Extracto
La sobreexpresión de TOP2A se asocia con riesgo de progresión sistémica en pacientes con cáncer de próstata, y los niveles más altos de TOP2A se encontraron en la hormona casos resistentes. Para dilucidar el mecanismo por el que los altos niveles de TOP2A contribuyen a la progresión del tumor generamos TOP2A overexpressing líneas celulares de cáncer de próstata. Se demuestra que TOP2A promueve la agresividad del tumor mediante la inducción de reordenamientos cromosómicos de genes que contribuyen a un fenotipo más invasiva. El tratamiento anti-andrógeno sola era ineficaz en la eliminación de células que sobreexpresan TOP2A debido a la activación de una red de receptor de andrógenos. venenos TOP2A mataron a las células tumorales de manera más eficiente temprano en el curso de progresión, mientras que en etapas posteriores que proporcionan mayor beneficio cuando se combina con terapia anti-andrógenos. Mecánicamente, encontramos que TOP2A aumenta la señalización de andrógenos, facilitando la transcripción de genes sensibles a los andrógenos, promoviendo así el crecimiento de células tumorales. Estos estudios revelaron una relación entre TOP2A y vía de señalización del receptor de andrógenos que contribuye a la progresión del cáncer de próstata y confiere sensibilidad a los tratamientos
Visto:. Schaefer-Klein JL, Murphy SJ, SH Johnson, Vasmatzis G, Kovtun IV (2015 ) la topoisomerasa 2 alfa, coopera con la del receptor de andrógenos para contribuir a la progresión del cáncer de próstata. PLoS ONE 10 (11): e0142327. doi: 10.1371 /journal.pone.0142327
Editor: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italia
Recibido: 10 Junio, 2015; Aceptado: 19 Octubre 2015; Publicado: 11 de noviembre 2015
Derechos de Autor © 2015 Schaefer-Klein et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por una beca Waterman descubrimiento de biomarcadores y el Centro de Medicina Individualizada de la Clínica Mayo. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
ADN topoisomerasa 2 alfa (TOP2A) es una enzima nuclear esencial, requerida para la resolución de la tensión topológica asociada con la replicación del ADN. TOP2A introduce pausas transitorios de doble cadena (DSB) en el ADN de una manera dependiente de ATP para permitir cambios en la topología del ADN y eliminar el exceso de bobinado [1,2]. función TOP2A es crucial en muchos procesos biológicos, incluyendo la replicación, la transcripción, la reparación del ADN y el mantenimiento estructura del cromosoma. Se expresa en altos niveles en las células en división como su nivel es conocida por ser regulada a través del ciclo celular, y se utiliza a menudo como un marcador de proliferación [3,4]. Las anormalidades de la proteína TOP2A están vinculados a la inestabilidad cromosómica [5]. TOP2A se cree que juega un papel importante en el puesto de control decatenation durante la mitosis, un mecanismo responsable de la segregación cromosómica correcta [6-8]. Alto nivel de TOP2A como un indicador de comportamiento más agresivo y etapa avanzada se informó para varios tipos de cáncer [9,10]. Orientación TOP2A y la proliferación celular posterior, se ha utilizado como un enfoque terapéutico para tratar rutinariamente algunas neoplasias malignas [11]. Los fármacos que pertenecen a la clase de venenos TOP2A constituyen la mayor parte del aprobado para uso clínico agentes. El etopósido y doxorrubicina objetivo ambas isoformas de la enzima TOP2, A y B, al interferir con su ciclo de división de ADN /ligadura, la inducción de ADN DSBs y la muerte celular de disparo [12,13]. Una segunda clase de compuestos dirigidos TOP2, inhibidores catalíticos TOP2, no inducen la formación de la proteína ligada al ADN OSD sino que actúan como inhibidores no competitivos de la actividad ATPasa TOP2 [12]. La eficacia de los venenos TOP2A se cree que dependerá del nivel de proteína TOP2A [5] y su actividad enzimática [14]
. Un número de estudios han demostrado que los niveles elevados de cuenta TOP2A para una mayor sensibilidad de las células a los venenos TOP2A etopósido y doxorrubicina [15,16]. Actividad de la enzima TOP2A está regulada por modificaciones post-traduccionales [14-22]. La fosforilación de TOP2A en los residuos dentro del dominio catalítico afecta a su actividad enzimática [17, 21]; y mutaciones en algunos de estos sitios se informaron para tener en cuenta la resistencia de las células tumorales a los venenos TOP2A [14]. Aunque, los niveles de proteína TOP2A y su actividad se consideran los principales contribuyentes a la sensibilidad de las células tumorales a los venenos TOP2A, TOP2A También se ha demostrado asociarse con la resistencia a la quimioterapia, tanto
in vitro
y
in vivo
, a través de mecanismos de alteración de la distribución intracelular y la inhibición de la apoptosis [23,24]. Se muestran altos niveles de DLX4 proteína para estimular la reparación de DSB de ADN inducida por la doxorrubicina haciendo que el fármaco ineficaz [25].
