Extracto
proteasa específica de ubiquitina 42 (USP42) es un miembro de las enzimas deubiquitinating (Dubs). Las alteraciones de DUBs están implicados en la patogénesis de una amplia variedad de tumores. Sin embargo, hay pocos estudios sobre la expresión y función biológica de USP42 en el cáncer gástrico (CG). Aquí, los niveles de expresión de USP42 fueron significativamente mayores en los tejidos de GC que en los tejidos no tumorales. USP42 expresión se correlacionó significativamente con el tamaño del tumor, el estadio TNM, la metástasis de los ganglios linfáticos y la supervivencia global de los pacientes con GC. Por otra parte, USP42 silenciar en dos líneas celulares de GC, AGS y MKN-45, la proliferación celular notablemente inhibido, pero estimulado fase de detención G1. Las proteínas que promueven la progresión del ciclo celular (ciclina D1, ciclina E1 y PCNA) se redujeron regulado en las células USP42-suprimida. Por otra parte, la inhibición de USP42 en células GC afectada invasión celular a través de afectar la expresión de metaloproteinasas de la matriz (MMPs) y de transición reguladores (EMT) epitelio-mesénquima. En conclusión, USP42 sobreexpresión podría ser un marcador pronóstico potencial de GC, regular las propiedades de supervivencia e invasivos de GC, y puede representar una diana molecular terapéutica para este tumor
Visto:. Hou K, Zhu Z, Wang Y, Zhang C, Yu S, Zhu Q, et al. (2016) La sobreexpresión y la función biológica de la proteasa ubiquitina-42 específica en el cáncer gástrico. PLoS ONE 11 (3): e0152997. doi: 10.1371 /journal.pone.0152997
Editor: Jung weon Lee, Universidad Nacional de Seúl, República de Corea
Recibido: 29 Diciembre, 2015; Aceptado: 22 Marzo de 2016; Publicado: 31 Marzo 2016
Derechos de Autor © 2016 Hou et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del papel
Financiación:. Este estudio fue apoyado por el Proyecto de Investigación Científica de Shanghai Comisión Municipal de Salud y Planificación Familiar (20124321)
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no hay existen intereses en competencia.
Introducción
el cáncer gástrico (CG) es el quinto cáncer más común [1] y la tercera causa principal de muerte por cáncer [2]. Conocidas en la actualidad los principales factores de riesgo de GC incluyen la infección por Helicobacter pylori (H. pylori), condiciones de vida, la dieta, los factores genéticos e inmunológicos, y enfermedades crónicas del estómago [3]. El pronóstico de los pacientes con GC es generalmente pobre, porque el tumor ha hecho metástasis a menudo y la mayoría de los pacientes son de edad avanzada (edad media es de más de 70 años) en el momento en que se diagnostica. La tasa de supervivencia a 5 años para GC es informado de que menos del 25% [4]. Es de gran importancia clínica para identificar marcadores de diagnóstico y pronóstico sensibles de GC, investigar los mecanismos moleculares del desarrollo GC, y explorar nuevas dianas terapéuticas de esta enfermedad.
proteasa específica de ubiquitina 42 (USP42) es una enzima deubiquitinating (DUB) que se expresa ampliamente en varios tejidos humanos [5]. La ubiquitinación, una modificación post-traduccional reversible, está implicada en múltiples procesos celulares, tales como ciclo celular, reparación del ADN y la apoptosis [6, 7]. aumento de la evidencia ha demostrado que la función alterada DUB está implicada en la patogénesis de una amplia variedad de tumores [8]. La sobreexpresión de USP9X, USP9Y, USP10 y USP25 se reveló en el cáncer de mama por electroforesis en gel de poliacrilamida y la proteómica análisis de dos dimensiones [9]. Algunos estudios han demostrado que la sobreexpresión USP22 promueve la progresión del cáncer y el mal pronóstico de glioma, el cáncer de páncreas, cáncer de cuello uterino y cáncer de pulmón [10-13]. USP42 previamente se ha encontrado para ser reorganizado en la leucemia mieloide aguda [14]. Sin embargo, hasta donde sabemos, ninguna investigación se ha realizado en el patrón de expresión y las funciones biológicas de USP42 en GC.
