Extracto
A pesar de los avances en las terapias locorregionales y sistémicos, supervivencia de los pacientes de cáncer de pulmón sigue siendo un reto. Las tirosina quinasas receptoras están frecuentemente implicados en la patogénesis del cáncer de pulmón, y algunas estrategias de inhibición de tirosina quinasa han sido eficaces clínicamente. La tirosina quinasa del receptor de EphB4 ha surgido recientemente como un objetivo potencial en varios otros tipos de cáncer. Hemos tratado de estudiar sistemáticamente el papel de EphB4 en el cáncer de pulmón. Aquí, demostramos que EphB4 se sobreexpresa 3 veces mayor en los tumores de pulmón en comparación con los tejidos normales emparejados y con frecuencia exhibe el número de copias de genes en el cáncer de pulmón aumenta. También se muestra que la sobreexpresión de EphB4 promueve la proliferación celular, la formación de colonias, y la motilidad, mientras que la inhibición EphB4 reduce la viabilidad celular
in vitro
, detiene el crecimiento de tumores establecidos en modelos de xenoinjerto de ratón cuando se usa como una estrategia de un solo objetivo , y provoca la regresión casi completa de tumores establecidos cuando se utiliza en combinación con paclitaxel. Tomados en conjunto, estos datos sugieren un papel importante para EphB4 como un potencial objetivo terapéutico en el cáncer de pulmón. Los ensayos clínicos que investigan la eficacia de las terapias anti-EphB4, así como la terapia de combinación que implica la inhibición de EphB4 puede estar justificada
Visto:. Ferguson BD, Liu R, Rolle CE, Tan Y-HC, Krasnoperov V, Kanteti R, et al. (2013) La tirosina quinasa del receptor EphB4 Promueve el crecimiento del cáncer de pulmón: A Novel potencial diana terapéutica. PLoS ONE 8 (7): e67668. doi: 10.1371 /journal.pone.0067668
Editor: Todd W. Miller, Dartmouth, Estados Unidos de América
Recibido: 19 Febrero, 2013; Aceptado: 21 de mayo de 2013; Publicado: 2 Julio 2013
Derechos de Autor © 2013 Ferguson et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación ha sido apoyado en parte por el NIH /NICHD T32HD009007, "Formación de Postgrado en el crecimiento y el desarrollo" (BDF), Premio traslacional ASCO (EEV), NIH /NCI R01 CA 129501 05 (RS), y la Fundación para la Investigación del cáncer Janice Cordero McArdle (RS ). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. El PSG es el co-fundador y director de Vasgene Therapeutics, Inc. es un VK empleado de Vasgene Therapeutics, Inc. Existen patentes y productos en desarrollo, pero no los productos comercializados que declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales, como se detalla en línea en la guía para los autores. El resto de autores han declarado que no existen intereses en competencia.
Introducción
A pesar de numerosos objetivos de medicamentos se han estudiado ampliamente, la supervivencia global del cáncer de pulmón ha mejorado sólo mínimamente en las últimas cuatro décadas [1 ]. Una característica frecuente de cáncer de pulmón es una aberración en la que una o más tirosina quinasas receptoras (RTK), tales como MET, EGFR, y ALK, comúnmente se sobreexpresa, amplificados, o mutadas [2] - [4]. La familia Eph es la mayor familia de las RTK, que comprende catorce receptores de mamíferos que interactúan con ocho ligandos de mamíferos, o efrinas. receptores Eph y ligandos ephrin se organizan funcionalmente y estructuralmente en A y B clases [5]. receptores Eph son relativamente similares en todas las clases; sin embargo, los ligandos unidos a la membrana ephrin-B son los únicos que poseen dominios extracelulares que activan los receptores, así como dominios intracelulares que se cree que la señal aguas abajo dentro de una célula adyacente [6]. Hay algo de promiscuidad entre los receptores de ligandos y las interacciones; una de las interacciones más específicas receptor-ligando, sin embargo, es entre EphB4 y ephrin-B2 [7].