La resistencia a venenos TOP2A, observados en los tumores clínicamente refractarios [26], y el desarrollo de cánceres secundarios, como la leucemia mielógena, como resultado de
de novo
reordenamientos [12,27], son las principales limitaciones de la terapia anti-TOP2A. Se necesita más investigación para entender completamente los factores y mecanismos que subyacen a la respuesta del tumor a los fármacos que inhiben TOP2A.
TOP2A se sobreexpresa frecuentemente en el cáncer de próstata agresivo (PCA). Estudios anteriores han demostrado una correlación positiva entre el nivel de expresión de TOP2A y la puntuación de Gleason (GS) [28,29]. Los carcinomas con la más alta expresión de TOP2A fueron pobremente diferenciado [28]. Los niveles elevados de TOP2A También se encontraron resistentes a la hormona del CaP GS 8-10 [29]. Nuestro grupo ha encontrado que la sobreexpresión de TOP2A se asoció significativamente con un mayor riesgo de progresión sistémica en pacientes con CaP [30]. El nivel de proteína TOP2A era el predictor más fuerte de los resultados en el contexto de
ERG
expresión [31].
TMPRSS2-ERG
fusión, el reordenamiento más común observado en CaP afecta hasta el 60% de los casos [32,33]. El mecanismo subyacente de generación de
ERG sobre Fusion ha sido examinado [34,35]. Haffner et al. han demostrado que los receptores de andrógenos (AR) y TOP2B son co-reclutado a elementos reguladores de genes de respuesta de andrógenos tras la transcripción y el gatillo de formación de DSB de ADN. Estas interrupciones se cree que son altamente recombinogénico y cuando repararon resultado la producción de
de novo
genes de fusión, tales como
TMPRSS2-ERG
[35]. Del mismo modo, TOP2B es reclutado para otros receptores de esteroides: estrógenos genes diana del receptor de estrógenos sobre la señalización [36,37]. Aunque, las proteínas TOP2A y B tienen funciones celulares similares en la resolución de la sobretensión de ADN mediante la introducción de DSBs, ningún estudio informó de una cooperación de TOP2A con maquinaria de transcripción de una manera análoga a TOP2B. A pesar de una correlación informado entre altos niveles de TOP2A y un peor pronóstico en el cáncer, el mecanismo exacto que subyace fenotipo más agresivo asociado con TOP2A no se conoce. TOP2 venenos, tales como mitoxantrona y doxorrubicina, ocasiones, se prescriben para el tratamiento resistente a la castración CaP metastásico se muestran para proporcionar beneficios sólo paliativos [38]. Por otra parte, la terapia de privación de andrógeno adyuvante estándar parecía ser eficaz sólo en el grupo de pacientes cuyos tumores expresado alto nivel de TOP2A y son positivos para
ERG sobre Fusion [30,31]. No está claro si estos pacientes pueden beneficiarse de la terapia con inhibidores de la TOP2A en un entorno adyuvante. En este estudio, hemos desarrollado un modelo celular para examinar el papel de TOP2A en la progresión tumoral y evaluar su contribución a la sensibilidad celular a la hormonal y la quimioterapia. Se demuestra que impulsa TOP2A CaP hacia un fenotipo más invasiva mediante la inducción de reordenamientos de ADN. También proporcionamos la evidencia para el mecanismo de sensibilidad relacionada con el tiempo de las células de tumor de próstata a los venenos TOP2A. Se demuestra que las células tumorales de la próstata más avanzados, resistentes a la ablación de andrógenos, se pueden eliminar de manera más eficiente mediante una terapia de combinación con anti-andrógenos y doxorrubicina. TOP2A interfiere con la terapia anti-andrógenos aumentar la sensibilidad a la señalización AR facilitando su actividad transcripcional en los elementos sensibles a los andrógenos.