En el presente estudio, se encontró que los niveles de mRNA en tejidos USP42 GC ser notablemente superior a los niveles en los controles . Un análisis más detallado mostró que las características clínicas nivel de expresión de USP42 se asoció con la supervivencia global de los pacientes con cáncer gástrico. A continuación se aplica la tecnología de interferencia de ARN (RNAi) para reducir la expresión de USP42 en dos líneas de células GC (AGS y MKN-45 células), y se investigó la proliferación, ciclo celular y la capacidad invasiva en ambas líneas celulares. Nuestros datos sugieren que USP42 es un potente oncogen en GC, que nos proporciona un objetivo de futuro para la terapia de GC.
Materiales y Métodos
Las muestras de tejido
Un total de 90 GC pacientes sometidos a cirugía en el Departamento de cirugía general, hospital del Pueblo, Nuevo Distrito de Pudong (Shanghai, china) entre febrero de 2007 y junio de 2009 se inscribieron en este estudio. La edad media de los pacientes fue de 56 años (rango: 34-68 años). A todos los pacientes se les dio su consentimiento informado por escrito. El estudio fue aprobado por el comité de ética independiente de Shanghai Pudong Distrito Hospital Popular (Shanghai, China). muestras de tejido de los tumores se obtuvieron a partir de todos los pacientes de GC. Mientras tanto, 42 emparejados muestras no tumorales localizadas & gt; 3 cm de distancia del tumor fueron recogidos. Todas las muestras quirúrgicas se congelaron en nitrógeno líquido inmediatamente después de la resección quirúrgica, y se almacenaron a -80 ° C hasta la extracción de RNA.
Las líneas celulares
Las líneas celulares derivadas de cáncer gástrico humano, incluyendo AGS, SGC-7901, BGC-823, MKN-28 y MKN-45 se obtuvieron del Instituto de Bioquímica y Biología celular, Academia de Ciencias de china (Shanghai, china). Todas las líneas celulares se mantuvieron en medio RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY, EE.UU.) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y antibióticos a 37 ° C en una atmósfera húmeda con 5% de CO
2
fueron seleccionados por el silenciamiento de la USP42 pequeños ARN de interferencia (siRNA)
siRNA específico para USP42 humana (5'-AUGGCCUCUGGUAUCAAAU-3 '). Una secuencia de scramble siRNA no específica (SINC) se utilizó como control negativo. Los siRNAs fueron transfectadas transitoriamente en AGS o MKN-45 células por medio de lipofactamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Los ensayos se realizaron 48 h después de la transfección.
PCR en tiempo real
El ARN total se extrajo usando el reactivo TRIzol (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. reacción de transcripción inversa se realizó con cebadores hexámeros aleatorios y un kit de transcriptasa inversa Superscript (Invitrogen). El cDNA resultante se utilizó como molde para la PCR en tiempo real a cabo con un kit estándar SYBR Green PCR (Fisher Scientific, Rockford, IL, EE.UU.) en ABI7300 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) termociclador. GAPDH se utilizó como control del nivel de ARN de entrada. Todas las reacciones se llevaron a cabo utilizando los siguientes parámetros de ciclo, 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s, 60 ° C durante 45 s. Para verificar la amplificación específica del producto, los productos se sometieron a análisis de la curva de disociación. La expresión génica se calculó utilizando el método Δ Ct. Todos los datos representan la media de tres repeticiones. Las secuencias de los cebadores específicos fueron las siguientes: USP42 mRNA hacia adelante, 5 'ATGGAAAGCAGGGATGAC-3', y USP42 mRNA-inverso, 5 'ACGCAGATTGGAACAGAG-3'; GAPDH ARNm hacia adelante, 5'-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3 ', y el ARNm de GAPDH inversa, 5'-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'.