Clásicamente, los receptores Eph han sido actores importantes en la biología del desarrollo dado su papel en la orientación axón, vasculogénesis, y el desarrollo neuronal [8]. Sin embargo, varios miembros de la familia del receptor Eph también se han demostrado desempeñar un papel en el cáncer. Recientemente hemos demostrado que EphA2 se sobreexpresa en el cáncer de pulmón y alberga una mutación de ganancia de función de punto en algunos carcinomas de células escamosas, y la inhibición de EphA2, además de la exposición de rapamicina en células de cáncer de pulmón reducida su proliferación
in vitro
[9]. EphB4 también se ha informado a desempeñar un papel oncogénico en los cánceres de cabeza y cuello [10], [11], de próstata [12], [13], otros órganos genitourinarios [14] - [19], de mama [20], mesotelio [21], el esófago [22], la piel [23], y el intestino grueso [24], [25]. mutaciones EphB4 han también recientemente se ha informado en el cáncer de pulmón [26], [27], aunque su importancia es actualmente desconocido. Sin embargo, no se ha estudiado sistemáticamente en el cáncer de pulmón y su posible papel en esta enfermedad, por lo tanto sigue siendo una cuestión importante
.
A continuación, se muestra que EphB4 es una importante diana terapéutica en el cáncer de pulmón, ya que se sobreexpresa y a menudo muestran un aumento de número de copias de genes. Por otra parte, desmontables o inhibición de EphB4 atenúa el crecimiento de las células cancerosas
in vitro
y
in vivo
, mientras que la introducción de tipo salvaje EphB4 proporciona una ganancia de función en las células tumorales. Tomados en conjunto, estos datos identifican EphB4 como conductor potencialmente importante en la patogénesis del cáncer de pulmón.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
Los tejidos tumorales fueron documentados junto con las características del paciente cuando esté disponible con el consentimiento informado por escrito y de acuerdo con el protocolo aprobado por el Consejo de la Universidad de Chicago de Revisión Institucional. Todos los estudios con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad del Sur de California y realizan de acuerdo con las regulaciones de la Ley de Protección de los Animales.
Reactivos y anticuerpos
Todos los primers fueron diseñados utilizando Primer3Plus [28] y comprado de Tecnologías de ADN integrados (Coralville IA). Los anticuerpos anti-EphB4 (# 265 para IB y#131 para IHC), anticuerpo anti-ephrin-B2 (# 2B5), y albúmina de suero humano conjugado con EphB4 soluble (sEphB4-HSA), fueron generosamente proporcionado por el Laboratorio Gill, Universidad del Sur de California. proteína quimérica /Fc ephrin-B2 se adquirió de R & amp; D (Minneapolis MN). Anti-ß-actina anticuerpo se adquirió de Sigma (St. Louis MO). AZ12489875-002 fue un generoso regalo de AstraZeneca. SN-38 fue adquirido de Tocris Bioscience (Bristol UK).
Cell Culture
A549, H358, H522, H661, H1703, H1993, H2170, SW1573, BEAS-2B, H69, H82 , H184, H249, H345, H446, H526, H2171, y células PC3 líneas fueron adquiridos de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas VA. las líneas celulares se autentican por la ATCC y se prueban de forma rutinaria para la presencia de Mycoplasma. Todas las líneas celulares eran mantenido a 37 ° C y 5% de CO2 en medio RPMI suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 1% de penicilina /estreptomicina, 2% de bicarbonato de sodio, piruvato de sodio 1%, tampón HEPES 1%, y 1% de L-glutamina .
Tissue Procurement
cáncer de pulmón humano tejidos archivados de pacientes se obtuvieron de la Universidad de Chicago Centro de recursos de tejido humano.
la inmunohistoquímica
tejido de cáncer de pulmón de parafina secciones se desparafinaron en xileno, se rehidrataron mediante soluciones graduales de etanol a agua destilada, y se lavaron en solución salina tamponada con Tris (TBS). la recuperación del antígeno se llevó a cabo por las secciones de calentamiento en tampón de citrato (pH 6) durante 15 minutos en un microondas. La actividad peroxidasa endógena se inactivó mediante incubación en 3% H
2O
2 en metanol durante 5 minutos. sitios de unión no específicos se bloquearon con Protein Block (Dako, Carpinteria CA) durante 20 minutos. Las secciones se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con el anticuerpo primario anti-EphB4 (anti-ratón;#131) a una concentración de 40 mg /ml, a continuación, se incubaron durante 30 minutos con anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón conjugado con un polímero marcado con HRP (Bio SB, Santa Barbara CA). Las láminas fueron desarrollados durante 5 minutos con el cromógeno diaminobencidina 3-3'-, contraste con hematoxilina, y se cubrieron. Se realizaron controles negativos mediante la sustitución de anticuerpo primario con inmunoglobulinas de ratón no inmunes. secciones de cáncer de colon y el tejido cerebral sirvieron como controles positivos para la tinción de EphB4 [25], [29].
