Extracto
Antecedentes
El cáncer de páncreas (PDAC) se caracteriza por una abundante tejido fibroso rico en tenascina-C (TNC), una gran ECM glicoproteína sintetizada principalmente por las células estrelladas pancreáticas (PSC ). En los tejidos pancreáticos humanos, la expresión TNC aumenta en la progresión de las lesiones precursoras de bajo grado a cáncer invasivo. Objetivo de este estudio fue la caracterización funcional de los efectos de la CNC sobre las propiedades relevantes biológicas de las células de cáncer de páncreas.
Métodos
proliferación, los ensayos de migración y adhesión se realizaron en líneas celulares de cáncer de páncreas tratados con TNC o crecido en una matriz rica en TNC. transfectantes estables que expresan el
gran variante de empalme TNC se generaron para probar los efectos de la endógena TNC. señalización de integrina TNC dependiente fue investigado por inmunotransferencia, inmunofluorescencia y la inhibición farmacológica.
Resultados
Endógeno TNC promovió el crecimiento de células de cáncer de páncreas y la migración. Una matriz TNC ricos también mejoró la migración, así como la adhesión a la superficie sin recubrimiento crecimiento de líneas de células pobremente diferenciados. Por el contrario, la adhesión a la fibronectina se redujo significativamente en presencia de TNC. Los efectos de la CNC sobre la adhesión celular fueron acompañados de cambios en el estado de activación de paxillin y Akt.
Conclusión
TNC afecta a la proliferación, la migración y la adhesión de las líneas celulares de cáncer de páncreas pobremente diferenciados y por lo tanto podría desempeñar un papel en la difusión de PDAC y metástasis
in vivo
Visto:. Parón I, S Berchtold, Vörös J, M Shamarla, Erkan M, Höfler H, et al. (2011) La tenascina-C aumenta el crecimiento de células de cáncer pancreático y la motilidad y afecta a la adhesión celular a través de la activación de la integrina Camino. PLoS ONE 6 (6): e21684. doi: 10.1371 /journal.pone.0021684
Editor: Cara Gottardi, Northwestern University, Estados Unidos de América
Recibido: 12 Diciembre, 2010; Aceptado: June 8, 2011; Publicado: 29 Junio 2011
Derechos de Autor © 2011 Parón et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por el (Grant número: 108038) Deutsche Krebshilfe. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
pancreático adenocarcinoma ductal (PDAC) representa el 85-90% de todas las neoplasias pancreáticas. En el año 2010 se estimaron 43.140 personas en los EE.UU. a ser diagnosticados con cáncer de páncreas y 36.800 a morir de esta enfermedad letal, haciendo PDAC la cuarta causa más común de mortalidad relacionada con el tumor, a pesar de una incidencia de sólo el 3% del total de casos [1 ]. Las tasas de supervivencia PDAC mejorado sólo marginalmente en los últimos 30 años y los pacientes PDAC todavía tienen un muy mal pronóstico, con una supervivencia global a 5 años por debajo del 5% y una tasa de supervivencia media que oscila entre los 2 meses en los pacientes con enfermedad metastásica a 8 meses en pacientes con enfermedad no metastásica en el momento del diagnóstico [2]. PDAC resultados no cambiaron mucho en los últimos años, principalmente debido a un diagnóstico tardío. PDAC puede ser localizada o regional de la enfermedad es principalmente asintomática y herramientas para una detección temprana siguen desaparecidos. Una vez diagnosticado, el cáncer de páncreas con frecuencia es refractario a cualquier tratamiento de quimioterapia y radioterapia, y muchos ensayos clínicos no han demostrado una mejora significativa en la supervivencia global en la última década [3]. Por lo tanto, es necesaria una mejor comprensión de los mecanismos implicados en el desarrollo del PDAC, mantenimiento y difusión de desarrollar nuevas terapias dirigidas para el tratamiento de esta enfermedad hoy en día sigue siendo fatal.
