Extracto
ARN polimerasa II transcribe los extremos de los cromosomas eucarióticos físicos lineales en una variedad de moléculas de ARN no codificantes que incluyen largas telomérica repetir que contienen ARN (TERRA). Desde el descubrimiento TERRA, se han logrado avances en la caracterización de TERRA biogénesis y regulación; por el contrario sus funciones asociadas siendo difícil de alcanzar. La mayor parte de las funciones biológicas hasta ahora propuestos para TERRA se basan en efecto en
in vitro
experimentos llevados a cabo utilizando oligonucleótidos de ARN corto TERRA-como. En particular, se ha sugerido que TERRA inhibe la actividad de la telomerasa. Hemos explotado dos sistemas celulares alternativos para probar si TERRA y o influencia de los telómeros de la transcripción de la telomerasa mediada por elongación /de los telómeros en las células de cáncer humano. En las células que carecen de los dos ADN metiltransferasas DNMT1 y DNMT3b, TERRA transcripción y por el estado de equilibrio los niveles se incrementan en gran medida, mientras que la telomerasa es capaz de alargar los telómeros normalmente. Del mismo modo, la telomerasa puede alargar de manera eficiente los telómeros inducibles transgénicas cuya transcripción ha sido aumentada experimentalmente. Nuestros datos cuestionan la actual hipótesis de que las funciones de TERRA como un inhibidor general de la telomerasa y sugieren que la longitud de los telómeros homeostasis se mantiene independientemente de TERRA y la transcripción de los telómeros
Visto:. Farnung BO, Brun CM, Arora R, Lorenzi LE, Azzalin CM (2012) La telomerasa alarga de manera eficiente con alta Transcripción de los telómeros en las células del cáncer humano. PLoS ONE 7 (4): e35714. doi: 10.1371 /journal.pone.0035714
Editor: Arthur J. Lustig, Universidad de Tulane Centro de Ciencias de la Salud, Estados Unidos de América
Recibido: 23 de febrero, 2012; Aceptado: March 20, 2012; Publicado: 27 Abril 2012
Derechos de Autor © 2012 Farnung et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por el Consejo Europeo de Investigación (BFTERRA), la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza (3100A0-120090 y PP00P3-123356) y la Fundación Cariplo (2008-2507). CMB recibió una beca de Boehringer Ingelheim Fonds. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los extremos físicos de los cromosomas eucarióticos lineales se transcribe en una variedad de especies de ARN no codificante (ncRNA) que constituye el 'transcriptoma telomérica'. Entre estas especies, el largo NcRNA TERRA (ARN telomérico repetir que contienen) fue descubierto por primera vez en células de mamíferos y sucesivamente se describe en eucariotas no mamíferos, incluyendo el pez cebra,
Arabidopsis thaliana
, la levadura en ciernes
Saccharomyces cerevisiae
y de la levadura de fisión
Schizosaccharomyces pombe
[1] - [7]. moléculas de TERRA se transcriben a partir de las regiones inmediatamente anterior a los telómeros -la subtelomeres- hacia el final de los cromosomas principalmente por la ADN-polimerasa dependiente de ARN II (RNAPII), que utiliza la cadena telomérica C-rico como plantilla. Por lo tanto, las moléculas de TERRA individuales comprenden un tramo subtelomérico y G-ricos repeticiones teloméricas (5'-UUAGGG-3 'en los mamíferos). TERRA permanece asociado a los telómeros lo que sugiere post-transcripcional que TERRA es un componente constitutivo de la heterocromatina telomérica [1], [3], [4], [6]. Otras especies de ARN transcritos a partir de los extremos del cromosoma comprenden ARIA, un ARN telomérico rica en C hasta el momento identificado sólo en levaduras y plantas de fisión, y dos transcripciones subteloméricas complementarios desprovistos de repeticiones teloméricas detectables con nombre ARRET, identificados en ciernes y de fisión levaduras, y αARRET, identificado sólo en la levadura de fisión [1], [4], [5], [7].
