En nuestro esfuerzo previo para identificar los cambios en las proteínas entre el cáncer de próstata agresivo y no agresivo (PAC), nuestro grupo analizó glicopéptidos aisladas de los tumores de próstata agresivos y no agresivos por glycoproteomics cuantitativos mediante el etiquetado iTRAQ de contener glycosite- péptidos y espectrometría de masas tándem [1]. Se identificaron la sobreexpresión de tres glicoproteínas en los tejidos de CaP agresivos comparación con los tejidos de CaP no agresivos. Dos proteínas, la catepsina L y periostina, son proteínas de la matriz extracelular (ECM). La catepsina L actúa como una endopeptidasa, que puede degradar muchas proteínas intracelulares y extracelulares de modificar su función. La otra proteína, la periostina, fue verificado mediante inmunotransferencia e inmunohistoquímica (IHC) análisis [1]. Por lo tanto, nuestras observaciones apoyan un papel importante para el microambiente tumoral en la progresión del CaP.
periostina, también conocido como factor de 2-osteoblastos específico (OSF-2), es una proteína de ECM conservadas evolutivamente y un miembro de la fasciclina la familia [2]. Se ha demostrado que periostina interactúa con otras proteínas de ECM, tales como fibronectina, colágeno V, y tenascina-C. Periostina también interactúa con diversos receptores de la superficie celular, sobre todo integrinas, y señales principalmente a través de la PI3-K /Akt y otras vías para promover el crecimiento celular, la supervivencia celular, epitelio-mesenquimal transición (EMT), la invasión, la angiogénesis tumoral y la metástasis [ ,,,0],2-5]. Estudios recientes han revelado que periostina está implicado en el desarrollo de diversos tumores, como el de mama, colon, pulmón, cáncer de ovario y cáncer de próstata [6-11].
En este estudio, nuestro objetivo es comprobar la correlación de expresión periostina y la agresividad del CaP. IHC usando anticuerpos específicos periostina se realizó para evaluar nueve TMA de varios laboratorios, que constan de un total de 3048 núcleos de prostatectomía radial (RP). Para lograr tinción consistente, los protocolos y los reactivos fueron enviados a los laboratorios ya sea colaborador o TMA fueron enviados a nuestro laboratorio para la tinción TMA. Para eliminar la variación de puntuación de los laboratorios individuales, todas las TMA fueron teñidos escaneados utilizando el escáner mismo con la misma configuración, y las imágenes escaneadas fueron anotados por la imagen misma herramienta de cálculo para determinar las intensidades de tinción total de periostina. El TMA se anotó más por los patólogos para caracterizar la tinción estromal y tinción epitelial.
Materiales y Métodos
Materiales
conejo anticuerpo antihumano periostina eran de Abcam (ab14041, Cambridge, REINO UNIDO); kit LSAB + Sistema-AP de Dako (Carpinteria, CA); y todos los demás productos químicos fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
Tejido de microarrays (TMA)
TMA de la Universidad de California en Los Angeles (UCLA).
Tres TMA consisten en 197 núcleos de próstata no tumoral (NT), 140 núcleos de la hiperplasia prostática benigna (BPH), 64 núcleos de intraepitelial prostática neoplasia (PIN), y 963 núcleos de adenocarcinoma de próstata a partir de 246 casos (3 núcleos en promedio para cada caso) fueron reportados previamente [12, 13]. NT se definió como el tejido prostático no canceroso adyacente.
TMA de la Universidad de California en Irvine (UCI).
Tejido de microarrays (TMA) de 480 núcleos consisten en 199 casos de tumores (con más de 10 años de seguimiento), 108 núcleos de pares de neoplasias intraepiteliales prostáticas (PIN), 7 núcleos de pares de estroma, 3 núcleos de la HPB, y 86 núcleos de calibradores y líneas celulares como se informó anteriormente [14, 15].
TMA de la Universidad Johns Hopkins (JHU) (laboratorio de Bob Veltri).