expresión de tejido para cada muestra se cuantificó mediante la calificación manual en un + /2 + /3 + escala de 0/1 , así como por un sistema automatizado celular Imaging (ACIS; Clarient, Aliso Viejo CA), que cuantifica la intensidad de la tinción basado en la relación de marrón a azul pixeles por unidad de área. software ACIS calcula la intensidad media para cada región analizada y calcula la densidad óptica integrada (IOD), que es directamente proporcional a la concentración de moléculas de EphB4 unido al anticuerpo de acuerdo con la ley de Beer-Lambert [30]. Por lo tanto, IOD es un indicador de contenido de antígeno, y se normalizó a la totalidad del área medida mediante el cálculo de IOD /10 m
2. En general, la calificación manual y análisis ACIS se utilizaron como métodos de cuantificación de la expresión paralelas y se encontró que tenían una correlación de r
2 = 0,75 (correlación de Spearman, p & lt; 0,0001; Figura S1). Como las tendencias de expresión fueron similares con ambos métodos, se reportan aquí principalmente los datos ACIS. Los patrones de expresión utilizando el mismo anticuerpo anti-EphB4 fueron similares en muestras de tejido fresco congelado (figura S2).
inmunotransferencia
lisados de células enteras fueron obtenidos mediante reactivo de extracción de proteínas de mamíferos M-PER (Pierce , Rockford IL) suplementado con 1,8 × inhibidor de la proteasa (Pierce) y 1,8 × Halt inhibidor de fosfatasa (Pierce). La concentración de proteína se estimó utilizando un espectrofotómetro Nanodrop (Thermo, Wilmington DE), y 100 g de proteína se cargó en un gel de 7,5% y se sometió a SDS-PAGE en 80-120V durante 1-2 horas. Las proteínas se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno en un aparato de transferencia semi-seco a 25 V durante 1 h, se lavaron brevemente, y las membranas se bloquearon con albúmina de suero bovino 5% (BSA) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de un lavado de 5 minutos, las membranas se expusieron durante 1 hora a temperatura ambiente con el anticuerpo primario anti-EphB4 (anti-ratón;#265) o anti-ephrin-B2 anticuerpo primario (anti-ratón;#2B5) a una concentración de 0,5 g /ml en 2,5% de BSA /0,05% de Tween-20. Las membranas se lavaron tres veces durante 10 minutos y se incubaron como anteriormente en anti-ratón anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) a una dilución 1:5000 durante 1 hora. Después de otro lavado, las membranas se incubaron en solución de quimioluminiscencia potenciada (Bio-Rad, Hercules CA) y se fotografiaron usando un sistema de formación de imágenes Bio-Rad QuantityOne. β-actina se probaron de forma similar como un control de carga. El PC3 línea celular de cáncer de próstata se utilizó como control positivo para la expresión de EphB4 [19].
Citometría de Flujo
Las células se lavaron una vez con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y después se disociaron con PBS /0,2% de EDTA a 37 ° C durante aproximadamente 5 minutos. Después de la neutralización de EDTA con medios de cultivo, las células se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 minutos. Las células fueron lavadas con frío /0,5% BSA PBS, seguido de incubación con 10% de suero de cabra normal en hielo durante 30 m, y luego con anticuerpos primarios diluidos en suero de cabra normal en hielo durante 1 hora. Las células se lavaron posteriormente con PBS frío y se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con fluorocromo en hielo durante 30 minutos. Después de un lavado final con PBS frío, núcleos celulares se tiñeron con DAPI y se analizaron con un citómetro de flujo (LSR II, BD Biosciences, Franklin Lakes NJ).
PCR cuantitativa
Con el fin de determinar número de copias del gen en el ADN EPHB4 tejido, PCR en tiempo real cuantitativa se realizó utilizando un instrumento de Applied Biosystems StepOne Plus (Foster City CA). Las mezclas de reacción contenían SYBR Fast Green Master Mix (2X; Applied Biosystems), ADN genómico, adelante y atrás primers qPCR (que se muestra en la Tabla S1), y el agua biología molecular grado al total de 25 l por reacción. qPCR utilizando cebadores LINE-1 se llevó a cabo en paralelo para servir como una referencia de número de copias de genes contra los que para normalizar los valores de fluorescencia primas, y las reacciones que contienen diversas diluciones de control de ADN genómico (Promega, Madison WI) se utilizaron para construir una curva estándar para extrapolar las concentraciones de ADN de tejidos y verificar que estas concentraciones eran el rango de detección lineal del instrumento.