Un rasgo característico del PDAC es el llamado " desmoplásico de reacción ", una abundante tejido fibroso que rodea las células cancerosas y se compone principalmente de los vasos sanguíneos y las células del estroma de propagación en un andamio de la matriz extracelular (ECM). El desarrollo de la reacción desmoplásico se debe principalmente a las células estrelladas pancreáticas (PSCs). PSCs son células estromales que, después de la conversión de un reposo en un fenotipo de miofibroblastos-como activo, secretan proteínas ECM y enzimas degradan la matriz, estableciendo así un ambiente que promueve fuertemente la progresión del cáncer y, al mismo tiempo, impone una barrera para la administración de fármacos [ ,,,0],4] - [7].
la tenascina-C (TNC) es una glicoproteína grande ECM compuesto por seis monómeros unidos en sus extremos N-terminales con enlaces disulfuro para formar una kDa hexámero 1080-1500. Cada monómero consta de diferentes motivos estructurales dispuestos en un orden lineal, incluyendo entre 8 y 15 de fibronectina tipo III (FN-III) -como repeticiones [8], [9]. El corte y empalme alternativo de las repeticiones FN-III-como es capaz de modular la función biológica de TNC mediante la modificación de su interacción con otras proteínas ECM, como la fibronectina (FN), o con receptores de superficie celular, como las integrinas o anexina II, y confiriendo a veces los roles opuestos a TNC en la propagación de células, la adhesión y la proliferación [10], [11].
TNC se expresa principalmente durante el desarrollo embrionario. En los adultos, TNC tiene un patrón limitado de expresión (en la membrana basal de la piel, en los conductos de las glándulas salivales, en la mucosa de colon y en las paredes de los vasos de diferentes órganos), pero los niveles de proteína aumentar de manera espectacular en virtud de diversos fisiológica y condiciones patológicas, tales como la remodelación tisular, la neovascularización y la inflamación [12], [13]. Por otra parte, la mayoría de los tumores sólidos expresan altos niveles de TNC. TNC es capaz de influir en el crecimiento del cáncer al afectar la adhesión celular y la motilidad de una manera que puede promover la invasión y metástasis [14] y al influir en la expresión celular de los genes supresores de tumor, oncogenes y genes implicados en el mantenimiento de la estabilidad del genoma [15]. En el páncreas normal, TNC se expresa en la pared muscular de los vasos sanguíneos y en el tejido del estroma alrededor de los conductos interlobulares. TNC expresión está regulado en la pancreatitis aguda y crónica [16], y el aumento de la progresión de lesiones de bajo grado precursoras (neoplasia intraepitelial de páncreas, PanIN) a PDAC [17]. En PDAC TNC se expresa exclusivamente en el estroma alrededor de las glándulas neoplásicas [16], [17]. Sobre regulación de las ETN en la progresión del cáncer parece implicar específicamente el
gran variante de empalme
, como el mayor transcripción TNC, que corresponde a la forma no empalmada del TNC, se encuentran en el cáncer de páncreas y en la pancreatitis crónica, pero no en el páncreas normal [17]. PSC han demostrado ser la principal fuente de TNC
in vivo, mientras que las células
PDAC no mostraron ninguna expresión de TNC o bien mediante inmunohistoquímica o inmunotransferencia. Sin embargo, se encontraron niveles bajos de ARNm TNC en líneas celulares de cáncer de páncreas en tiempo real PCR cuantitativa [17].
En este estudio, hemos realizado un extenso análisis de los efectos de la exógena CNC sobre las funciones celulares de cáncer de páncreas y se investigó el efecto de la sobreexpresión endógena TNC en la línea celular de cáncer de páncreas PANC-1. Nuestros resultados apuntan a un papel principal del TNC en la regulación de las interacciones entre las células epiteliales y ECM en la progresión del cáncer de páncreas.
Resultados
Efectos de TNC exógeno sobre el crecimiento de células de cáncer pancreático
al principio, se ensayó si TNC añadió al medio de cultivo a diferentes concentraciones podría afectar la viabilidad celular. se observó células Un aumento en el número de viable Capan-1, ASPC-1 y SU.86.86 (hasta 25%) a una concentración de TNC 0,01-0,1 g /ml, tal como se mide con el ensayo MTT después de 72 horas de crecimiento en medio libre de suero (Fig. 1A). Crecimiento de AsPC-1 y Capan-1 se inhibió a la concentración más alta TNC (10 g /ml, 41 y 34% de disminución, respectivamente). TNC tenía un efecto inhibidor sobre la viabilidad de la PaCa-2 líneas de células MIA PANC-1 y (Fig. 1A). Desde TNC ejerce su función como una proteína ECM, las células fueron cultivadas en una matriz rica en TNC. Cuando se sembraron en placas recubiertas con TNC y crecido hasta 72 horas en medio libre de suero, PANC-1 y MIA PaCa-2 mostró un aumento de 44% y 27% en la viabilidad, respectivamente, mientras que el crecimiento de Capan-1 y AsPC- 1 disminuyó (23% y 45%, respectivamente) (Fig. 1B).