Dos microarrays de tejidos adenocarcinoma de próstata (0,6 mm de diámetro, 6 núcleos por caso) denominan TMA 681-682, fueron creados en virtud de una subvención CEVC EDRN (PI Alan W. Partin) construida en el departamento de la Universidad Johns Hopkins de la patología utilizando la pieza de PR resecados quirúrgicos obtenidos del departamento de archivos de patología. Cada uno de dos diapositivas TMA representa 40 casos de tapón (4 núcleos por caso) y tejidos de la próstata no cancerosas emparejado con el tumor (4 núcleos por caso). Se obtuvieron los tejidos no cancerosos tumores de próstata incluidos en parafina y fijados en formalina e igualado con el tumor para TMA 681-682 basado en solicitud presentada al Departamento de Patología del Hospital Johns Hopkins a través de la red biorepositorio cáncer de próstata (PCBN). El uso de las TMA TMA incluyendo 681-682 de biomarcadores fue aprobado por la Universidad Johns Hopkins IRB (Institutional Review Board) para el cáncer de próstata.
TMA de la Universidad Johns Hopkins (JHU) (laboratorio de Hui Zhang).
el microarray de tejido de cabeza (0,6 mm de diámetro, 6 núcleos por caso) se construyó en la Universidad Johns Hopkins usando la pieza de PR resecados quirúrgicos obtenidos del departamento de patología del archivo en el hospital Johns Hopkins. El uso de la información y el tejido tumoral clínico fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la Universidad Johns Hopkins. Representados en el TMA se registraron 60 casos de adenocarcinomas de próstata (4 núcleos por caso) y tejidos de la próstata no cancerosas emparejado con el tumor (2 núcleos por caso). Además, 60 casos de los tejidos de control no próstata no cancerosas se incluyeron en el microarray, que consiste en riñón normal, estómago, intestino delgado, colon, hígado, páncreas, endometrio, el cerebro y los ganglios linfáticos.
Inmunohistoquímica (IHC)
El TMA se cocieron a 60 ° C durante 1 hora, deparaffinized rehidratada. El TMA se incubaron con 5% de BSA /PBS a temperatura ambiente durante 45 minutos, y luego incubadas con 3% de H
2O
2 a temperatura ambiente durante 15 minutos antes de aplicar el anticuerpo primario. Rabbit periostina antihumano (Abcam, ab14041) se utilizaron en una dilución de 1:. 4000 para teñir TMA y se detectaron usando el kit Dako LSAB + Sistema de AP de acuerdo con las instrucciones del fabricante
Para analizar la tinción periostina total el recuento de píxeles positivos (PPC, v11) algoritmo (Aperio Ámbito de imagen) se aplicó a los núcleos individuales de 9 TMA para calcular la intensidad media de píxeles (en un canal colorimétrico correspondiente al precipitado marrón IHC) de todos los píxeles dentro de cada región de la anotación. En resumen, hemos utilizado los parámetros de entrada de PPC que están predeterminadas para la cuantificación de color marrón y luego se corre el algoritmo. Una imagen de pseudo-color de "mark-up" se genera como resultado un algoritmo, lo que confirma que los insumos especificados miden el color deseado y rangos de intensidad. intensidad de color mancha positiva se clasifican en códigos de colores tres rangos: 1) Intensidad positiva débil (IWP) = amarillo, 2) Intensidad positivo (Ip) = naranja, y 3) la intensidad fuerte positivo (ISP) = red. Porcentaje de tinción se calcula como el número total de píxeles positivos dividido por el número total de píxeles y se correlacionaron con las puntuaciones de Gleason.
La inmunotinción también se evaluó a ciegas por el Hospital Johns Hopkins (JHH) para caracterizar los patólogos del estroma y localización tinción epitelial. El TMA se anotó semi-cuantitativamente usando un sistema de cuatro niveles basado en la intensidad y distribución: 0, no detectable; 1+, débil tinción; 2 +, tinción medio, 3+, fuerte tinción. Todas las TMA fueron escaneados a 20X y las imágenes fueron fotografiados usando IHC Aperio Alcance de la imagen (v11.2.0.780).