líneas celulares siRNA desmontables
Para el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), las células se sembraron utilizando antibióticos medio exento de en placas de 96 pocillos a una densidad de 2,0 × 10
4 células por pocillo (para ensayos de viabilidad celular, ocho o más repeticiones por experimento) o placas de 6 pocillos a una densidad de 5,0 × 10
5 células por pocillo (para la recogida de lisado de células enteras) y se dejaron crecer hasta 30-50% de confluencia. Las células se transfectaron usando el reactivo de transfección Oligofectamine (Life Technologies, Carlsbad CA) de acuerdo con su protocolo estándar. FBS se añadió a 10% de concentración final después de 4 horas. transfectadas las células no transfectadas simuladas y sirvieron como controles. knockdown de proteína fue confirmada por inmunotransferencia (Figura S3)
.
Para el cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) líneas de células, las células se sembraron utilizando medios Opti-MEM en placas de 6 pocillos a una densidad de 5 × 10
5 células por pocillo (tres repeticiones por condición). Las células fueron transfectadas con 100 nM no director de control de siRNA o reactivo de transfección Oligofectamine EPHB4 de metas de siRNA (Santa Cruz), utilizando de acuerdo con su protocolo estándar. Después de una noche de incubación, las células se recogieron por centrifugación y se resuspendieron en medio completo. Falsamente transfectadas y células transfectadas de control siRNA-sirvieron como controles. knockdown de proteína se confirmó por inmunotransferencia.
Expresión de constructos de EphB4 en líneas celulares
Un clon de ADNc EPHB4 de tipo salvaje en el vector pCMV6-XL6 (Origene, Rockville MD) se utilizó como un mamífero vector de expresión. Para la transfección transitoria, las células se colocaron en placas en medio libre de antibióticos, ya sea en placas de 96 pocillos a una densidad de 2,0 × 10
4 células por pocillo (para ensayos de viabilidad celular, ocho repeticiones por experimento) o placas de 10 cm a una densidad de 3,0 × 10
6 células por placa (para la recogida de lisado de células enteras) y se dejaron crecer hasta aproximadamente 50 a 75% de confluencia (para permitir el crecimiento exponencial durante las siguientes 72 horas). Las células se transfectaron usando el reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (Life Technologies) de acuerdo con su protocolo estándar. Los complejos se eliminan después de 4-6 horas y se reemplaza con medio libre de antibiótico fresco después de un lavado con PBS. Las células no transfectadas y transfectadas simuladas (reactivo de transfección) sólo sirvieron como controles. expresión de la proteína fue confirmada por inmunotransferencia (Figura S4)
Establecimiento de líneas celulares estables que expresan EphB4
De tipo salvaje de longitud completa EPHB4 ADNc (número de acceso GenBank NM_004444; OriGene, Rockville MD). fue clonado en pcDNA3.1 con una etiqueta Myc C-terminal en el marco. Este vector y el vector vacío de control pcDNA3.1 se transfectaron individualmente en células H661 utilizando BioT (Bioland, Paramount CA) según el protocolo del fabricante. Después de la transfección, el medio de cultivo se cambió al medio de crecimiento final (RPMI1640 suplementado con 10% de FBS) que contiene 300 mg /ml G418. Una semana más tarde, las células supervivientes se tripsinizaron y se sembraron en placas de 96 pocillos con diluciones graduadas. La concentración de G418 en el medio de cultivo se redujo a 200 mg /ml a partir de ahora. Las colonias individuales surgieron dos semanas más tarde y se seleccionaron mediante inmunotransferencia utilizando un anticuerpo anti-Myc (9E10 clon, ATCC). a continuación, se ampliaron las colonias con expresión de EphB4-Myc exógeno.