Los anticuerpos y Western Blot
Los anticuerpos contra CyclinD1, E-cadherina, β catenina, Snail 1 y GAPDH fueron adquiridos de Señalización celular Tecnología (Danvers, MA, EE.UU.). Los anticuerpos contra USP42, CyclinE1, PCNA, y MMP-9 fueron de Abcam (Cambridge, MA, EE.UU.). Anti-MMP-2 fue de Epitomics (Burlingame, CA, EE.UU.). Rábano picante anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa eran de Beyotime Biotecnología (Shanghai, China).
Las células se lavaron tres veces con PBS y después se lisaron en radioinmunoprecipitación pre-enfriada (RIPA) de tampón de ensayo en hielo durante 10 min. Después de la eliminación de los restos celulares por centrifugación (12.000 g, 10 min), la concentración de proteína de los sobrenadantes se midió por el kit de ensayo de proteínas BCA (Thermo Fisher Scientific). Después de hervir durante 5 min en tampón de muestra, la misma cantidad de proteínas de los diferentes grupos se separaron mediante SDS-PAGE, y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Millipore, Bredford, EE.UU.). Después de bloquear con leche desnatada 5%, las membranas se incubaron con los anticuerpos primarios a 4 ° C durante la noche con agitación, seguido de incubación con los correspondientes anticuerpos secundarios durante 1 h a temperatura ambiente con agitación. A continuación, se detectó la proteína reactiva usando el sistema de quimioluminiscencia ECL (Bio-Rad, Richmond, CA, EE.UU.).
Ensayo de proliferación celular por CCK-8
El ensayo CCK-8 se realizó por métodos estándar en placas de 96 pocillos. Brevemente, 3 × 10
3 células fueron sembradas por pocillo. En el punto de tiempo indicado, se añadió solución de CCK-8 (10 l en 100 pl de medio RPMI-1640) a cada pocillo y se incubó durante 1 h. Absorbancia a 450 nm se detectó usando un lector de microplacas.
En vivo portadores de tumor modelo ratones desnudos fueron aprobados
Los experimentos con animales y se realizó de acuerdo con las directrices de Cuidado de Animales y el empleo Comisión de Shanghai Pudong Distrito hospital Popular (Shanghai, china). Doce ratones Balb /c desnudos de entre 4-5 semanas de edad (SLAC animal, Shanghai, China) se mantuvieron en condiciones libres de patógenos específicos utilizando una rejilla de flujo laminar y tuvieron libre acceso continuo a los alimentos esterilizados en autoclave y agua. Los experimentos se iniciaron después de 1 semana de aclimatación. células AGS (2 × 10
6) se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones desnudos para establecer el modelo de xenoinjerto portador de un tumor. Diez días después de la inyección subcutánea, los ratones se dividieron al azar en dos grupos (n = 6 /grupo) y IV inyectados con USP42 siRNA o SINC formulaciones que contienen dos veces a la semana. El diámetro más corto y más largo del tumor se midieron con calibradores en intervalos de 4 días, y el volumen del tumor (mm
3) se calculó utilizando la siguiente fórmula estándar: (el diámetro más corto)
2 × (el diámetro más largo ) × 0,5. 36 días después de la colocación del tumor, los ratones se sacrificaron por dislocación cervical y se recuperaron los tumores. Se examinaron los pesos húmedos de cada tumor. Durante el procedimiento experimental, todos los ratones se monitorizaron cada día. Sin ratones murieron antes del punto final experimental.