Las células (a) se cultivaron durante 72 horas en medio libre de suero que contienen diferentes concentraciones de TNC (0,01, 0,1, 1 y 10 mg /ml). (B) Las células se cultivaron durante 72 horas en medio libre de suero sobre las placas recubiertas TNC (1 g /cm
2). El crecimiento se determinó con el ensayo MTT. Los datos se calculan como la media +/- s.e.m. de tres experimentos y se expresan como porcentaje en comparación con los controles no tratados (° p & lt; 0,05, * p & lt; 0,01, ** p & lt; 0,001, estudiantes prueba de la t de dos colas) guía empresas
modula exógena TNC. la motilidad de líneas celulares de cáncer de páncreas
con el fin de probar el efecto de TNC sobre la migración de las líneas celulares de cáncer de páncreas, cicatrización de la herida se realizaron ensayos de mantener las células en medio libre de suero con el fin de minimizar la proliferación celular. TNC no tuvo efecto sobre el cierre de la herida cuando se añade al medio de crecimiento (Fig. 2A). Cuando se cultiva en una matriz rica en TNC, las células de cáncer de páncreas cerró la herida de una manera dependiente de la dosis, pero cada línea celular mostraron una respuesta bastante individuo a diferentes concentraciones de TNC. En detalle, la migración de células aumentó hasta 1,7 y 1,1 veces en la SU.86.86 y líneas celulares PANC-1, respectivamente, alcanzando significación estadística a una concentración TNC de 0,5 mg /cm2 de SU.86.86 células y de 0,1 g /cm2 en las células PANC-1. Por otro lado, el cierre de la herida disminuyó significativamente (hasta 0,8 veces) en células Capan-1 con concentraciones TNC de 0,5 y 2,5 g /cm2 (Fig. 2B). Una concentración de 2,5 mg TNC /cm2 tuvo efectos tóxicos sobre las células PANC-1, y la curación de la herida ensayo no pudo realizarse bajo esta condición.
Las células (A) se sembraron en placas sin recubrir y después de 24 horas la monocapa se raspó con una punta de pipeta de 10 l. Las células fueron incubadas en medio sin suero o en medio con la adición de TNC a diferentes concentraciones (0,2 g /ml, 1 mg /ml y 5 mg /ml) hasta 48 horas. (B) Las células se sembraron en placas de 24 pocillos recubiertas con tres concentraciones diferentes de TNC (0,1 g /cm
2, 0,5 g /cm
2 y 2,5 g /cm
2) o en placas sin recubrir y después de 24 horas de la monocapa se raspó con una punta de pipeta de 10 l. Las células fueron incubadas en medio sin suero hasta 48 horas. La migración de las células en las áreas heridas se evaluó células de recuento migrado manualmente y por el software TScratch [36] y un total de 2-8 campos fueron contados por grupo en cada experimento. Los datos se calculan como la media +/- s.e.m. y se expresa como factor de cambio en comparación con las células no tratadas (° p & lt; 0,05, * p & lt; 0,01, ** p & lt; 0,001, estudiantes de dos colas la prueba t) guía empresas
Efectos de la endógena TNC. sobre la viabilidad celular y la migración
para dar más apoyo a los efectos promotores del TNC observado en el crecimiento de células de cáncer de páncreas y de la motilidad en el procedimiento de revestimiento, se utilizaron células PANC-1 para generar transfectantes estables que expresan el
grande variante de empalme
TNC. Desde TNC fisiológicamente actúa como una proteína extracelular, los clones positivos se seleccionaron adicionalmente sobre la base de su capacidad para secretar TNC en el medio de cultivo. Como se muestra en la figura 3A, los niveles de expresión de secretada TNC eran muy diferentes entre los clones positivos. Diferentes niveles de expresión reflejados en algunas de las actividades biológicas de TNC, tales como su capacidad para afectar a la viabilidad celular. De hecho, el número de células viables, tal como se mide con el método MTT después de 24, 48 y 72 horas de crecimiento en medio completo, fue mayor en los clones TNC-positivas en comparación tanto con la no transfectadas y para la maqueta transfectadas PANC-1 las células (Fig. 3B y C). Se observó el efecto más fuerte (en comparación con las células no transfectadas) en el clon T2, que también mostró los más altos niveles de expresión de secretada TNC (Fig. 3A y B). En detalle, en comparación con las células no transfectadas, las células PANC-T2 mostró un aumento en la viabilidad celular de 2,06 veces +/- 0,01 después de 24 horas, de 2,49 veces +/- 0,04 después de 48 horas y de 3,88 +/- 0,09 después de 72 horas. En PANC-T24 el incremento fue de 1,21 +/- 0,01 veces después de 24 horas y de 1,14 +/- 0,02 veces después de 48 horas, y en PANC-T27 de 1,43 +/- 0,02 veces después de 24 horas, de 1,32 -fold +/- 0,03 después de 48 horas y 1,08 +/- 0,05 veces mayor a las 72 horas. Las tasas de viabilidad celular de las células Panc-1 que sobreexpresan TNC comparación con las células falsamente transfectadas fueron 55% superiores a las 24 horas, 68% superior a las 48 horas y 99% más altos a las 72 horas (Fig. 3C).