Resultados
Generación de líneas celulares de cáncer de próstata sobreexpresan TOP2A
la hipótesis de que los altos niveles de TOP2A, más allá de las normalmente presentes en las células de ciclismo, provocar la generación persistente de DSB de ADN que posteriormente conducen a reordenamientos genómicos asociados con la formación de un fenotipo más agresivo (S1 a la figura). Para investigar la contribución de TOP2A a la carcinogénesis de próstata y explorar los beneficios de la orientación terapéutica de esta proteína para los pacientes con CaP nos propusimos desarrollar líneas celulares que sobreexpresan de forma estable con CaP TOP2A. Aunque TOP2A es altamente expresado en el cáncer de células
in vivo
, los intentos de expresar esta proteína ectópica
in vitro
no han tenido éxito debido a la inducción concomitante de la apoptosis [39].
In vivo
, durante la progresión del cáncer, las células han desarrollado mecanismos para eludir la muerte celular programada asociada con alto nivel de TOP2A. Por ejemplo, la proteína CKS2, elevado en CaP, en modelos animales y líneas celulares de CaP, se demostró para proteger las células de la apoptosis [40]. Por lo tanto, para superar la apoptosis inducida por los altos niveles de TOP2A, que primero generamos CaP LNCaP clones estables que sobreexpresan CKS2 (S1B Fig), y clones con nivel reducido de la caspasa-3 (S1C Fig), un importante caspasa efectora en vía apoptótica [41] . La expresión de la caspasa-3 fue reportado perdido o reducido en el CaP [42]. Las formas catalíticamente inactivos de la caspasa-3, cuando se transfecta en las células, se muestran específicamente para inhibir la muerte celular provocada por la respuesta al daño de ADN [43]. Los intentos de eludir la apoptosis inducida por TOP2A sobreexpresan CKS2 no pudieron rescatar a cualquier TOP2A sobreexpresión de líneas celulares. Se seleccionaron tres clones con nivel reducido de la caspasa-3 en la integración de TOP2A cDNA y se utilizaron en experimentos posteriores. clon T14 mostró el más alto nivel de proteína TOP2A y fue utilizado como TOP2A con más expresión, mientras que T25 y T33 tenían un nivel endógeno de TOP2A y se utilizaron como controles negativos (Fig S1D).
Los niveles más altos de TOP2A aumenta la invasividad de las células tumorales
para recapitular los cambios que se producen
in vivo
sobre la progresión del CaP, nosotros los clones cultivados de forma continua para investigar cómo el nivel de TOP2A afectada funciones celulares. Los clones fueron cosechadas en diferentes pasajes y analizados. Como expresión de TOP2A se sabe que se correlaciona con la proliferación [4] se examinaron primero las tasas de proliferación. No se encontraron diferencias significativas en las tasas de proliferación entre el TOP2A mayor clon expresador (T14) e inferior clones expresador (T33 y T25) (Figura 1A). las tasas de proliferación no cambiaron significativamente con el aumento de paso de, ya sea clon lo que sugiere que niveles elevados de TOP2A no afectan el crecimiento del tumor
per se
en cultivo. Niveles más altos de TOP2A embargo, no afectan a la motilidad e invasividad de clones LNCaP. células LNCaP parentales, expresadores TOP2A alto y bajo de pasajes tempranos y tardíos se compararon en ensayos de cámara de Boyden. Tanto temprano (p23) y tardías (p46) pasajes de la TOP2A sobreexpresan clon T14 demostraron un mayor movimiento a través de la membrana que sus clones control emparejados o células LNCaP parentales (Figura 1B). Del mismo modo, las células con alto nivel de TOP2A demostraron propiedades más invasivos que sus contrapartes con nivel endógeno de la proteína. La morfología de las células que migraron a través de la membrana recubierta difería entre T14 y T33 clones. Las células que sobreexpresan T14 TOP2A se extendían con formas irregulares de punta y procesos más largos se asemejan fenotipo mesenquimal, mientras que, las células T33 aparecieron más plano y redondo, con procesos cortos (Figura 1C).