Ensayos de viabilidad celular
Para las líneas celulares de cáncer, después de la transfección de siRNA o plásmidos en células o el tratamiento de las células con sEphB4-HSA en 96- así placas como se describió anteriormente, se dejaron las células a crecer hasta el punto de tiempo deseado, en cuyo momento se retiró el medio, las células se lavaron una vez con PBS, y se añadieron 100 l medio de cultivo fresco a cada pocillo. Después de la adición de 5 l de una solución de sal de resazurina de sodio 0,028% (peso /volumen; Sigma), las placas se incubaron a 37 ° C protegido de la luz durante 2-5 horas y la fluorescencia se midió usando un lector de placas de fluorescencia (530/590 nm excitación /emisión). Para ephrin-B2 /ensayos de estimulación Fc, 5 × 10
4 células /pocillo fueron sembradas en placas de 24 pocillos, de hambre durante la noche, y se estimularon con 1 mg /ml ephrin-B2 /Fc durante 0, 24, 48 o 72 horas. Las células se lavaron dos veces con 1 x PBS, se tiñeron con solución de azul de tripano (0,4%; Sigma)., Y de forma manual contados por microscopía de luz
Para las líneas celulares de SCLC, las células se sembraron por triplicado a una densidad de 1 × 10
5 células /pocillo y se trató con 0,5 g /ml de ephrin-B2 /Fc o las concentraciones indicadas de AZ12489875-002. Para las células de siRNA-transfectadas, las células se recogieron 24 horas después de la transfección, se resuspendieron en medio completo, chapado por triplicado a una densidad de 1 × 10
5 células /pocillo, y se deja sin tratar o se trataron con 200 nM de SN-38 para 72 horas a 37 ° C. Para ephrin-B2 /ensayos de estimulación de Fc, 5 × 10
4 células /pocillo se sembraron en placas de 24 pocillos, de hambre durante la noche, y se estimularon con 0,5 mg /ml ephrin-B2 /Fc durante 48 horas. La viabilidad celular se determinó mediante la adición de 10 l de 5 ng /ml de MTT (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio; Sigma) durante los últimos 2-4 horas de cultivo. sales de formazán insolubles se disolvieron mediante la adición de 50 l de una solución de isopropanol acidificado. La absorbancia se leyó a 570 nm dentro de los 15 minutos de la parada de la reacción con un lector de absorbancia.
topoisomerasa I Ensayo de actividad
H446 y H526 células se dejaron sin estimular o se estimularon durante 15 minutos con 50 ng /ml de HGF o ephrin-B2 /Fc, después se lavó dos veces con PBS enfriado en hielo. Los extractos nucleares se prepararon como se describe anteriormente [31]. Brevemente, las células se recogieron por centrifugación y se lavaron una vez con TEMP enfriado con hielo (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), EDTA 1 mM, MgCl 4 mM
2, 0,5 mM fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF)). Las células se suspendieron posteriormente en 1 ml de TEMP fría durante 10 minutos y luego se centrifuga a 1500 ×
g
durante 10 minutos. nódulos nucleares se resuspendieron en 20 l TEP (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), EDTA 1 mM, PMSF 0,5 mM) más 20 l 1 M NaCl, colocada en hielo durante al menos 30 m, y después se centrifugaron a 15.000 ×
g
durante 15 minutos.
Top1
actividad enzimática en extractos nucleares se midió usando un ensayo de relajación de ADN (TopoGen, Port Orange FL) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, 100 ng de ADN de plásmido superenrollado en una mezcla de reacción de 20 l (con 10 mM Tris-HCl (pH 7,9), EDTA 1 mM, NaCl 150 mM, 0,1% de BSA, espermidina 0,1 mM, glicerol al 5%) se incubó a 37 ° C durante 30 minutos con (1:4) extractos nucleares limpias y diluidas en serie, purificada humana recombinante
Top1 gratis (control positivo), o diluyente de ensayo (control negativo). Las reacciones se terminaron por adición de 5 l 5 x tampón de carga (5% de SDS, 0,3% de azul de bromofenol). Las muestras se resolvieron en un gel de agarosa al 1% y la imagen que el anterior.
de colonias en agar suave Formación Ensayo
Para evaluar el potencial tumorigénico de las células EphB4 de tipo salvaje, 1 × 10
4 células viables por pocillo se sembraron en agar blando en placas de 6 pocillos. En pocas palabras, la capa de base se hizo mezclando volúmenes iguales de agar estéril 1,2% (enfrió a 40 ° C) y 2 × medio RPMI1640 para obtener una solución final de 0,6% de agar en 1 × medio RPMI1640. Para la capa superior, el agar se diluyó a 0,8% en agua destilada, se enfrió a 40 ° C, y luego se mezcla en proporciones iguales con 2 × medio RPMI1640. Las células se añadieron inmediatamente a la mezcla para producir una solución final de 0,4% de agar en 1 × medio RPMI1640. Las células crecieron durante 4 semanas a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2, en la que fueron fotografiados punto de colonias viables y se contaron usando el software ImageJ.