células PANC-1 fueron transfectadas establemente con un vector que dirige la expresión de
grande
TNC (PANC-T2, PANC-T24 y T27 células PANC-) y con el vector vacío (PANC-C21, C23 y PANC- células PANC-C27). (A) La inmunotransferencia de medio de cultivo de células precipitado de las células PANC-1 transfectadas se cultivan hasta 80% de confluencia. Para asegurarse de que un número comparable de células transfectadas fue la fuente de secretada TNC, la expresión de GAPDH en extractos de células enteras fue probado. células PANC-T2 muestran los niveles más altos de secretada TNC, mientras que los niveles más bajos se observan en PANC-T24 y T27 PANC-. Los clones de control en la comparación no muestran ninguna secreción de TNC. (B) Las células se cultivaron en medio completo. El crecimiento se determinó con el ensayo de MTT en diferentes puntos de tiempo (24, 48 y 72 horas). Los datos se calculan como la media +/- s.e.m. de tres experimentos y se expresan como porcentaje en comparación con las células PANC-1 (° p & lt; 0,05, * p & lt; 0,01, ** p & lt; 0,001, prueba de la t Los estudiantes de dos colas). La tasa de proliferación es significativamente mayor para PANC-T2 en todos los puntos de tiempo (p & lt; 0,001), para PANC-T24 a las 24 horas (p & lt; 0,001) y a las 48 horas (p = 0,022) y para PANC-T27 a 24 (p & lt ; 0,001) y 48 horas (p = 0,009). (C) La proliferación de todas las-1 PANC clones positivos (PT) en comparación con las células transfectadas de forma simulada (PC) es significativamente mayor para cada punto de la prueba del tiempo (24 horas: p = 0,004, 48 horas: p = 0,012, 72 horas : p = 0,026) (se sembraron D) transfectadas las células PANC-1, después de 24 horas se cambió el medio con medio que contiene 0,1% de FBS y, después de la incubación durante la noche, la monocapa se raspó con una punta de pipeta 10 l. Los datos se calculan como se describe en B. En comparación con la no transfectadas PANC-1 en las células, la migración es significativamente más rápido para PANC-T2 (p & lt; 0,001 en ambos puntos temporales) y para PANC-T27 (p = 0,042 a las 24 horas; p = 0,009 a las 48 horas). (E) Todos juntos, los PANC-1 clones positivos (PT) migran significativamente más rápido en comparación con las células transfectadas de forma simulada (PC) en ambos puntos temporales (p & lt; 0,001) guía empresas
La migración celular en el. por otra parte no se vio influenciada por los niveles de expresión de secretada TNC. células PANC-T2, PANC-T24 y T27 PANC-transfectadas estables cerraron la herida más rápido que las células transfectadas no transfectadas y simulacros. Cuando se compara con la no transfectadas PANC-1 en las células, este efecto fue significativo a las 24 horas (1,52 veces +/- 0,09) y a las 48 horas (1,46 veces +/- 0,08) para PANC-T2 y en 24 (1.66- doblar +/- 0,13) y 48 horas (1,46-plegado +/- 0,08) para PANC-T27 (Fig. 3D). Todos los clones positivos juntos tuvieron una mayor tasa de migración en comparación con las transfectadas falsamente clones (62% a las 24 horas y 43% a las 48 horas, Fig. 3E).