A) proliferación de clones que sobreexpresan de forma estable TOP2A (T14) y las células de control emparejados con el nivel endógeno de TOP2A (T25 y T33). La proliferación se determinó a las 96 horas después de la siembra celular. B) Motilidad de clones TOP2A de diferente paso y las células LNCaP parentales determina usando un ensayo de cámara de Boyden. C) Las imágenes de las células con fenotipo invasivo después de 72 horas de proliferación. P designa el número de pases; OD, au se mide la densidad óptica en unidades arbitrarias. Los datos se presentan como media ± desviación estándar, basado en 3 experimentos independientes. * P & lt; 0.00001, y ** p & lt; 0,0001, n = 3.
La sensibilidad de las células que sobreexpresan TOP2A a los tratamientos de cambios sobre la proliferación prolongada
tumores de próstata de alto grado
in vivo ¿Cuáles son conocidos para desarrollar resistencia a la terapia de privación de andrógenos con el tiempo [44]. No existe un tratamiento específico para estos pacientes. Nosotros, por lo tanto, investigamos cómo la sensibilidad de clones generados sobreexpresan TOP2A a anti-andrógenos, venenos TOP2A y combinación de dos fármacos cambió con el tiempo. A principios de los pasajes células T14 altos TOP2A-expressor eran mucho más sensibles a la doxorubicina que sus células homólogo T25 (Fig 2A). La diferencia desapareció a los pasajes más altos como células fueron propagadas en cultivo, con células T14 cada vez más resistentes al tratamiento anti-TOP2A (Fig 2B). Se observó tendencia similar para los tratamientos con Casodex anti-andrógeno (Fig 2A y 2B, paneles inferiores). Hubo una diferencia significativa consistente en la sensibilidad a Casodex entre T14 y T25 clones de los primeros pasajes. Aunque es pequeño (aproximadamente 10 a 15%) a las dosis seleccionadas, esta diferencia no se observó en los pasajes más altos, similar al patrón de sensibilidad se muestra para la doxorrubicina (Figura 2B, panel superior). Las diferencias en la respuesta no se relacionaron con los cambios en el nivel de proteína TOP2A ya que estas células después de la propagación en cultivo conservado niveles más altos de TOP2A (Fig 2C). Por lo tanto, estos datos muestran que las células de los primeros pasajes que sobreexpresan TOP2A son más sensibles a los tratamientos, los dos fármacos anti-TOP2A y anti-andrógenos. Un estudio reciente ha identificado que DLX4, frecuentemente sobreexpresado en los cánceres de mama y de ovario, estimula la reparación de DSB de ADN inducida por venenos TOP2A, disminuyendo de ese modo la sensibilidad celular para el tratamiento [25]. Por lo tanto, en comparación nivel de DLX4 en las células epiteliales de próstata normales y células tumorales de cáncer de diferentes GS (S2 FIG). el análisis de microarrays de expresión [30] mostró que no hay inducción de DLX4 en el CaP, lo que indica que DLX4 no será un factor que contribuye a la resistencia a los venenos TOP2A en CaP.
a) La supervivencia de clones de TOP2A principios de paso en respuesta al tratamiento con doxorubicina (panel superior) y casodex (panel inferior). B) La supervivencia de clones TOP2A de finales de paso en respuesta al tratamiento con doxorubicina (panel superior) y Casodex (panel inferior). C) Transferencia Western que muestra los niveles de TOP2A en clones estables generados de pasajes tempranos y tardíos. La detección de TBP proteína nuclear se utilizó para verificar la igualdad de carga. D) La cuantificación de la expresión TOP2A basado en Western blot en C. Los datos se presentan como media ± desviación estándar, basado en 3 experimentos independientes. Los valores de p son como se indica, N. S. no es significativa.