Ensayos de la cicatrización de heridas
H661 vacío vectores y células del clon estables EphB4 de tipo salvaje fueron sembradas en placas de 6 pocillos y se cultivaron hasta 100% de confluencia, luego tratados con 1 mg /ml ephrin-B2 /Fc. A cero recta se hizo a través de la capa de células usando una punta de pipeta de 1 mL. Después, las células se lavaron suavemente con 1 × PBS para eliminar los restos celulares, y se reemplazó el medio. Se tomaron fotografías de la región de la herida a las 0, 4, 7, 23 y 28 horas y se analizaron mediante el software TScratch (CSELab, ETH Zurich, Suiza).
En vivo
crecimiento tumoral
2 × 10
6 A549 o H1993 o 4 × 10
se inyectaron 6 H446 células en los flancos de 10-12 semanas de edad, macho Balb atímicos ratones /C (Harlan Laboratories, CA Placentia ) y se dejó establecer tumores primarios de aproximadamente 75 mm
3 en volumen. inyecciones de flanco se eligieron sobre un modelo ortotópico debido a su uso bien establecido en estudios de cáncer de pulmón, así como su facilidad de mediciones no invasivas de tumores [32]. El crecimiento del tumor se midió tres veces por semana, y el volumen se calculó usando 0,52 × a × b
2 (derivado del cálculo del volumen de un esferoide, V = 4/3 π · · un
2 · b, donde a es el radio del eje menor y b es el radio del eje mayor; Ref. 33), donde a es la dimensión más larga y b es la dimensión más corta de la masa palpable. Seis días después de la implantación, los ratones con xenoinjertos A549 se dividieron al azar en cuatro grupos (seis ratones por grupo), y se inició tratamiento: PBS (control), paclitaxel (20 mg /kg por semana), sEphB4-HSA (20 mg /kg tres veces por semana), o paclitaxel más sEphB4-HSA. Los ratones con xenoinjertos de H446 H1993 o se dividieron en dos grupos (seis ratones por grupo), y se inició el tratamiento: PBS (control) o sEphB4-HSA (50 mg /kg tres veces por semana). Todos los tratamientos se administraron por vía intraperitoneal. Los animales fueron sacrificados y, finalmente, los tumores fueron cosechadas al final del experimento.
inmunofluorescencia
Los tejidos recolectados de xenoinjertos de ratón A549 fueron congelaron rápidamente y se incluyeron en compuesto OCT. 5-10 micras secciones fueron fijadas en paraformaldehído al 4%, se lavaron en PBS, y se incubaron en anti-Ki-67 (BD Biosciences), anti-CD31 (BD Biosciences), anti-fosforilado S6 (S235 /S236 primaria; Cell Signaling, Danvers MA), anti-Akt fosforilada [S473 (Ref 34).; Señalización Celular], o anti-fosforilados Src (Y416; Cell Signaling) de anticuerpos durante la noche a 4 ° C. Por inmunofluorescencia, las secciones se lavaron en PBS y se incubaron con anticuerpo secundario Alexa Fluor-conjugado (Life Technologies). A dUTP nick-etiquetado final TdT-mediada (TUNEL) ensayo (Promega, Madison WI) también se realizó para evaluar la apoptosis. DAPI se utilizó como contratinción nuclear y sirve como un control contra el que se normalizaron las intensidades de los marcadores celulares. Las imágenes fueron capturadas con un microscopio Nikon Eclipse 80i fluorescencia y el sistema de la serie de imágenes Meta Morph. Para la inmunohistoquímica, las secciones se incubaron primero en anticuerpo secundario conjugado con biotina, seguido por avidina conjugada con HRP, a continuación, 3,3'-diaminobencidina reactivo (Vector Labs, Burlingame CA). Hematoxilina se utilizó como contratinción nuclear. Las imágenes fueron capturadas utilizando un microscopio Olympus BX51 y el sistema Image-Pro Plus 6.0.
Estadísticas
Para los análisis de tinción inmunohistoquímica, los valores log
10 ACIS de tumor frente tejidos pulmonares normales emparejados eran en comparación utilizando una prueba t pareada de dos colas para la cohorte total de pacientes, así como dentro de los subtipos individuales. A cada nivel de intensidad ACIS representa la media de hasta tres réplicas para un paciente dado se determina usando núcleos de tejido separadas dentro del mismo tumor microarrays. El grado de similitud entre los AIC y de puntuación patológica manual fue determinada utilizando una correlación de Spearman de dos colas. Los datos de supervivencia se representan mediante curvas de Kaplan-Meier de puntuación basado en la intensidad de inmunohistoquímica (alta versus baja utilizando un punto de corte de 500 en el SIAC, lo que representa la intensidad media global) y en la designación carrera.