Análisis del ciclo celular
Las células se trataron con tripsina, se lavaron dos veces en PBS y se fijaron durante la noche a 4 ° C en helado de etanol al 70%. Después, las células se lavaron dos veces en PBS, y se incubaron en yoduro de propidio (PI) tampón (5 mg /ml PI y 0,25 mg /ml de RNasa, Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) a temperatura ambiente durante 30 min tinción. Las células fueron analizados utilizando un utilizando una citometría de flujo FACScan (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.). El porcentaje de células en G0 /G1, S y G2 /M fase se determinaron mediante tinción PI.
ensayos de invasión celular
, ensayos Transwell habían sido hechas
Para medir el potencial invasivo de células de las células utilizando una cámara de Boyden Matrigel recubierto (BD Biosciences). Las células se privaron de suero durante la noche-, se recogieron, y se resuspendieron en medio libre de suero. Las células (1 × 10
5) fueron luego fue introducido en la cámara superior. Medio que contiene 10% de FBS se añadió a la cámara inferior. Después de que las células se incubaron a 37 ° C durante 24 horas, las células de la superficie superior de la membrana se eliminaron completamente el uso de puntas de algodón. Las células migrantes unidos a la superficie inferior se fijaron en paraformaldehído al 4% y se tiñeron con 0,5% de cristal violeta. El número de células que migraron en la superficie inferior de la membrana se contó con un microscopio en cinco campos a 100 aumentos.
Análisis de Bioinformática
gástricos cáncer conjuntos de datos fueron descargados de la base de datos de Ómnibus NCBI Gene Expression (identificación de acceso: GSE26253) y Atlas del Genoma del cáncer (TCGA). Para investigar más a fondo los mecanismos biológicos implicados en la patogénesis del cáncer gástrico a través vía USP42, conjunto de genes de enriquecimiento de análisis (GSEA) se realizó utilizando el software a disposición del público desde el Instituto Broad del MIT (http://www.broad.mit.edu/gsea/software /software_index.html) como se ha descrito anteriormente [15]. Para cada conjunto de genes, GSEA define un enriquecimiento Resultado (ES), que refleja la correlación entre el conjunto de genes y la muestra.
El análisis estadístico
análisis de supervivencia de Kaplan-Meier se ha realizado mediante Medcalc ( Mariakerke, Bélgica). El paquete estadístico para Ciencias Sociales (SPSS), versión 17.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL) fue utilizado para el análisis estadístico otra. Los resultados de los experimentos se expresan como media ± desviación estándar. Se utilizó la prueba t de Student para comparar los valores de las muestras de ensayo y de control. Se utilizó la prueba de chi-cuadrado para identificar las diferencias entre las variables categóricas. Estadísticamente se definieron diferencias significativas por tener un
P
. & Lt; 0,05
Resultados
La expresión de USP42 en el cáncer gástrico
Para explorar la expresión de USP42 en GC, se realizó un análisis en tiempo real PCR en GC (n = 90) y muestras de tejidos no cancerosos (n = 42). La expresión relativa de ARNm USP42 en comparación con GAPDH se calcularon utilizando el método Ct △. Claramente, la expresión de USP42 mRNA fue mayor en tejidos de GC que en los tejidos no cancerosos (Fig 1A). A fin de verificar este hallazgo, se volvieron a analizar los datos de microarrays de TCGA conjunto de datos independiente para CG. La figura 1B mostró sobreexpresión evidente de USP42 en los tejidos humanos GC en comparación con los tejidos normales.
A. Los niveles de mRNA de USP42 relativa a la expresión de GAPDH en GC y los tejidos no tumorales se determinaron usando PCR en tiempo real (
P
& lt; 0,0001). B. La expresión de USP42 en GC y tejidos normales basado en TCGA conjunto de datos (
P Hotel & lt; 0,0001). C. El análisis de la supervivencia mostró que los pacientes con tumores de expresión de USP42-superior tienen una supervivencia global menor que aquellos con tumores de expresión de USP42-baja (
P = 0,0141)
. D. Análisis de Supervivencia en GSE26253 conjunto de datos.