A continuación se probó si la destrucción de las células sería más eficaz si se aplica una combinación de estos dos fármacos. En el primer conjunto, el tratamiento con dosis constante de doxorubicina y concentraciones crecientes de Casodex no mostró ninguna ventaja en matar células con alto nivel de TOP2A en comparación con control endógeno (Fig 3A y 3B, paneles superiores). De hecho, a principios clon paso T14 mostró más resistencia a este regimiento en comparación con T25 (Fig 3A, panel superior). En contraste, el tratamiento con dosis constante de 50 uM de Casodex, la aplicación de los cuales solo resultado en 90% la supervivencia celular (Fig 2), mostró matanza más eficiente de las células de paso finales que sobreexpresan TOP2A en comparación con el paso temprano y bajo que expresa el clon de control de T33 ( la figura 3B, panel inferior). En conjunto, estos resultados sugieren que el tratamiento combinado de orientación AR y TOP2A TOP2A en células que expresan altamente pueden ser beneficiosos para los tumores avanzados
a) La supervivencia de clones TOP2A de paso temprano en la respuesta al tratamiento de combinación:. Top dosis constante en panel de la doxorrubicina y concentraciones crecientes de Casodex; dosis panel constante inferior de Casodex y concentraciones crecientes de doxorubicina. B) La supervivencia de clones TOP2A de finales de paso en respuesta a tratamiento de combinación, los fármacos y las concentraciones son como en a. Los datos se presentan como media ± desviación estándar, basado en 3 experimentos independientes. Los valores de p son como se indica, N. S. no es significativo.
Para obtener una perspectiva de interacción posible entre las acciones y TOP2A red de señalización de andrógenos A continuación comparó los niveles de AR en los clones que sobreexpresan TOP2A a las de los clones con nivel endógeno de TOP2A. Las células fueron cultivadas en medios con suero que contiene nivel no despojado de base de andrógenos sin suplementación adicional. Los niveles de proteína total AR se compararon entre T14 y T25 clones de pasajes tempranos y tardíos (figura 4A). células T14 de ambos pasajes mostraron niveles significativamente más altos de AR de las células T25 de control de juego (elevado 3 y 8 veces, respectivamente), sugiriendo una implicación de TOP2A en la inducción de la expresión de AR en el nivel de transcripción. Los niveles de proteína TOP2A permanecieron más elevados en las células T14 en cada paso tomado en el experimento (Fig 2C, S3C y S3E Fig). Para asegurar que la proteína TOP2A era funcional, se llevó a cabo el ensayo utilizando la plantilla de ADN específica TOP2A. La actividad enzimática se mide en el extracto de proteína obtenido de las células T14 era más alta que la de las células T25 (S3 FIG). Cuando se ajusta a la cantidad de proteína total, fue 6 veces mayor (Fig S3 B), en consonancia con los niveles más altos de TOP2A en comparación con las células T14 T25. actividad enzimática total se mantuvo elevada, en consonancia con los niveles más altos de proteína TOP2A, en pasajes posteriores de las células T14 (S3D FIG), lo que confirma que TOP2A se mantuvo funcional, y no había mutaciones en el sitio activo introducido en la propagación de este clon.
Western blot que muestra el nivel total de AR en los clones TOP2A de diferentes pasajes (como se indica), el panel superior. La cuantificación de la expresión del RA normalizado a nivel de beta actina, panel inferior. B) Transferencia Western que muestra la inducción del nivel de AR (arriba) tras el tratamiento de TOP2A clones.with 5 nM de R1881. Se muestra correspondiente cuantificación de los niveles TOP2A normalizadas con respecto al control de TBP carga (inferior); nt es no tratado, t es tratado; pases de células son como se indican. C) Esquema que muestra el área de promotor para
KLK3
gen (PSA) que se utiliza en el ensayo CHIP. DtFw y DtRv representan las posiciones de los cebadores directo e inverso, respectivamente, para la región distal del promotor; -positions PxFw y PxRv de cebadores directo e de promotor proximal inversa. D) análisis de clones CHIP TOP2A estimularon con 5 nM de R1881 por 3 horas. se muestran Enriquecimiento de AR y TOP2A en regiones promotoras distal y proximal del gen KLK3 (paneles superior y medio) y su ausencia en la región de gen de GAPDH (panel inferior) de codificación. M es marcador de tamaño de ADN, HG-es ADN genómico humano usado como un control positivo para la amplificación PCR, El1 y EL2 son fracciones consecutivas de elución (tampones se describen en Métodos).