Para los ensayos de viabilidad celular, replican puntos de datos se promediaron y compararon cualquiera de las células transfectadas falsamente coincidentes en el tiempo (para células siRNA-transfectadas) o con las células control coincidentes en el tiempo (por las células tratadas con sEphB4-HSA). Para comparar los tratamientos en parejas, se utilizó la prueba t de Student. Otras comparaciones de dos grupos se realizaron mediante la prueba t de estudiante, y los de tres o más grupos se realizaron mediante ANOVA de una vía. Para evaluar la variabilidad entre un conjunto de condiciones de tratamiento con múltiples puntos de tiempo, se utilizó ANOVA de dos vías. A menos que se indique lo contrario, las barras de error utilizados en la visualización de datos de viabilidad celular representan el error estándar de la media normalizada a ciento diferencia frente a los valores de control. Para
in vivo
ensayos de crecimiento, se determinó la significación estadística de las diferencias en el crecimiento del tumor en cada momento para cada condición mediante la prueba t sea una de Student para muestras no apareadas o ANOVA de una vía para muestras entre los cuatro grupos de tratamiento. Para determinar la significación estadística de un cambio en el volumen tumoral medio de un brazo de tratamiento individual, se utilizó la prueba t de Student. Todos los cálculos estadísticos se realizaron utilizando el software Prism (GraphPad, La Jolla CA) o el paquete estadístico SAS (Cary NC).
Resultados
EphB4 se sobreexpresa y ha aumentado de Gene número de copias en el cáncer de pulmón
en los análisis por pares de 89 muestras tumorales y normales emparejados de pacientes con cáncer de pulmón, hemos encontrado EphB4 a ser significativamente sobreexpresado en comparación con los tejidos normales emparejados en adenocarcinoma (n = 41; 4,3 veces la diferencia de medias), carcinoma de células grandes (n = 15; 2,9 veces la diferencia de medias), carcinoma de células pequeñas (n = 13; 2,4 veces la diferencia de medias), y carcinoma de células escamosas (n = 10; 2,7 veces diferencia de medias) subtipos. En general, no se encontraron tumores para expresar EphB4 3,2 veces más fuertemente que los tejidos normales emparejados (Figura 1). EphB4 en el tejido pulmonar normal adyacente se muestra en la Figura S5
.
Un
. inmunohistoquímica imágenes representativas de la expresión de EphB4 a través de múltiples subtipos de cáncer de pulmón. puntuación patológica se indica por encima de las columnas; panel de más a la derecha es una vista de la energía higher- correspondiente 3+ imágenes que muestran patrones de tinción subcelulares. Nota tinción membranosa pronunciado en el carcinoma de células grandes.
B Opiniones. patrones de expresión de EphB4 en diversos subtipos de cáncer de pulmón con la raza y la distribución de los estadios. Los puntos individuales representan las puntuaciones medias ACIS en un mismo paciente para que corresponde tejidos normales y tumorales. El número total de pacientes dentro de cada análisis se muestra debajo de los gráficos. Sólo los pacientes con tumor emparejados y tejidos normales se incluyeron en los análisis. Las barras horizontales representan las puntuaciones medias ACIS en todos los pacientes en un conjunto dado. La raza y de la etapa clínica distribuciones para cada subtipo y el conjunto general se muestran debajo de cada gráfico.
También se determinó la expresión de la línea celular de NSCLC de la proteína de EphB4 a través de análisis de inmunotransferencia (Figura 2A). Seis de las ocho líneas celulares de NSCLC (A549, H358, H522, H1703, H1993, SW1573) expresaron EphB4 en un grado sustancial, uno (H661) demostraron una baja expresión de EphB4, y uno (H2170) carecían de expresión de EphB4. El ligando ephrin-B2 EphB4 se expresa a un nivel consistentemente baja en todas las líneas celulares ensayadas. La expresión de EphB4 en un panel de ocho líneas celulares de SCLC fue examinado por inmunotransferencia (Figura 2B) y citometría de flujo (Figura 2C). Cuatro líneas celulares de SCLC (H82, H249, H446, H2171) expresaron EphB4 mediante análisis de inmunotransferencia, mientras que las células H69 y H526 no expresan EphB4. La expresión superficial de EphB4 por análisis de citometría de flujo validado en gran medida los resultados de inmunotransferencia.