exógena TNC estimula la adhesión de células en placas no revestidas y reduce la propagación de células de FN
a medida que la adhesión celular, junto con la migración y la invasión es un paso crítico que participan en la propagación del cáncer y la metástasis, se procedió a investigar la adhesión de células de cáncer de páncreas en CNC. Desde TNC sobreexpresión se correlaciona con una pobre diferenciación tumoral
in vivo
[16], nos hemos centrado nuestro estudio sobre las líneas de células poco diferenciadas PANC-1 y SU.86.86 [18], [19]. recubrimiento TNC mejora fuertemente la adherencia de las dos líneas celulares (PANC-1: 7,0 veces, p & lt; 0,001; SU.86.86: 4,6 veces, p & lt; 0,001). estimados por cristal espectroscopia violeta absorbancia de células unidas (Fig 4A, panel izquierdo). En el contexto de tejidos, células interactúan con TNC en combinación con otras proteínas de ECM. Entre estos, FN a menudo se co-expresaron con TNC [20]. Por lo tanto, con el fin de probar si TNC modula la adhesión celular en presencia de FN, PANC-1 y las células se sembraron SU.86.86 sobre un sustrato mixto de FN y TNC. presencia TNC determina una disminución significativa en la unión de las dos líneas celulares a FN en 3 horas después de la siembra (PANC-1: 1,6 veces, p & lt; 0,001; SU.86.86: 1,2 veces, p = 0,003). (Fig 4A, izquierda panel). Para probar si este efecto podría ser debido al sustrato competencia entre las dos proteínas cuando se usan juntos para recubrir la superficie de plástico, la eficiencia de unión de sustrato de la matriz de material compuesto fue investigado por ELISA. La eficacia de la unión de FN o TNC por sí sola no se vio afectada cuando las placas se recubrieron con ambas proteínas simultáneamente, como se muestra en la figura 4B y C. La viabilidad celular también no se vio afectada significativamente cuando las células fueron cultivadas en placas recubiertas FN /TNC comparación con FN recubierto placas (ensayo de MTT, los datos no mostrados). Tomados en conjunto, estos resultados muestran que TNC interfiere con la adhesión celular en FN, pero tiene un efecto opuesto en las placas no recubiertas.
Las células (A) se colocaron en placas en medio que contiene 1% de FBS, se incubaron durante 3 horas y fijo . Para la inhibición farmacológica, las células se incubaron con AZD0530 2 M durante 15 min antes de la siembra. Panel izquierdo: TNC mejora la adhesión celular en comparación con placas sin recubrir y disminuye la unión de células a FN. Panel derecho: Cuando se trata con AZD0530, las células muestran una adhesión reducida en comparación con las células no tratadas en todas las condiciones ensayadas. Los datos se calculan como la media +/- SEM de dos experimentos y se expresaron como factor de cambio en comparación con el control (Ctrl) (panel izquierdo) o a las células no tratadas (panel derecho) (* p & lt; 0,01, ** p & lt; 0,001, ANOVA de prueba). (B, C) placas de 96 pocillos se recubrieron con TNC (0,5 g /cm
2), FN (1 g /cm
2) o ambas proteínas simultáneamente (FN /TNC) y ELISA se realizó como se describe en Métodos. La actividad de unión al sustrato de TNC o FN no se ve afectada cuando ambas proteínas areused para recubrir la superficie de plástico. (D, E) células SU.86.86 (E) PANC-1 (D) y se cultivaron durante 45 minutos antes de que se realizó la extracción de proteína total. La fosforilación de paxilina en Tyr 118 (pPAX) y de Akt en Ser 473 (pAKT), y los niveles totales de paxillin y expresión de Akt se investigó por inmunotransferencia utilizando anticuerpos específicos y después de tratar las células con el inhibidor de la quinasa Src AZD0530. detección de GAPDH se utilizó para confirmar la igualdad de proteínas de carga.
TNC y FN influencia paxillin y la activación de Akt por fosforilación
Con el fin de investigar las vías involucradas en el comportamiento de adherencia de las células de cáncer de páncreas en TNC y /o en sustratos FN, el nivel de fosforilación de paxilina en Tyr 118, un paso temprano en la señalización de integrina mediada, así como el nivel de fosforilación de Akt en Ser 473 y los niveles de expresión de vinculina, una proteína implicada en la conexión de adherencias focales del citoesqueleto de actina, se analizaron por inmunotransferencia.