Usando el valor medio de 2
-ΔCt (0.550) como un corte entre de bajo nivel y de alto nivel de expresión de ARNm USP42, 90 pacientes eran clasificado en bajas (& lt; 0,550) subgrupos de expresión USP42 y altas (≥0.550). Como se muestra en la Tabla 1, USP42 se asoció significativamente con el tamaño del tumor (
P = 0,0328
), el estadio TNM (
P = 0,0059
) y la metástasis de los ganglios linfáticos (
P
= 0,0184). Sin embargo, no hubo una asociación significativa entre la expresión UP42 y otras características de los pacientes, incluyendo el género y la edad de los pacientes al momento del diagnóstico y la localización del tumor. Kaplan-Meier análisis de supervivencia reveló que el tiempo de supervivencia global fue significativamente menor en los pacientes con expresión de USP42 mayor que en los pacientes con expresión de USP42 inferior (figura 1C, P & lt; 0,05), lo que fue confirmado por el análisis de supervivencia en ArrayExpress conjunto de datos (identificación de acceso : GSE26253, figura 1D) guía empresas
USP42 siRNA suprimido la expresión USP42
la comparación de varias líneas celulares de cáncer gástrico reveló que el nivel de expresión de la proteína USP42 en AGS y MKN-45 células es. mayor que la de SGC-7901, BGC-823 y MKN-28 células (Fig 2A). Por lo tanto, AGS y MKN-45 células fueron elegidos para experimentos posteriores. Para explorar las funciones de USP42 en GC, llamamos a la puerta expresión de USP42 caído en líneas celulares de GC de siRNA transfección. Como se muestra en la figura 2B, siRNA específico para USP42 marcadamente suprimida expresión USP42 en AGS y MKN-45 células con una relación de supresión de 60,4% y 74,4%, respectivamente. A continuación, analizó si la supresión de la expresión de USP42 alteraría la tasa de crecimiento de las células de GC. Como se muestra en la figura 2C, hubo una disminución significativa en la tasa de crecimiento de las células suprimidas-USP42 en comparación con las células transfectadas con SINC.
A. los niveles de proteína se determinaron USP42 en diversas líneas celulares de GC por Western blot y se normalizó a GAPDH. B. USP42 la eficiencia del silenciamiento ARNsi transfección en AGS y MKN-45 células se evaluó mediante Western blot. C. USP42 silenciamiento de siRNA transfección dio lugar a la inhibición del crecimiento como se detecta por CCK-8 en el ensayo de AGS y MKN-45 células. Las células transfectadas con USP42 siRNA o no silenciar siRNA (SINC) durante 48 h, junto con las células no tratadas, se sembraron en un placas de 96 pocillos, y la viabilidad celular se determinó en los puntos de tiempo indicados. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01, ***
P
. & Lt; 0,001 en comparación con SINC
USP42 siRNA suprimió el crecimiento tumoral en ratones desnudos
Para determinar el efecto de USP42 siRNA en la tumorigenicidad in vivo, se inyectó el mismo número de células AGS por vía subcutánea en ratones desnudos y USP42-siRNA era IV inyecta después de la formación de tumores. La tasa de crecimiento del tumor de los ratones inyectados con USP42-siRNA fue significativamente más lenta que la de los ratones inyectados con el control de siRNA (Fig 3A). El volumen y el peso de los tumores USP42-siRNA fue menos de 25% de la de los tumores de control (Figura 3B). Además, en comparación con los tumores de control, USP42 y PCNA se redujo significativamente en los tumores con USP42 siRNA-inyección (Figura 3C).