Análisis estadístico
El signo de Wilcoxon rank test fin (emparejado, dos caras) se realizó por tinción periostina en el estroma peritumoral y el estroma no tumoral que fue anotado por patólogos. La diferencia de tinción periostina, ya sea en el estroma o células epiteliales entre diferentes condiciones de enfermedad de la próstata se evaluó la puntuación individual mediante la prueba de Chi-cuadrado. Se utilizó la prueba de Pearson coeficiente de correlación para analizar la correlación de la puntuación de Gleason y la positividad de la tinción periostina total, incluyendo tanto estromal y tinción de las células epiteliales de la puntuación computacional.
P-valores
. & Lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
Análisis glycoproteomics previa de tejidos de CaP agresivos y no agresivos demostró que periostina fue significativamente mayor en próstata agresivo tumores [1]. El descubrimiento inicial se verificó mediante IHC [1]. Este estudio tiene como objetivo verificar que la sobreexpresión periostina en el CaP el uso de grandes conjuntos de muestras a partir de múltiples laboratorios y métodos de acopio universales. El TMA incluye una del laboratorio Hui Zhang (JHU) que consiste en 360 núcleos (60 casos), dos de Bob Veltri Brady de Urología del Instituto de laboratorio (JHU) que consisten en 640 núcleos (80 casos), tres de laboratorio de David Chia (UCLA) que consisten 1364 núcleos (246 casos), y tres del laboratorio Dan Mercola (UCI) que consiste en 684 núcleos (199 casos).
Para eliminar la variación de los laboratorios individuales de lectura, todas las TMA fueron teñidos escaneados en la Universidad Johns Hopkins utilizando la imagen de Aperio sistema y los 20X imágenes escaneadas fueron analizados utilizando las mismas herramientas de cálculo para determinar la intensidad global de la tinción para cada núcleo. Hemos validado la interpretación adicional TMA por patólogos jhh para todas las TMA para separar la tinción estromal y tinción epitelial. lecturas de los patólogos utilizan un sistema de cuatro niveles basado en la intensidad y distribución: 0, indetectable; 1+, débil tinción; 2 +, tinción medio, 3+, fuerte tinción (Fig. 1A). En coherente con nuestra observación anterior, se observó principalmente la tinción periostina en células estromales peritumoral y en algunos casos en las células epiteliales tumorales aunque la tinción más fuerte se encontró en las células del estroma peritumoral (Fig. 1A). A continuación, el análisis estadístico se realizó para responder a las siguientes preguntas: 1) si la expresión periostina puede diferenciar tejidos de la próstata, incluyendo el cáncer de próstata, las zonas no tumorales de tejidos de la próstata, la HBP, y PIN; 2) si la expresión periostina se correlaciona con las variables clínicas, como la puntuación de Gleason
(A) Criterios Los patólogos para IHC puntuación (a) 0, indetectable..; (B) 1+, débil tinción; (C) 2 +, tinción medio; (D) 3+, fuerte tinción. Periostina estaba manchada principalmente en el estroma peritumoral. Parcelas (B) de la caja de la positividad de la tinción total de periostina en el adenocarcinoma prostático de pacientes emparejados y tejidos de la próstata no tumorales. (C) La distribución de los cambios en las puntuaciones de IHC entre el estroma peritumoral y el estroma de las zonas no tumorales (NT). En el eje X-1: puntuación de IHC en el NT es mayor que en el cáncer de emparejado en 1; 0: resultados de IHC son los mismos para el NT emparejado y el cáncer; 1: puntuación de IHC en el NT es menor que en el cáncer de emparejado en 1; 2: NT más bajo que el cáncer por 2; 3: NT más bajo que el cáncer por 3. La altura de las barras (eje y) es el número de pacientes. La altura suma de barras de color rojo es mucho mayor que la barra verde, lo que indica que los resultados de IHC entre las células del estroma peritumoral son mucho mayores que las células estromales normales correspondientes.