TOP2A está modulando la señalización AR
No se observaron niveles más altos de AR en las células que sobreexpresan TOP2A (figura 4A). Para dilucidar el mecanismo por el cual TOP2A puede contribuir a la regulación de la transcripción, se trataron las células con andrógeno sintético R1881 y niveles nucleares en comparación de AR. AR se transloca al núcleo tras la unión para regular la transcripción de genes de respuesta [45] ligando. Hemos observado significativamente mayor nivel de AR nuclear en respuesta a la estimulación de andrógenos en TOP2A que sobreexpresan las células T14 de la primera (p.24) paso comparación con las células T25 (Fig 4B). El nivel de AR nuclear en estas células aumentó 5 veces después del tratamiento. Finales de paso células (p.55) que sobreexpresan TOP2A mostraron un nivel ligeramente más elevado de AR, no tan dramático como sus precursores en el paso 24. AR Activado reconoce y se une al elemento de respuesta a andrógenos capicúa (SON) secuencias en los genes proximales para inducir su transcripción [45,46]. Nuestros datos sugieren que TOP2A actúa con AR para activar la transcripción de genes de respuesta. Para probar formalmente se realizó la inmunoprecipitación de la cromatina utilizando una región correspondiente a los extremos proximal y distal están en el promotor del antígeno prostático específico (PSA) (gen KLK3, la figura 4C), un objetivo transcripcional bien caracterizado de la AR [46]. Anticuerpos, para TOP2A y AR, fueron capaces de capturar fragmentos de ADN que contienen corren el promotor KLK3 después del tratamiento con R1881 (figura 4D). No hubo diferencia en la unión de TOP2A o AR a AREs entre T14 y T25 clones. La unión fue específica como no reclutamiento de cualquiera de TOP2A o AR a secuencia no relacionada se observó (región de codificación del gen GAPDH se utilizó como control. Este resultado indica que al igual que su TOP2B homólogo, TOP2A es reclutado a elementos reguladores de esteroides para estimular la transcripción y sugiere acciones sinérgicas con la señalización de andrógenos en las células tumorales de próstata.
TOP2A promueve la producción de reordenamientos de ADN en células de CaP
Las grandes reordenamientos cromosómicos son comúnmente observados en el CaP [47,48] y se cree que juegan un papel en la iniciación y progresión tumoral. Mostramos aquí que en una manera similar a TOP2B, TOP2A es reclutado para ARE para estimular la transcripción. Si reiteración de este proceso resulta en la acumulación progresiva de reordenamientos de ADN no se investigó. para probar esto, par compañero se realizó la secuenciación de punto de interrupción [49,50] en diferentes pasajes de clones de alta y baja expresar TOP2A. células LNCaP parentales albergan un número de alteraciones genómicas que incluyen traslocaciones, y copiar cambios de número (S4A FIG). Las células seleccionadas después de la integración de vectores que llevan siRNA a la caspasa-3 y ADNc para TOP2A mostraron significativamente mayor número de alteraciones cromosómicas (S4B FIG). Esto no es sorprendente ya que las manipulaciones probable llevaron a la selección de células con capacidad reducida para someterse a apoptosis. clones que expresan T25 nivel endógeno de TOP2A no mostraron cambio en el número de reordenamientos genómicos con proliferación (Figs 5A y 6A). El número total de alteraciones en las células T25 de diferentes pasajes era el mismo que en las células precursoras que albergan nivel reducido de la caspasa-3 (Fig 6A). En contraste, las células T14 que sobreexpresan TOP2A demostraron acumulación progresiva de reordenamientos con el aumento de paso (figuras 5B y 6B). El propio gen TOP2A también se vio afectada en T14 de paso tardío (Tabla 1). Sin embargo, la alteración de un alelo no dio lugar a disminución significativa de la expresión de la proteína, lo que sugiere que la copia integrada exógena del gen fue principalmente conduciendo expresión.