promotores subteloméricas que impulsan la transcripción de TERRA se han identificado en las células humanas y comprenden islas CpG dinucleótidos ricos en compuestos de tramos de 29 y 37 repeticiones en tándem pb (29-37 repeticiones). 29-37 repeticiones son precedidos por unidades repetidas en tándem 61 pb que son prescindible para la actividad del promotor y de la función hasta ahora no caracterizada [8], [9]. dinucleótidos CpG dentro de los promotores de TERRA están fuertemente metilados en el cáncer diferentes y células primarias [9]. En las células HCT116 carcinoma colorrectal humanos eliminados por los dos ADN metiltransferasa enzimas DNMT1 y células (DKO) Dnmt3b, TERRA metilación del promotor está completamente abolida y RNAPII unión a los promotores de TERRA y estado de los niveles de TERRA se aumentan marcadamente [9]. Por lo tanto, la actividad concertada de DNMT1 y 3b restringe promotor TERRA actividad transcripcional, al menos en células HCT116. Del mismo modo, la disminución de la metilación CpG subtelomérico se acompaña de un aumento de los niveles celulares de TERRA en células derivadas de pacientes humanos afectados por inmunodeficiencia, inestabilidad región centromérica, anomalías faciales (ICF), un síndrome recesivo se deriva de mutaciones germinales en el gen DNMT3b [10]. Curiosamente, la abundancia TERRA se reduce en las células de ratón deficientes para DNMT1 y DNMT3a /b, aunque se vea comprometida la metilación global del subtelomeres, lo que sugiere mecanismos de regulación TERRA especies específicas mediadas por DNMTs [6], [11]. De hecho, los promotores de TERRA todavía no se han caracterizado en células de ratón y sigue siendo posible que los promotores de TERRA murinos no están regulados a través de la metilación CpG
.
Mientras TERRA biogénesis y regulación han sido ampliamente estudiados, la falta de herramientas experimentales reproducibles alterar TERRA cuentas niveles celulares para el conocimiento escaso de funciones asociadas-TERRA. La mayoría de los papeles putativos hasta ahora atribuidas a TERRA se dedujeron de
in vitro
experimentos en los que se emplean oligonucleótidos de ARN cortas TERRA-como. Tal
in vitro
experimentos han sugerido que TERRA podría regular la longitud del telómero homeostasis, la replicación de los telómeros y la condensación del ADN telomérico [6], [12] - [14]. En particular, los oligonucleótidos TERRA-como inhibieron fuertemente la actividad de la telomerasa en telomérica protocolo de amplificación de repetición (TRAP) y ensayos directos telomerasa [6], [14]. Por lo tanto, se asume generalmente que TERRA actúa como un inhibidor general de alargamiento de los telómeros de la telomerasa mediada y algunos
in vivo
evidencias indirectas aparentemente apoyan esta suposición. A los telómeros levadura en ciernes forzado artificialmente para transcribir acortamiento experimentó, mientras que la longitud de los telómeros restantes no fue afectado [15]. mutantes de levadura con actividad exonucleasa RNA Rat1p comprometida tienen cantidades más altas de moléculas Terra y telómeros más cortos en comparación con homólogos de tipo salvaje [16]. Por último, los telómeros son más cortos en las células establecidas de pacientes ICF que en las células de donantes sanos [10]. Sin embargo, no ha sido probado directamente si el acortamiento de los telómeros observada en estos diferentes sistemas celulares verdaderamente deriva de inhibición de la telomerasa. Por lo tanto, la importancia biológica real de la capacidad de los oligonucleótidos TERRA-como para inhibir la actividad de la telomerasa
in vitro
aún permanece en ser evaluados.
Con el fin de determinar si TERRA y la transcripción de los telómeros afectan a la actividad de la telomerasa
in vivo
, hemos explotado dos sistemas celulares humanos alternativas donde se ve aumentada TERRA transcripción. Se demuestra que las células infectadas con DKO retrovirus que expresan la subunidad catalítica de la telomerasa se alargan sus telómeros tan eficientemente como las células parentales con actividades DNMT intactas. Por ello, la actividad bioquímica de la telomerasa parece no estar afectada en las mismas células. También se presenta el desarrollo de un sistema celular, donde la transcripción de exclusivas de los telómeros transcripcionalmente inducibles '(titels) se puede controlar a voluntad. inducción de la transcripción de titels no afecta a su longitud homeostático, ni impide la telomerasa mediada por re-alargamiento en la acortamiento inducido por inhibidores de la telomerasa. En total, nuestros resultados desafían la noción comúnmente aceptada de que TERRA es un inhibidor celular de la telomerasa y ruegan por la exploración de las funciones ejercidas por alternativas TERRA y la transcripción de los telómeros. Además, nuestros resultados implican que el acortamiento de los telómeros observado en los sistemas donde TERRA fue elevado de forma aberrante [10], [15], [16] probablemente se deriva de la integridad de los telómeros comprometida en lugar de la inhibición de la telomerasa.