Como se muestra en la Fig. 4, TNC y FN tenían un efecto potenciador leve en el estado de fosforilación de las líneas aktin PANC-1 y células SU.86.86 durante los primeros pasos de la adhesión de células (45 min). Este efecto no fue evidente ya después de 24 horas y en puntos de tiempo posteriores (no se muestra). En cuanto a la adhesión celular, TNC parecía tener efectos opuestos dependiendo del dispositivo experimental. De hecho fosfo-Akt fue ligeramente hasta reguladas al comparar placas recubiertas TNC
vs
placas sin recubrir y hacia abajo-regulada al comparar placas recubiertas FN /TNC
vs placas recubiertas
FN. La misma tendencia se podía ver en la medición de la activación paxilina, mientras que los niveles vinculina no se vieron afectados, ya sea por TNC o FN (no mostrado). El inhibidor de quinasa Src AZD0530 (Saracatinib), que inhibe la fosforilación de paxilina y Akt, se utilizó para confirmar que los efectos observados en la adhesión celular eran en realidad mediadas por moléculas de la vía de señalización de integrina. En los experimentos de adhesión, después de la incubación con AZD0530 se observó una inhibición de la paxilina y la fosforilación de Akt (Fig. 4D y E). Este efecto fue acompañado por una disminución significativa en la adhesión PANC-1 y SU.86.86 en todas las condiciones ensayadas (PANC-1 FN: p = 0,004; todas las demás condiciones p & lt; 0,001), con la excepción de la adhesión a las placas no revestidas SU.86.86 (Fig. 4A, panel derecho).
efecto
a continuación, CNC sobre el montaje de adhesión focal fue investigado a nivel morfológico por inmunofluorescencia. Como se muestra en la Fig. 5, las células Panc-1 cultivadas por 45 min sobre una superficie TNC recubiertos mostraron un patrón de co-localización más difusa de vinculina y fosfo-paxillin que la observada en la superficie no revestida, donde las adhesiones focales aparecieron más alargada y se concentra principalmente en la periferia de la propagación de células. En una matriz FN, sólo se observaron diferencias notables en poco fosfo-paxillin y distribución vinculina entre las células adheridas sobre FN FN y /TNC. En ambos casos, fosfo-paxillin áreas /vinculina estaban restringidos principalmente a la periferia de las células que se adhieren, con sitios de adhesión más largos y más dispersos en presencia de TNC.
PANC-1 en las células se dejaron adherirse a sin recubrir, TNC, FN FN y /TNC cubreobjetos recubiertos durante 45 minutos, se lavaron suavemente, fijadas y teñidas utilizando anticuerpos secundarios fluorescentes. placas de adhesión focal se evidenciaron por la co-localización de vinculina (verde) y fosfo-paxillin (pPAX, rojo). Los núcleos celulares se counterstained con Hoechst 33342.
Discusión
PDAC se caracteriza por un aumento importante en el tejido conectivo que rodea a las células cancerosas. Los principales contribuyentes a esta reacción llamada "desmoplásico" son PSCs, una subpoblación de células pancreáticas que, una vez activados por factores de crecimiento, citocinas y el estrés oxidativo, secretan cantidades excesivas de proteínas ECM y mediadores solubles que se establecen a-diafonía con células tumorales. Varias líneas de evidencia sugieren que el microambiente desmoplásico juega un papel clave en la regulación del crecimiento rápido y la invasión del cáncer de páncreas, la angiogénesis y la resistencia a la quimioterapia [4] - [7], [21] - [26].
TNC es una proteína grande ECM estromal que está regulado en la progresión de PanINs a PDAC [17] y su expresión se ha correlacionado con un fenotipo pobremente diferenciado de PDAC [16]. Además, la expresión TNC se ha correlacionado con un mal pronóstico de los pacientes afectados por cáncer de pulmón y el cerebro [21], [27] - [29], mientras que no hay correlación entre los niveles de expresión y el pronóstico se ha encontrado en el cáncer de páncreas [16]. TNC es capaz de interactuar con varias proteínas de la MEC (tales como FN, perlecan, aggrecan, versican y brevican) y muchos receptores de superficie celular (incluyendo integrinas α2β1, α7β1, α9β1, αvβ3, anexina II, EGFR y sindecano 4), modulando celular señalización e influir en la migración celular y la proliferación [11]. Además, en el organismo adulto TNC tiene propiedades adhesivas y anti-adhesivas, y se expresa durante las condiciones fisiológicas y patológicas en los que interviene la migración celular y la remodelación de tejidos, como en el proceso de curación de la herida o durante la tumorigénesis y metástasis [11]. Sin embargo, los mecanismos moleculares por los cuales TNC influye en la progresión del cáncer aún no se conocen. Para abordar esta cuestión en el PDAC, hemos investigado cómo afecta a las propiedades relevantes TNC biológicas de las células de cáncer de páncreas.