A) fines del paso de T25 clon que expresa el nivel endógeno de TOP2A . B) fines del paso de T14 clon de sobreexpresión de TOP2A. puntos grises (recuento) muestran la frecuencia de distribución de lecturas en las ventanas de 30KB y puntos de corte para todos los cromosomas (los números se indican). El eje X se extiende por la longitud del cromosoma, el eje Y muestra el número de lecturas para cada ventana. los recuentos de la ventana se muestran de acuerdo con la predicción mediante el algoritmo CNV. puntos grises son normales, puntos rojos corresponden a las supresiones y puntos azules muestran ganancias. Las líneas conectan los puntos de interrupción bioinformatically identificados. Las anchuras de las líneas se correlacionan con el número de asociados compañero de par lee. El color de las líneas de conexión indica la polaridad del cromosoma unido. Para eventos intra-cromosómicas muestra roja dirección de avance para ambas piezas, verde indica que la inversión para una inversión de pareja y azul muestra para ambos. Para eventos inter-cromosómicas, rojo conecta la pieza del lado p del cromosoma más grande a la pieza del lado q del cromosoma más pequeño en dirección hacia delante, verde conecta la pieza del lado q del cromosoma más grande a la pieza del lado p de la cromosoma más pequeño en dirección hacia adelante, azul conecta la pieza del lado p del cromosoma más grande a la pieza del lado p del cromosoma más pequeño en dirección inversa y magenta conecta la pieza del lado q del cromosoma más grande a la pieza del lado q de la cromosoma más pequeño en dirección inversa. El color negro indica translocaciones equilibradas. puntas de flechas azules apuntan a reordenamientos de ADN seleccionados, que fueron adquiridas a la proliferación (ausente en las células correspondientes del pasaje anterior.
A) Número total de puntos de ruptura presentes en las células T25 de diferentes pasajes. LNCaP /Casp es un derivado de la línea celular LNCaP que expresan establemente siRNA para derribar caspasa 3. alteraciones B) de ADN obtenidos por TOP2A que sobreexpresan las células T14 sobre la proliferación. Los números representan alteraciones observadas en adición a los presentes en el clon de control de T25. C) Esquema que muestra propuesto papel de TOP2A en la progresión del cáncer de próstata y la resistencia a la terapia de ablación de andrógenos.
En conjunto, estos resultados indican que los cambios genómicos inducidos por los altos niveles de plomo TOP2A a la adquisición de más fenotipo agresivo y también puede contribuir al desarrollo de resistencia a los tratamientos con un único agente.
Discusión
a pesar de que la prostatectomía radical cura la mayoría de los pacientes GS 7-10, el riesgo de progresión sistémica y la muerte después de la cirugía sigue siendo más elevado de 15%. Un subgrupo de estos pacientes desarrollan enfermedad diseminada [44] y algunos, después de una mejoría inicial con la terapia de privación de andrógenos, el progreso de estado de resistencia a la castración [51]. A pesar de los avances en el tratamiento de pacientes con enfermedad resistente a la castración [52, 53], el logro de la supervivencia a largo plazo sigue siendo un problema. Comprensión de los mecanismos que subyacen a la resistencia a la ablación es crítica. Uno de los mecanismos propuestos es el desarrollo de una mayor sensibilidad a los bajos niveles de andrógenos después de la ablación debido a la amplificación AR o la elevación de su expresión [54,55]. En consonancia con esto, nuestro estudio reveló que TOP2A, con frecuencia se sobreexpresa en los casos de CaP en alto riesgo de progresión, conduce la expresión de AR. Nuestros datos sugieren que la terapia de ablación de andrógenos podría ser menos eficaz en presencia de alto nivel de proteínas TOP2A (figura 6C). Además, los experimentos de tratamiento apoyan la noción de que la terapia de combinación usando de veneno anti-andrógenos y TOP2A proporciona un beneficio más fuerte. También se muestra que la orientación TOP2A con el veneno solo es eficaz solamente en las primeras etapas, antes de cambios en el ADN TOP2A impulsada han producido (Figura 6C). De acuerdo con estos hallazgos de un estudio reciente utilizando un modelo diferente para el CP ha identificado TOP2A como un antígeno tumoral específico de recidiva [56]. tumores de próstata de ratón cuando se exponen a la inmunoterapia subóptima convertido en un fenotipo drásticamente diferente, que muestra alta expresión de TOP2A y respuesta al tratamiento anti-TOP2A. En esta etapa de la enfermedad residual mínima, las células TOP2A-positivas muestran un fenotipo de células madre similares y mostraron una mayor capacidad de invasión [56], una propiedad, característica de las células que sobreexpresan TOP2A en nuestro modelo. En otro estudio, utilizando el modelo murino singénico de metástasis espontánea CaP [57] autores demostraron que los altos niveles de TOP2A correlacionados con altos niveles de metiltransferasa Ezh2, y la orientación de ambas proteínas en combinación dio lugar a la muerte celular eficiente.