Resultados y Discusión
estado de los niveles de TERRA se mantienen independientemente de la longitud de los telómeros en las células cancerosas humanas
El papel propuesto para TERRA en la inhibición de la actividad de la telomerasa ha sugerido un modelo en el que los telómeros largos acumulan o producen más TERRA, evitando de ese modo para ampliar aún más la telomerasa ellos [6], [14], [17]. pruebas correlativas usando células no isogénicas líneas de mamíferos de diferentes orígenes parece apoyar esta hipótesis [6]. Por el contrario, el trabajo reciente de levadura en ciernes ha demostrado que la inducción experimental sobre-alargamiento o acortamiento de los telómeros no altera los niveles de ocupación y de TERRA RNAPII en los extremos de los cromosomas [18]. Por lo tanto, hemos creado para probar si existe una correlación entre los niveles de Terra y longitud de los telómeros en las células humanas isogénicas con telómeros de diferentes longitudes.
establemente infectaron células HeLa de cáncer de cuello uterino con retrovirus que expresan la subunidad catalítica de la telomerasa humana (hTERT ). Como control, se infectaron las mismas células con el vector vacío (EV) retrovirus o con retrovirus que expresan hTERT C-terminal-fusionado a una etiqueta de epítopo de hemaglutinina de la gripe (hTERT-HA). hTERT-AS presenta actividad catalítica normal de
in vitro
pero no para alargar los telómeros
in vivo
, probablemente debido a problemas de reclutamiento de los telómeros [19]. De forma estable se seleccionaron las poblaciones infectadas y se mantuvieron en cultivo durante varias duplicaciones de la población (PDS). los fragmentos de restricción de los telómeros (TRF) análisis del ADN genómico indicó que en el momento de los experimentos se infección hTERT realizado habían dado lugar a un alargamiento sustancial de los telómeros a granel: TRFs fueron comprendido entre 2 y 5 kb en células EV-infectado y entre 5 y más de 15 kb en células hTERT-infectadas (Figura 1A). Como se preveía, la expresión de hTERT-HA no alteró la longitud del telómero, aunque se expresó en niveles comparables a hTERT (Figura 1 A y E). A continuación, el ADN genómico digerido con
Msp I o
con su metilación CpG isoesquizómero sensibles
Hpa II
y se hibridan a sondas marcadas radiactivamente que corresponden a las 29-37 repeticiones se encuentran dentro de los promotores de TERRA. En consonancia con lo que hemos informado anteriormente [9], encontramos que 29-37 repeticiones están metiladas en gran medida en las células HeLa. El patrón de restricción detectados con sondas 29-37 de repetición no se alteró en las células hTERT-expresión en comparación con ev y control de las células hTERT-HA, lo que indica que el alargamiento de los telómeros no afecta al estado de metilación de promotores TERRA (Figura 1B). El análisis de transferencia Northern del ARN total usando sondas teloméricas no reveló ningún cambio sustancial en los niveles celulares de TERRA totales en células hTERT-infectados en comparación con los controles EV-o-infectados con HA hTERT (Figura 1C). Un cambio de tamaño de las moléculas de TERRA hacia pesos moleculares más altos fue evidente en las células con telómeros alargados, lo que sugiere que al menos en estas líneas celulares longitud de los telómeros puede influir en la longitud de las moléculas de TERRA (Figura 1C). En consonancia con el análisis de transferencia de Northern, mediciones cuantitativas PCR en tiempo real (qRT-PCR) de moléculas de TERRA transcritos de 10q cromosomas de armas, 15q y XpYp revelaron ningún cambio estadísticamente significativo en los niveles de estado estacionario de TERRA sobre los telómeros alargamiento (Figura 1D). También hemos realizado experimentos análogos en los fibroblastos pulmonares humanos primarios (HLF) y, en cuanto a las células HeLa, el alargamiento de los telómeros no alteró significativamente el estado de metilación de los promotores y los niveles de TERRA TERRA celulares (Figura S1).