Los resultados presentados aquí demuestran que TNC es capaz de apoyar y promover el crecimiento y la migración de las líneas celulares de cáncer de páncreas pobremente diferenciados . Otra observación interesante es que solo TNC muestra un efecto pro-adhesivo en células de cáncer de páncreas, en contraste con el efecto anti-adhesivo reportado en la mayoría de las otras líneas celulares estudiadas, como glioblastoma y carcinoma de mama células [22]. Este efecto pro-adhesivo en células de cáncer pancreático se asocia con un aumento en el estado de fosforilación de Akt y en menor medida de paxillin. Esto sugiere un mecanismo que implica la adhesión mediada por integrina a TNC, en analogía con lo que se ha demostrado previamente en células de condrosarcoma, donde un aumento de la Ser 473 fosforilación de Akt en las células que se adhieren a TNC promueve la supervivencia celular en medio de suero privado [23]. Sin embargo, los efectos de TNC sobre la viabilidad celular de cáncer de páncreas y la proliferación eran bastante heterogénea y se observó una inhibición del crecimiento en algunas líneas celulares, sobre todo en las más altas concentraciones de TNC. Este resultado no es sorprendente, debido a la heterogeneidad de las líneas celulares PDAC en cuanto a su origen y la diferenciación [19], [20] y a los efectos pleiotrópicos y, a menudo opuestos de TNC en función del contexto celular y tisular.
in vitro
estudios a menudo reportan resultados contradictorios, con TNC estimulante [24] y la inhibición [25] el crecimiento celular y promover tanto la adhesión celular y el desprendimiento [26]. Por otra parte, las respuestas adhesivas y migratorias opuestos a TNC en la misma línea celular de glioma en función del receptor de integrina involucrados [30] y diferentes respuestas adhesivas mediadas por el mismo integrina en diferentes líneas celulares [31] se han descrito. Curiosamente, en una superficie recubierta FN TNC disminuye la adhesión de células de cáncer de páncreas y fosfo-paxillin y los niveles de fosfo-Akt. Este efecto sobre una matriz mixta TNC-FN, que se asemeja mucho al
in vivo
situación, en la TNC y FN interactúan en el ECM asociado a un tumor, ya se ha descrito para el glioblastoma y las células de carcinoma de mama [20], [22]. En estos tumores, TNC reduce la propagación de células en FN FN interferir con la unión a la integrina co-receptor sindecano-4, comprometiendo así el contacto y la formación de fibras de estrés focal [29]. Dado que la eficiencia de unión al sustrato de FN no fue afectada por TNC en nuestro estudio, tal como se evaluó por ELISA, un mecanismo similar de la competencia por los receptores de la superficie celular puede ser la hipótesis en células PDAC. Debido a este efecto, la activación de paxilina y quinasa de adhesión focal (FAK) y, en consecuencia, de fibras de estrés de actina y la formación de contacto focal, así como de células completo propagación se inhibe, con una mejora general en la proliferación celular [22]. Débil unión a FN generalmente se correlaciona con un mayor proliferación en muchas células tumorales [32]. En nuestro juego experimental, no se observó un aumento en la proliferación celular de células PANC-1 y SU.86.86 sobre un sustrato mixto de FN y TNC en comparación con FN sola, probablemente debido a los efectos de la CNC sobre la adhesión se limitaron a tiempos cortos (3 horas) y el conjunto de adhesión focal en las células adherentes-FN fue sólo ligeramente alterados por TNC, como se observa por inmunofluorescencia. Estas observaciones sugieren que los mecanismos por los que TNC influye en la adhesión y la proliferación de células cancerosas en un sustrato de FN no son general, pero estrictamente dependiente de la línea celular específica y en el montaje experimental utilizado.