Para determinar si la expresión de periostina podría diferenciar la tapa de las zonas no tumorales de tejidos de la próstata, se realizaron análisis estadísticos para los tres TMA de la Universidad Johns Hopkins, porque estas TMA consisten tanto en los tumores de próstata y tejidos de la próstata no tumorales de pacientes emparejados. tinción total de periostina y tinción estromal se analizaron respectivamente. La tinción total de periostina se incrementó en el tumor de próstata con una puntuación de Gleason 6 y más en comparación con los tejidos no tumorales de próstata emparejados (fig. 1B). Desde la periostina estaba manchada principalmente en el estroma, se utilizó el análisis de histograma para analizar los cambios en los resultados de IHC entre estroma peritumoral periostina y emparejado estroma no tumoral (Fig. 1C). El eje x es la diferencia en las puntuaciones de IHC, que se calculó mediante la puntuación de IHC del estroma peritumoral periostina menos la puntuación de estroma no tumoral emparejados. Las barras rojas indican el número de pacientes que tuvieron una mayor puntuación de IHC en el cáncer en comparación con el estroma no tumoral, mientras que la barra verde indica que los bajos resultados de IHC en el cáncer. La altura de las barras (eje y) es el número de pacientes. La altura suma de barras de color rojo es significativamente mayor que la barra verde, lo que indica que los resultados de IHC entre las células del estroma peritumoral son significativamente mayores que las células del estroma no tumorales correspondientes. La prueba de Wilcoxon orden de rango (emparejado, dos caras) da el valor de p para la significación de esta diferencia (p = 2.75e-12).
Para comparar la expresión periostina en el tumor de próstata y otras enfermedades de enfermedades de la próstata, el TMA de la UCLA, que consisten en 197 núcleos de próstata no tumoral (NT), 140 núcleos de la hiperplasia prostática benigna (HPB), se analizaron 64 núcleos de neoplasia intraepitelial prostática (PIN), y 963 núcleos de Cap. Excepto los núcleos con tejido caída-off, 1233 núcleos se utilizaron en el análisis de tinción del estroma, mientras que 1247 núcleos se utilizaron en el análisis de la tinción de las células epiteliales. La tinción se detectó con periostina bajo fondo en la próstata no tumoral y BPH, y con aumento de la tinción en PIN, mientras que la mayoría de tinción intensa se encontró en CaP (Fig. 2). Chi-cuadrado reveló que tanto periostina tinción estromal y tinción epitelial de BPH de CaP incluyendo la capa de bajo grado (puntuación de Gleason ≤6) diferenciados, con una significativa p-valor de 2.2e-16 y 0.001, respectivamente (Tablas 1 y 2, S1 Estadística Análisis). Periostina epiteliales tinción PIN diferenciada de CaP incluyendo la capa de bajo grado (puntuación de Gleason ≤6) (p = 0,001). Además, la tinción del estroma periostina diferenciado CaP de bajo grado (puntuación de Gleason ≤6) de la tapa de alto grado (puntuación de Gleason ≤6) (p = 1.7e-05) (Tablas Análisis estadístico S1 1 y 2,). Los resultados muestran que la tinción periostina está positivamente correlacionado con la agresividad del cáncer de próstata
.