(A) El análisis TRF de células HeLa infectadas con el vector vacío (EV), hTERT o retrovirus hTERT-HA. ADN fue digerido con
Rsa I y
Hinf
enzimas de restricción I y se hibridaron con sondas teloméricas. (B) El mismo ADN que en A se digirió con
Hpa II
(sensible a la metilación) o
Msp
nucleasas (metilación minúsculas) de restricción y se hibridó con una sonda de detección del 29-37 pb repeticiones de los promotores de TERRA. (C) ARN nuclear se hibridó usando sondas teloméricas para detectar total de TERRA y sucesivamente con 18S rRNA sondas para el control de carga. Los números en la parte inferior son las relaciones entre TERRA y 18S expresan como señal de veces de incremento sobre muestras ev-infectados. Los pesos moleculares están a la izquierda en kilobases. (D) QRT-PCR análisis de los niveles de estado estacionario de las transcripciones de TERRA procedentes de 10q, 15q y los extremos del cromosoma Xp /yp. Las barras son promedios de tres experimentos independientes expresados como veces de incremento sobre muestras ev-infectados. Las barras de error y los números son desviaciones estándar y los valores de p, respectivamente. (E) Análisis de transferencia Western de las células infectadas usando anti-hTERT (para detectar todas las moléculas de hTERT), anti-HA (para detectar hTERT-HA) anticuerpos y anti-PCNA (control de carga).
en un enfoque complementario, cultivamos células HeLa en presencia del inhibidor de la telomerasa BIBR1532 [20] durante aproximadamente 19 semanas. tratamiento BIBR1532 condujo a un acortamiento considerable de los telómeros a granel: longitud de los telómeros se compone principalmente entre 2 y 5 kb en las células de control no tratadas entre 1 y 3 kb en las células tratadas con BIBR1532 (Figura 2A). Las células tratadas divididas de manera similar a las células no tratadas que indican que los telómeros eran el tiempo suficiente para sostener el crecimiento normal de las células (datos no presentados). acortamiento de los telómeros no indujo ningún cambio sustancial en el estado de metilación de 29-37 repeticiones ni en los niveles totales o cromosómicas específicas de TERRA en estado estacionario (Figura 2B-D). En conjunto, estos experimentos indican que, como ha demostrado recientemente para la levadura en ciernes [18], alteraciones de la longitud de los telómeros no afectan TERRA metilación del promotor o los niveles celulares de TERRA en células humanas. Concluimos que TERRA transcripción no está regulada por la longitud del telómero, al menos en los tipos celulares que hemos analizado.
(A-D) las células HeLa se trataron con el inhibidor de la telomerasa BIBR1532 (+ BIBR) durante 19 semanas o se deja sin tratar (-BIBR). longitud de los telómeros, TERRA metilación del promotor y los niveles de estado estacionario específicas TERRA totales o de cromosomas se analizaron como en la Figura 1. El RNA total se utilizó para todos los experimentos. Para el análisis de transferencia Northern del total TERRA (C) beta-actina (ACT) se utilizó como un control de normalización. Los pesos moleculares están a la izquierda en kilobases.