A-B Opiniones. expresión de la proteína de EphB4 en paneles de CPNM y CEP líneas celulares por inmunotransferencia. expresión de ephrin-B2 también se evaluó en líneas celulares de cáncer. BEAS-2B es una línea inmortalizada, no canceroso de pulmón de células usado aquí como control; la línea celular PC3 de cáncer de próstata se incluyó como un control positivo. B-actina y GAPDH se utilizaron como controles de carga.
C
. expresión de EphB4 en un panel de líneas celulares de SCLC evaluados por citometría de flujo utilizando anticuerpos EphB4 específica (rojo). IgG de ratón normal se utilizó como control negativo (azul). positividad EphB4 se expresa como el porcentaje del total de células se muestra a la derecha de cada panel.
Para determinar el número de copias del gen EPHB4 en muestras de tejido, se realizó un análisis qPCR y encontramos que varios tejidos demostraron un aumento del gen EPHB4 el número de copias. Seis, nueve, y 23 por ciento de adenocarcinoma, carcinoma de células pequeñas, y tejidos de carcinoma de células escamosas, respectivamente, se encontró que contienen más de tres copias del gen EPHB4, con 14% de tejidos de carcinoma de células escamosas que tienen más de 10 copias (Figura S6) . No se encontraron líneas celulares sometidas a prueba para demostrar las ganancias del número de copias de genes.
Expresión EphB4 y pronosticación en el cáncer de pulmón
Un resumen de las características clínicas de los tejidos del paciente utilizados en este estudio se muestra en la Tabla S2. La supervivencia del paciente se correlacionó fuertemente positivamente con la expresión de EphB4 tumor, como los que tienen una expresión de alto EphB4 tiene una mediana de supervivencia triple más tiempo que aquellos con baja expresión (51 meses frente a 17 meses, p = 0,021; Figura 3a). También se encontró que los pacientes de raza blanca para expresar EphB4 significativamente más fuertemente que los pacientes afroamericanos (p = 0,019; datos no presentados); Sin embargo, esto no se tradujo en una diferencia en la supervivencia estratificada por raza (p = 0,92; Figura 3B). No se encontró asociación significativa entre la expresión de EphB4 y otras características del paciente, tales como el sexo, el tabaquismo y la edad al momento del diagnóstico, ya sea en la cohorte total de pacientes o cuando se estratificó por el subtipo de cáncer de pulmón.
El eje de ordenadas en cada gráfico representa la fracción de pacientes vivos.
Un
. La supervivencia estratificada por EphB4 expresión. puntajes ACIS encima y por debajo de 500 se eligieron para la estratificación basada en la puntuación media de la cohorte. Las flechas representan la mediana de supervivencia (50% de los pacientes vivos) en meses.
B Opiniones. La supervivencia estratificada por raza.
EphB4 modulación afecta el crecimiento celular
in vitro
El cáncer de pulmón fueron transfectadas transitoriamente con EPHB4 dirigida siRNA o tratados con sEphB4-HSA en cultivo para determinar si la viabilidad celular se vería afectada. sEphB4-HSA es un fragmento de la proteína monomérica que comprende el dominio extracelular de EphB4 y conjugado con albúmina de suero humano que puede unirse al ligando ephrin-B2 y por lo tanto antagonizar la activación del receptor EphB4 través de la interrupción de la interacción entre el receptor EphB4 y ephrin-B2 ligando [35], [36]. En la línea celular A549, viabilidad después de la exposición a sEphB4-HSA se redujo en aproximadamente un 17% con la concentración más baja y en un 40% con las más altas concentraciones de sEphB4-HSA después de 96 horas (Figura 4A). En la línea celular H522, un efecto similar se observó en la dosis más alta después de 96 horas (de reducción de ~58%), mientras que las dos concentraciones más bajas inicialmente reducción de la viabilidad en comparación con células de control pero tuvo un efecto menor en los puntos de tiempo posteriores (Figura 4A) .
Un
. células A549 y H522 se trataron con EphB4 soluble a las concentraciones indicadas, y su efecto sobre la viabilidad celular se midió en los puntos de tiempo mostrados usando fluorescencia de resazurina.
B Opiniones.
C
.
B Opiniones.
C
.
D
. ns: no significativo.
B Opiniones.
C
.
B Opiniones.