A. El volumen del tumor se midió después de USP42 siRNA (siRNA) o inyección de control de siRNA (SINC). B. Los ratones fueron sacrificados y los tumores fueron recuperados en 36 días después de la colocación tumor. Se muestran las imágenes (panel superior) y de peso (n = 6, expresaron como media ± desviación estándar, panel inferior) de los tumores recuperados. C. La expresión de USP42 y PCNA en los tumores de los ratones nude se determinó por transferencia de western. *
P Hotel & lt; 0,05, **
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. & Lt; 0,001 en comparación con SINC
inducida por la detención /fase G1 G0 en las células cancerosas suprimidas-USP42
Para averiguar cómo la expresión más alta USP42 afectada la proliferación de células de GC, se realizó un conjunto de genes de enriquecimiento de análisis (GSEA) en TCGA conjunto de datos mediante el análisis de la relación de la expresión de USP42 y los genes en Kyoto enciclopedia de genes y genomas vía del ciclo celular (KEGG). Curiosamente, hemos encontrado que la expresión más alta USP42 se correlacionó positivamente con la vía del ciclo celular en pacientes KEGG GC basados en TCGA conjunto de datos (Figura 4A). A continuación, analizó la distribución del ciclo celular de las células de GC con USP42 caída. La supresión de la expresión de USP42 redujo la población de células en fase S y condujo a la detención de G1 en AGS y MKN-45 células (Figura 4B). Para explorar más a fondo el mecanismo celular que subyace en la proliferación celular inducida por USP42, se evaluaron los niveles de proteína de las proteínas del ciclo celular. USP42 caída redujo significativamente la expresión de la ciclina D1, ciclina E1 y PCNA (Fig 4C). Por lo tanto, estos resultados revelaron que una disminución en el nivel de expresión USP42 inhibido ciclina D1, ciclina E1 y la expresión de PCNA en células de GC, que puede inducir la detención en fase G0 /G1, reducir significativamente el número de células en fase S e inhiben la proliferación celular.
A. GSEA análisis GC en pacientes con mayor expresión USP42 frente expresión USP42 menor basado en TCGA conjuntos de datos. vía del ciclo celular KEGG se asoció con USDP42 de mayor expresión. La puntuación de enriquecimiento (ES, línea verde) refleja la correlación entre la vía del ciclo celular y la muestra. Las barras negras indican genes previamente conocidas asociadas con la vía del ciclo celular. B. USP42 silenciamiento inducido un paro G0 /G1 en las células de GC. histogramas FACS y análisis del ciclo celular de AGS y MKN-5 células. se demostró Cuantificación del porcentaje de células en G0 G1, S, G2 y fase //M. C. Expresión de proteínas clave en el ciclo celular se determinó por transferencia de western. Todos los ensayos se realizaron por triplicado. *
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P Hotel & lt; 0,01, ***
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. & Lt; 0,001 en comparación con SINC
potencial invasivo de las células cancerosas bajo suprimidas-USP42
GSEA también indicó que la expresión de USP42 se correlacionó positivamente con la metástasis (figura 5A). Para verificar estos hallazgos en un ensayo in vitro, se analizó el potencial invasivo de las células USP42 supresión usando un ensayo de invasión de Matrigel in vitro (Figura 5B). Las células USP42-suprimido exhibieron potencial significativamente menos invasiva que las células transfectadas con sinc (
P Hotel & lt; 0,01)., Lo que sugiere que la alta expresión de USP42 mejorada invasión tumoral
A. GSEA análisis GC en pacientes con mayor expresión USP42 frente expresión USP42 menor basado en TCGA conjuntos de datos. vía de metástasis de las células se asoció con USDP42 de mayor expresión. La puntuación de enriquecimiento (ES, línea verde) refleja la correlación entre la vía de la metástasis y la muestra. Las barras negras indican genes previamente conocidas asociadas con la vía metástasis de las células. B. USP42 silenciamiento disminuyó la invasión de células tal como se detecta mediante el ensayo de invasión in vitro. C, D. La expresión de proteínas clave en la metástasis y la EMT se determinó por transferencia de western. *
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. & Lt; 0,001 en comparación con SINC
degradación de la matriz extracelular a través de metaloproteinasas de la matriz (MMPs), es un proceso crítico durante la invasión de células [16]. Como se muestra en la figura 5C, el silenciamiento de USP42 downregulated la expresión de MMP-2 y MMP-9
.
Además, los niveles de proteína de los reguladores de la vía epiteliales-mesenquimal transición (EMT), que están estrechamente relacionados con la metástasis de las células tumorales, se analizaron por Western blot (Fig 5D). La transfección de USP42 siRNA redujo significativamente los niveles de expresión de β-catenina, Twist and Snail 1, mientras que el aumento de la E-cadherina.