células metiltransferasa deficientes de ADN tienen la actividad telomerasa normales
Los niveles elevados de TERRA presentes en las células DKO ellos un sistema celular adecuado para probar la hacen efectos ejercidos por TERRA sobre la actividad de la telomerasa. Nos establemente infectados DKO y HCT116 células parentales (PAR) con hTERT o ev retrovirus y poblaciones estables seleccionados. Posiblemente debido a la diferente estado transcripcional de las dos líneas celulares, encontramos repetidamente que la sobre-expresado niveles de proteína hTERT eran más de dos veces mayor en el par que en las células DKO (Figura 3A). Como se muestra por QRT-PCR y transferencia de northern, los niveles de estado estacionario de moléculas de TERRA transcritas de 10q y 15q 61-29-37 extremos de los cromosomas repetir que contienen se incrementaron dramáticamente en las células DKO (Figuras 3B y S2A) y, en consonancia con el los resultados descritos anteriormente para las células HeLa y HLF, hTERT expresión estable no alteraron las cantidades de Terra en cualquiera de las líneas de células (Figura 3B). Hemos preparado extractos de proteínas y se analizaron la actividad de telomerasa mediante ensayos TRAP cuantitativos. No hay diferencia significativa en la actividad de la telomerasa se midió en el par ev-infectadas y células DKO, mientras que la infección hTERT condujo a un aumento sustancial de la actividad de la telomerasa en ambas líneas celulares (Figura 3C y D). TRAP actividad fue ligeramente mayor en las células infectadas par de hTERT que en las células infectadas DKO hTERT y atribuyen esta diferencia a las menores cantidades de proteína total hTERT expresadas en la línea celular DNMT deficientes (Figura 3 A, C y D). ARN aislado a partir de extractos TRAP contenía 10q y 15q moléculas TERRA, aunque una gran parte de ellos (aproximadamente 90 y 80% para el par y las células DKO, respectivamente) se mantuvo en los gránulos de las células después de la extracción (Figura 3E), probablemente debido a que la mayoría de TERRA es la cromatina asociada [1], [3], [6]. Aún así, teniendo en cuenta que 10q y 15q moléculas TERRA son ~ 300 veces más abundante en DKO que en las células de par (Figura 3B), se estima que los extractos de TRAP DKO contenían ~600 veces más moléculas de TERRA que los extractos de paridad. En conclusión, nos informan de que la actividad TRAP es similar en las células con diferentes niveles de TERRA drásticamente. Esto está en marcado contraste con los resultados obtenidos
in vitro
utilizando oligonucleótidos cortos TERRA-como [6], [14]. Creemos que los oligonucleótidos de ARN corto emplean
in vitro
no se comportan, moléculas largas de TERRA como naturales, posiblemente debido a su uso en altas concentraciones, no fisiológicas.
(A) Western blot análisis de hTERT-expresión en HCT116 los padres (par) o DNMT1 y 3b células infectadas doble KO (DKO). Los números en la parte inferior son las relaciones entre hTERT y PCNA (control de carga) señales, expresados como veces de incremento respecto a las células parentales hTERT infectados. (B) QRT-PCR análisis de los niveles de estado estacionario de las transcripciones de TERRA procedentes de 10q y 15q del cromosoma fines expresados como veces de incremento respecto a las células infectadas par ev. Bares y barras de error son los promedios y las desviaciones estándar de tres experimentos independientes. (C) Análisis de los productos de amplificación TRAP de las líneas de células indicadas. Tres cantidades diferentes de proteínas totales se utilizaron para cada línea celular y para controlar la especificidad de una muestra se pre-trata con RNasa A. cebadores de control de la amplificación de un control interno (IC) fueron incluidos en todas las reacciones. (D) La cuantificación de la actividad de la telomerasa en las muestras indicadas usando ensayos TRAP basados en QRT-PCR. Bares y barras de error son los promedios y las desviaciones estándar de tres experimentos independientes, después de la normalización a través de muestras de células infectadas por los padres ev. Los números indican los valores de p (*: P & lt; 0,01). cuantificación de 10q y 15q transcripciones de Terra en los extractos de TRAP (EXT) o en gránulos de las células después de la extracción (PLT) (E) QRT-PCR-based. Las cantidades relativas de TERRA se expresan como fracciones de moléculas totales de TERRA de pellets más extracto. Bares y barras de error son los promedios y las desviaciones estándar de tres experimentos independientes.