Las imágenes representativas de la expresión periostina en los tejidos de diferentes enfermedades de la próstata. NT: Paciente emparejado de próstata no tumoral; BPH: hiperplasia prostática benigna, PIN: neoplasias intraepiteliales prostáticas; y CAP:. adenocarcinoma de próstata
Para determinar la correlación de expresión periostina y puntuación de Gleason, se analizaron los nueve TMA utilizando la misma herramienta computacional imagen. Porcentaje de tinción se calculó como el número total de píxeles positivos dividido por el número total de píxeles. Los aumentos de intensidad de tinción total de periostina fueron encontrados en los tumores de próstata con mayor puntuación de Gleason en los tres TMA de la Universidad Johns Hopkins (fig. 1B), los tres TMA de la UCLA (Fig. 3A), y los tres TMA de la UCI (Fig. 3B ). Los resultados muestran que existe una correlación positiva entre la tinción periostina total y la puntuación de Gleason (r = 0,87, p = 0,002) (Fig. 3C).
(A) Los diagramas de caja de la positividad de periostina para los tres TMA de UCLA, parcelas (B) de la caja de la positividad de periostina para los tres TMA de la UCI, (C) la correlación positiva de los cambios veces y puntuación de Gleason usando los nueve TMA. Porcentaje de tinción (positividad) se calculó como el número total de píxeles positivos dividido por el número total de píxeles.
Discusión
En el presente estudio, se determinó el nivel de expresión en periostina los principales tejidos de cáncer de próstata, tejidos no tumorales de próstata, hiperplasia prostática benigna, y neoplasia intraepitelial de próstata. Este es el primer estudio que utilizó una cohorte tales ampliado para analizar la expresión periostina en cáncer de próstata y tratar de determinar la relevancia clínica de elevación periostina con la tapa fenotipo agresivo
.
alta expresión de periostina localizada en cualquiera de los epitelios tumor o peritumoral estroma se observó consistentemente como los informes anteriores [16-19]. Curiosamente, mientras que se observó una fuerte tinción periostina peritumoral en todas las TMA, la tinción periostina en el epitelio del tumor fue detectado solamente en el TMA de la UCLA y la UCI, pero no en el TMA de la Universidad Johns Hopkins. Esto puede haber sido causado por las variaciones en cohortes de pacientes y el pre-procesamiento técnico que incluye la recogida de muestras, la selección patólogo, etc., durante la construcción de la Universidad Johns Hopkins TMA. Según el análisis estadístico, epiteliales y del estroma periostina expresión era capaz de distinguir CaP formar próstata no tumoral, BPH y PIN (Tablas 1 y 2, las figuras 1 y 2, y análisis estadístico S1). Además, se demostró que la tinción periostina total (epitelio y estroma) que se correlaciona con el aumento de la puntuación de Gleason (Fig. 3C). Esto indica la tinción periostina peritumoral estaba altamente asociado con la agresividad CaP.
Otros estudios han sugerido que la expresión periostina se correlaciona con la metástasis del cáncer y el pronóstico sombrío [9, 20, 21]. Li
et al
informó de que la sobre expresión de la periostina se observa con frecuencia en el estroma de carcinoma nasofaríngeo y coincide metástasis en los ganglios linfáticos en comparación con el estroma de la mucosa nasofaríngea normal [16]. La expresión de alto estromal de periostina también se observó que se asocia con una supervivencia más corta de cáncer de próstata [19]. Sin embargo, en particular, la TMA utiliza en este estudio sólo consistirá en los tumores de próstata primarios. Sería de gran utilidad para analizar la expresión periostina en casos de recurrencia gorra que pueden progresar a la metástasis y la muerte en el futuro
.
En conclusión, aunque periostina se incrementó tanto en las células del estroma peritumoral y Cap epitelial, periostina tuvo mayor expresión en el primer tipo celular. Nuestros datos muestran que la expresión periostina es altamente correlacionada con la agresividad del tumor PAC, que apoya nuestro descubrimiento anterior. Los resultados indican que periostina tiene el potencial para ser utilizado como un biomarcador tejido de diagnóstico.
información de apoyo
Análisis estadístico S1. El análisis estadístico de tinción periostina y el estado de la enfermedad de la próstata
doi:. 10.1371 /journal.pone.0121502.s001 gratis (DOCX)