Se sabe que la capacidad de las células cancerosas a interactuar con las proteínas de la matriz extracelular, como FN, es crucial para la invasión celular y la migración. Nuestros datos muestran que el número de células de cáncer pancreático que se adhieren a FN en tiempos cortos se reduce en presencia de TNC pero todavía es alta y en el rango del número de células que se adhieren a TNC solo. por lo tanto, TNC puede actuar como un modulador de los eventos tempranos migratorias, que incluyen detección de sustrato y la adherencia, y puede promover la migración de células mediante la reducción de la adhesividad celular a FN, induciendo así una interacción más dinámica entre la célula tumoral y los componentes de la MEC. Se necesita más trabajo para comprender cómo TNC afecta el proceso de adhesión durante la interacción de células de cáncer de páncreas con FN, que los receptores celulares están involucrados y que las vías intracelulares adicionales pueden ser alterados
.
En conclusión, los datos actuales muestran que afecta TNC el crecimiento, la movilidad y la adhesión de células de cáncer pancreático, siendo divergente estos efectos dependiendo de la diferenciación celular y en la composición de la matriz extracelular. Las estrategias terapéuticas dirigidas a alterar la matriz TNC ricos podrían ser, por tanto, útiles en el contraste de la extraordinaria agresividad del PDAC.
Materiales y Métodos
Mantenimiento de líneas celulares
Las células pancreáticas de líneas Capan-1, ASPC-1, PANC-1, MIA Paca-2 y SU.86.86 [18], [19], [33] (American Type Culture Collection, ATCC) se mantuvieron en medio DMEM rico en glucosa que contiene 10% suero fetal bovino (FBS), y 1 X: penicilina /estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA) a 37 ° C en una atmósfera humidificada con 5% de CO2. Las células se ensayaron para contaminación por micoplasma mediante reacción en cadena de la polimerasa (TAKARA, Shiga, Japón).
Generación de clones estables que sobreexpresan TNC
El plásmido TNC-L, en la que el gran isoforma, unspliced de TNC se clona en un vector pCMV-script (Stratagene, la Jolla, CA, EE.UU.), fue un generoso regalo del Dr. JH Pringle (Departamento de Estudios & amp cáncer; Medicina Molecular, Universidad de Leicester de la medicina, Reino Unido) [34 ]. La secuencia de codificación L-TNC completa fue verificada por secuenciación. A continuación, el plásmido TNC-L y el vector vacío pCMV-Script se linealizaron primero con la enzima de restricción Apa-L1 y luego transfectados en las células de cáncer de PANC-1 utilizando el reactivo FuGENE transfección (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de 2 días, las células se sometieron a selección con G418 a una concentración de 1 mg /ml. Después de 2 semanas en presencia de G418, se observaron y se amplificaron varias colonias. Las colonias se revisaron para la presencia del gen transfectado mediante un ensayo de PCR utilizando los cebadores 5-CGTGTACGGTGGGAGGTCTA-3 (en pCMV-Script) y 5-GACACCAGGTTCTCCAGCTC-3 (en el gen TNC). La capacidad de PCR positivos colonias para secretar TNC se confirmó por transferencia de Western. Los clones positivos PANC-T2, PANC-T24, T27 PANC-y el de control (modelo de transfectadas) clones PANC-C21, PANC-C23, PANC-C27 fueron seleccionados para los siguientes experimentos.
TNC y revestimiento FN
TNC se adquirieron de Millipore (Millipore GmbH, Schwalbach, Alemania) y FN de Biochrom (Berlín, Alemania). Para placas de 96 pocillos (de viabilidad y adhesión), de recubrimiento se realizó con TNC a una concentración final de 1 mg /cm2. Para placas de 24 pocillos (ensayos de curación de heridas) Las concentraciones de carbohidratos de 0,1 mg /cm2, 0,5 mg /cm2 y 2,5 g /cm2 se utilizaron. Para placas de 6 pocillos (immunoblotting) una concentración de 0,5 mg /cm2 se utilizó. recubrimiento FN se realizó con una concentración final de 2 mg /cm2 de placas de 96 pocillos y 1 mg /cm2 de placas de 24 y 6 pocillos. proteínas de recubrimiento se permitió que se adsorbió durante la noche a 4 ° C, los pocillos se lavan a continuación con PBS para eliminar las proteínas no unidas y se bloquearon durante 30 min a 37 ° C por la adición de 0,2% desnaturalizado por calor (85 ° C durante 12 min) BSA en PBS. Las placas se lavaron finalmente dos veces con PBS estéril y se esterilizaron por exposición UV durante 20 min. Los cubreobjetos utilizados en experimentos de inmunofluorescencia se colocaron en placas de 24 pocillos múltiples y se recubrieron de la misma manera.