Eficiente elongación de los telómeros de la telomerasa en las células mediada por DKO
Para supervisar cómo la telomerasa alarga los telómeros en las células de par y nos DKO ADN genómico preparado a partir de células infectadas 2, 5 y 9 días después de la infección. a continuación, se realizó un análisis TRF utilizando sondas de detección de las secuencias del cromosoma 10q subtelomeric o sondas que detectan la repetición telomérica telómeros a granel. Aunque 10q y granel TRFs fueron sustancialmente más corto en DKO que en las células parentales, ambos fueron sometidos a alargamiento progresivo a lo largo del transcurso de tiempo elegido en células infectadas con hTERT, pero no en células de control EV (Figura 4A). De este modo, la telomerasa es capaz de alargar los telómeros en las células, tanto par y DKO incluyendo 10q telómeros, que son en gran medida en las células transcriben DKO (Figuras 3B y S2A). Para obtener más datos cuantitativos, hemos hecho uso del análisis de la longitud del telómero sola (ESTELA), un enfoque basado en PCR que permite medir con precisión la longitud de los telómeros individuales [21]. STELA de 15q telómeros confirmó que la longitud media de los telómeros en las células DKO es menor que en las células parentales (5,9 kb y 3,8 kb en par y células DKO, respectivamente; Figura 4B y C). Sin embargo, como ya se ha sugerido por análisis TRF, 15q telómeros se alargaron eficientemente en ambas líneas celulares infectadas con retrovirus de hTERT (Figura 4D). Por análisis cuantitativo de los productos de estela y normalización a través de la población tiempo de duplicación (PD) calculado para las dos líneas celulares (17,7 h y 29,6 h para hTERT par y las células DKO de hTERT, respectivamente) se estimó que la tasa de elongación de la telomerasa fueron aproximadamente ~204 pb /PD en las células pAR y ~186 pb /PD en las células DKO (Figura 4C y D). Esta ligera diferencia en la tasa de elongación de la telomerasa no se correlaciona con la enorme aumento de los niveles de 15q TERRA en las células DKO (Figura 3B) y es probable que se atribuye a los diferentes niveles de la proteína hTERT detectados en el par infectadas y células DKO (Figura 3A). Tinción con azul tripán y clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) el análisis de las células de yoduro manchados de Anexina V y propidio no revelaron ninguna diferencia importante en la fracción de células muertas o apoptosis en las diferentes líneas celulares ni tampoco muestran cambios sustanciales en la distribución de las células entre las diferentes fases del ciclo celular (Figura S2B). Esto indica que el mayor tiempo de PD medido para células DKO es probablemente atribuible a un tiempo de ciclo más largo de estas células, una noción corroborada por el retraso evidente en la progresión del ciclo celular observada para las células DKO sincronizados liberados de un bloque de nocodazol (Figura S3A).
(A) análisis de TRF par y células infectadas DKO con el vector vacío (EV) o retrovirus hTERT. El ADN genómico se recogió 2, 5 y 9 días (d) después de la infección, se digirió con
Rsa I y
transferido a una membrana de nylon. La misma membrana se hibridó con una sonda de primera detección de 10q TRFs y sucesivamente con una sonda de detección de los telómeros totales. (B) STELA de 15q longitud de los telómeros usando el mismo ADN que en pesos moleculares A. marcadores son a la izquierda en kilobases. la representación gráfica (C) Caja de 15q telómero longitudes. Las longitudes medias de los telómeros en kilobases y el número de los telómeros totales analizados (n) se indican para cada muestra. (D) 15q tasa de elongación de los telómeros expresan como duración media de los telómeros en diferentes duplicaciones de la población. Tenga en cuenta que para las células de par, se utilizaron sólo tres puntos de tiempo porque no hay diferencia estadísticamente significativa en la duración media de los telómeros se midió entre el día 5 y el día 9.
Normal alargamiento de los telómeros en las células hTERT DKO infectado no soporta la noción de que las funciones de TERRA como un inhibidor de la telomerasa
in vivo
. Aún así, hemos considerado la posibilidad de que las transcripciones de TERRA en células DKO no son capaces de inhibir la telomerasa ya sea porque no localizar adecuadamente a los telómeros o porque son drásticamente reguladas durante la fase S, cuando la telomerasa está actuando [17], [22] . Se combinaron inmunofluorescencia indirecta con ARN de fluorescencia
In situ
hibridación (SI /ARN-FISH) para detectar simultáneamente el factor de TRF2 telomérica y moléculas de TERRA. DKO células contenían más y más brillante focos TERRA que las células parentales y las infecciones de hTERT no alteró el patrón general de TERRA hibridación. Aproximadamente el 20 y 30% de TRF2 focos co-localizada con TERRA focos en células de par y DKO, respectivamente (Figura S2C y D), más probable es que reflejan el hecho de que el aumento de los niveles de TERRA en células DKO facilitaron la detección de TERRA focos. Por otro lado, la fracción de TERRA focos co-localización con telómeros fue similar en ambos fondos celulares, lo que indica que la capacidad intrínseca de TERRA permanezca asociado a telomérica heterocromatina no requiere actividades DNMT intactos (Figura S2C y D). Es importante destacar que la expresión de hTERT no alteró las tasas de co-localización en cualquiera de las líneas de células. Por lo tanto, la fracción de TERRA asociado a los telómeros es similar en par y las células DKO, y el alargamiento de los telómeros no afecta notablemente TERRA localización. A continuación, las células bloqueados par y DKO en la fase G2 /M y los liberó de forma sincrónica en el ciclo celular durante un tiempo suficiente para progresar a través de la fase S (Figura S3 A). Preparamos el ARN total en diferentes puntos temporales y dot-blot hibridizada a TERRA y sondas de actina. TERRA niveles se mantuvieron estables a lo largo de todo el curso del tiempo en ambas líneas celulares (Figura S3B y C). En conjunto, estas observaciones ponen de manifiesto que la telomerasa mediada por el alargamiento de los telómeros no se vea afectada sustancialmente en las células DKO, donde las tasas de transcripción TERRA y estado de los niveles se incrementan dramáticamente [9]. Esta falta de inhibición robusta no se deriva de mislocalization de TERRA o de su regulación a la baja durante la fase S. Esto es así en línea con nuestras observaciones de que la actividad de la telomerasa no se ve afectada en las mismas líneas celulares.