Además de el nivel y la funcionalidad de TOP2A, también se informó de la respuesta celular a sus inhibidores de depender de la actividad de otros factores. DLX4, un gen homeobox, sobreexpresa en varios tipos de cáncer [58], ha demostrado reducir la sensibilidad de las células tumorales a los venenos TOP2A mediante la estimulación de la reparación de DSB por los extremos no homólogos de unión [25]. Nuestros datos indican que este no es el caso en el CaP, como el nivel de DLX4 no aumenta con el grado del tumor, pero sigue siendo similar a la de las células epiteliales normales (S2 FIG)
.
En conjunto, estos estudios sugieren que hay una ventana de tiempo en el curso de la progresión de CaP donde la terapia anti-TOP2A podría ser particularmente eficaz. Ya sea TOP2A venenos /inhibidores o inmunoterapia tiene que ser la elección del tratamiento en la clínica que queda por determinar.
Por último, se muestra aquí que TOP2A coopera con AR para inducir la transcripción de genes diana (Figura 6C). El nivel de sí mismo AR es significativamente mayor en TOP2A que sobreexpresan las células después de la estimulación con agonista de andrógenos. Similar a su TOP2B isoforma, TOP2A es co-reclutados para ARE con AR, y es probable que activar la transcripción. Anteriormente, TOP2B también ha demostrado inducir DSB de ADN en regiones reguladoras de estrógeno y AR genes diana [35,36]. A pesar de que, en nuestro estudio no se refirió a esta posibilidad directamente, sí observamos un aumento de una serie de reordenamientos de ADN en células que sobreexpresan TOP2A sobre la proliferación. Si son el resultado de la reparación defectuosa de DSB de ADN que se producen en los elementos reguladores de la transcripción o queda por investigar más a consecuencia del exceso de la función TOP2A durante la replicación. Hemos identificado algunos genes reordenados que consideramos como "TOP2A dependiente" (Tabla 1). Sobre la base de las observaciones anteriores relacionados con la función de estos genes, los cambios en las propiedades de TOP2A que sobreexpresan las células y su sensibilidad a los tratamientos se pueden atribuir a las alteraciones en las regiones de ADN. Por ejemplo, Emi1 (FBOX5) (Tabla 1) afectada en las células T14 del último paso es un regulador conocido de la progresión mitótica [59,60]. Se ha implicado en la determinación de la sensibilidad a la doxorrubicina [61]. En ese agotamiento estudio de Emi1 llevó a aumento de la sensibilidad, de acuerdo con esto, nuestros datos sugieren que la duplicación observado en células T14 de pasaje posterior puede dar cuenta de una disminución de la sensibilidad a la doxorrubicina (Fig 2B). La interrupción del gen PARD3B, que se muestra para el control de las uniones estrechas [62], podría ser responsable de aumento de la capacidad de la motilidad y la invasión de las células T14. Reducción en la expresión o la pérdida de Tango, un homólogo de Tango6, interrumpido en TOP2A células que sobreexpresan, también se había demostrado que aumentar la migración [63]. La función de Tango6 no se ha examinado aún, si su pérdida puede tener un efecto similar sobre las propiedades células de CaP 'requiere una mayor investigación. Se necesitan más estudios para elaborar sobre la contribución exacta de los cambios genómicos funcionales adquiridos.
Materiales y Métodos
Cultivo de células y tratamientos
Los cultivos celulares se mantuvieron siguiendo las recomendaciones de la ATCC. LNCaP (ATCC) y LNCaP derivados estables se cultivaron en RPMI 1640 cultura (Gibco, Life Technologies) suplementado con 100 unidades /ml de penicilina, 1 mg /ml de estreptomicina, y 10% de FBS. Para experimentos con células de tratamiento de andrógenos se cultivaron en el mismo medio pero reemplazando el 10% de SFB con un 5% con filtro de carbón FBS (One Shot, Life Technologies) durante 48 horas antes de la adición de 5 nM R1881 (metribolona, RM10, TSZCHEM), y después de eso se incubaron durante 48 horas adicionales. Las células se recogieron por raspado y la proteína fue aislado (kit de extracto nuclear, Active Motif) para el análisis de transferencia de Western.