Discusión
Varios miembros de la familia DUB se sabe que contribuyen a la carcinogénesis, incluyendo USP1 [17], USP2 [18], USP7 [19, 20] y USP22 [10-12, 21], mientras que otros DUBs están regulados hacia abajo en los cánceres humanos, incluyendo USP10 [22] y BAP1 [23]. Sin embargo, poco se sabe sobre el patrón de expresión y las funciones biológicas de USP42, un DUB para p53 [24] y la histona H2B [25], en los cánceres humanos. En nuestro estudio, hemos demostrado por primera vez que los tejidos GC expresan altos niveles de ARNm USP42 en comparación con los correspondientes tejidos no tumorales. Además, la expresión USP42 se asoció con el tamaño del tumor, el estadio TNM, la metástasis de los ganglios linfáticos y la supervivencia global de los pacientes GC (figura 1). Nuestros resultados proporcionan información valiosa para la predicción de la evolución clínica de los pacientes con GC.
Nos presume que USP42 puede actuar como un factor oncogénico durante el desarrollo GC. A continuación se aplica la tecnología del RNAi, que es ampliamente utilizado en la investigación del cáncer o la terapia del cáncer, para derribar la expresión de USP42 en dos líneas de células GC (Figura 2B). La reducción de la expresión de USP42 redujo eficazmente la proliferación de células de cáncer in vitro (Fig 2C) y
in vivo
(Fig 3). GSEA datos revelaron la asociación de la vía del ciclo celular con la expresión de USP42 (figura 4A). A continuación se aplica un análisis del ciclo celular mediante FACS (Fig 4B) y análisis de la expresión de la ciclina D1, ciclina E y PCNA por Western blot (Fig 4C). Nuestros datos revelaron que USP42 siRNA tuvo un efecto inhibitorio sobre el crecimiento de células de GC a través de la inducción de la detención G0 /G1.
GC es uno de los cánceres más comunes y continuó siendo un problema grave de salud pública en el mundo. Alta incidencia de metástasis sigue siendo una de las principales causas de la baja supervivencia de pacientes con cáncer gástrico [4]. GSEA en TCGA conjunto de datos reveló la asociación de la vía de la metástasis con la expresión de USP42 en GC (figura 5A). Además, ensayo de invasión in vitro indicó que USP42 desmontables disminuyó la capacidad invasiva de las líneas celulares inmortalizadas GC (Fig 5B). Por lo tanto, nuestros datos indican que la expresión elevada de USP42 en GC puede promover la metástasis del tumor y se asocia con el resultado clínico de los pacientes GC. A continuación, tratamos de explorar los mecanismos subyacentes mediante la evaluación de la expresión de las MMP y los reguladores de la EMT en las células cancerosas suprimidas-USP42. MMP-2 [26] y MMP-9 [27] se sabe que median la degradación de la matriz extracelular y están relacionados con la metástasis de los ganglios linfáticos de GC. EMT está implicada en la patogénesis compleja de tumores [28]. Aquí, el silenciamiento de USP42 indujo la expresión del factor principal de EMT (E-cadherina), pero disminuyó la expresión de MMPs y tres inductores conocidos de EMT (β-catenina, Twist and Snail 1) (Fig 5C y 5D). Estos descubrimientos sugieren que el papel de la USP42 como un gen promotor de la invasión a través de afectar la expresión de las MMP y los reguladores de la EMT, aunque se necesitan más estudios para aclarar los mecanismos exactos.
En resumen, el presente estudio demostró que la expresión era USP42 aumentado significativamente en los tejidos GC. La expresión USP42 aumento podría ser importante para la progresión tumoral y la metástasis de GC, y puede servir como un marcador pronóstico de esta enfermedad. Nuestros hallazgos in vitro mostraron que el silenciamiento de USP42 inhibe la proliferación celular a través de la inducción de la detención G0 /G1 y suprime la invasión de células a través de las MMP y los reguladores de la EMT. Por lo tanto, USP42 puede ser una diana molecular terapéutica para la GC.
Reconocimientos
Este estudio fue apoyado por el Proyecto de Investigación Científica de Shanghai Comisión Municipal de Salud y Planificación Familiar (20124321).