Generación de líneas celulares de cáncer humano que llevan los telómeros transcripcionalmente inducibles
eliminación DNMT1 /3b conduce a cambios globales de la transcripción en DKO células [23]. Para obtener un sistema celular en el que la transcripción de los telómeros únicos puede ser alterado, hemos generado líneas celulares estables que llevan los telómeros transgénicos que puede ser transcrito en una manera inducible ( 'telómeros transcripcionalmente inducibles'; titels). Se combinaron el telómero siembra fenómeno con la expresión génica inducible tecnología Tet-ON [24] - [26] y desarrollado un vector de la siembra de los telómeros que comprende un casete de resistencia a higromicina y un doxiciclina (DOX) promotor de CMV mínimo inducible colocado aguas arriba de una (TTAGGG ) n array telomérica (Figura 5A). Una secuencia única ~1.6 kb denominado «subtelomere transcripcionalmente inducible '(tiSUBTEL) separa la secuencia telomérica a partir del promotor inducible (Figura 5A). El plásmido se linealizó mediante siembra
Apa
I digestión con el fin de exponer el tracto telomérica en su extremo 3 'y se transfectó en una línea celular que expresa el represor-Tet derivado de células HeLa (T-Rex-HeLa). Se seleccionaron clones resistentes a higromicina independientes y probados para la siembra por título por Southern blot. El ADN genómico fue digerido con
Xho I
el fin de liberar TITEL TRFs y se hibridó con sondas radiomarcadas correspondientes a las secuencias tiSUBTEL (SBP en la Figura 5A). Dos clones (CL12 y CL17) mostraron el patrón de hibridación manchas típico esperado para titels recién sembrados (Figura 5B) y se eligieron para una caracterización adicional. En ambos clones, Titel TRF estaban compuestos en su mayoría entre 3 y 6 kb. Debido
Xho
cortes I de aproximadamente 2,4 kb aguas arriba de la primera repetición telomérica en el plásmido de siembra (Figura 5A), titels extensiones teloméricas se estabilizaron a aproximadamente 0,6 a 3,4 kb, un intervalo de tamaño comparable a la de los telómeros a granel en los padres y en las células clonales (Figura S4A). Además, confirmó TITEL siembra en los clones 12 y 17 utilizando enfoques experimentales adicionales. Nos establemente infectados ambas líneas celulares clonales con retrovirus que expresan hTERT y confirmamos que ambos titels y telómeros naturales se alargaron fácilmente tras la infección hTERT (Figuras 5B y S4A). STELA con oligonucleótidos correspondientes a las secuencias producidas tiSUBTEL productos de amplificación hibridan con la PAS y sondas teloméricas sólo cuando utilizamos el ADN genómico a partir de células CL12 y CL17, pero no de las células parentales (Figura S4B). FISH de ADN de los cromosomas en metafase preparados a partir de células CL12 y CL17 utilizando plásmidos de siembra marcados con fluorescencia carente de repeticiones teloméricas reveló que titels recién sembrados se integraron en uno y dos extremos de los cromosomas en el clon 17 y en el clon 12 células, respectivamente (Figura 5C). Finalmente la hibridación, dot blot de ADN genómico digerido con la exonucleasa BAL31 reveló una desaparición progresiva de las señales de hibridación TITEL con el tiempo (Figura S4C).
(A) Esquema del vector TITEL siembra. ICMV: promotor CMV inducible; SBF y SBR: oligonucleótidos utilizados en los experimentos de RT-PCR; PAS: sonda utilizada en TRF, estela y experimentos de Northern Blot. (B) Análisis por título TRF de ADN genómico preparado a partir del clon 12 (CL12), el clon 17 (CL17) y las células parentales (PAR) infectadas con el retrovirus hTERT-expresión o retrovirus de control de ev. ADN se hibridó con sondas de PAS. pesos moleculares de marcadores están a la izquierda en kilobases. (C) metafases parciales de CL12 y CL17 hibridan
In situ
para detectar titels (puntas de flecha). (D) Análisis de transferencia de Northern de ARN total de CL12 y CL17 tratadas durante 24 h con combinaciones de doxiciclina (DOX) y tricostatina A (TSA) o no se tratan. sondas de PAS se utilizaron para detectar tiTERRA. Las mismas membranas fueron despojados y re-probaron para detectar la transcripción de beta-actina (ACT) para el control de la carga. análisis (E) QRT-PCR de tiTERRA constantes los niveles en las líneas celulares indicadas tratados con diferentes combinaciones de DOX y TSA o no se tratan. Para cada línea celular, los valores se expresan como veces de incremento sobre las muestras no tratadas. Bares y barras de error son los promedios y las desviaciones estándar de 3 a 7 experimentos. P valores de las muestras correspondientes se indican con los números o por los asteriscos (*: p & lt; 0,01; **: P & lt; 0,001) guía empresas
inducción de la transcripción de titels
Para probar si. titels respondió a la inducción de la transcripción, cultivamos células CL12 y CL17 en presencia o ausencia de doxiciclina (DOX) durante 24 horas. Se recogieron el ARN total y se sometieron a análisis de transferencia Northern utilizando sondas de PAS (Figura 5A). tratamiento DOX condujo a la aparición de especies de ARN, denominado como 'TERRA transcriptionally inducible' (tiTERRA), comprendido en longitud entre aproximadamente 0,5 y 6 kb (Figura 5D). Debido a que la secuencia de promotor inducible se coloca aproximadamente 1,6 kb aguas arriba de la secuencia telomérica, concluimos que la transcripción TITEL puede proceder a través de la mayor parte del tracto telomérica. a continuación, se realizó el análisis por qRT-PCR de ARN de transcripción inversa con hexámeros aleatorios y PCR amplificando el ADNc obtenido usando SBF y los oligonucleótidos de SBR (Figura 5A). Como era de esperar, no se detectó tiTERRA en células parentales, confirmando la especificidad del enfoque de RT-PCR (Figura 5E). Aunque en niveles bajos, transcripciones tiTERRA ya se detectaron en ambos clones no inducidos, revelando una actividad transcripcional basal a partir del promotor CMV inducible en ausencia de inducción (Figura 5E). cuantificaciones absolutas de moléculas tiTERRA indicaron que, en clones no inducidos, tiTERRA se mantuvo a niveles comparables a los de las moléculas endógenas de TERRA transcritos de 10q extremos de los cromosomas (Figura S5a y B). Esto indica que tiTERRA se mantiene a niveles fisiológicos en ambas líneas celulares clonales. En consonancia con los resultados de transferencia de Northern, el tratamiento DOX indujo un aumento de 10 a 20 veces en los niveles tiTERRA en ambos clones (Figuras 5E y S5B). moléculas TiTERRA también fueron detectados en experimentos de PCR realizadas con cDNA a transcripción inversa utilizando oligonucleótidos C-ricos (TELČ) complementarias al tramo telomérica dentro de las moléculas de TERRA (Figura S5a y C). Por lo tanto, al igual que con TERRA natural, transcripciones tiTERRA individuales contienen tanto secuencias teloméricas y subteloméricas.
TERRA expresión es epigenetically regulado y el inhibidor de la histona deacetilasa tricostatina A (TSA) promueve la acumulación de transcripciones de TERRA en células de cáncer humano [27] . Se han tratado las células CL12 y CL17 con TSA en presencia o ausencia de DOX y cuantificamos tiTERRA de QRT-PCR.