Extracto
El resveratrol es un agente quimiopreventivo promisorio que media muchas dianas celulares implicados en la señalización de las vías de cáncer. p53 se ha sugerido que desempeñar un papel en las propiedades contra el cáncer de resveratrol. Se investigó la citotoxicidad inducida por el resveratrol en las células H1299, que son no pequeñas células de cáncer de pulmón que tienen una deleción parcial del gen que codifica la proteína p53. Los resultados para las células H1299 se compararon con los de tres líneas celulares que expresan constitutivamente p53 de tipo salvaje: cáncer de mama MCF-7, adenocarcinomic alveolar A549 epitelio basal y el cáncer de pulmón no pequeñas H460. Ensayos de viabilidad celular revelaron que el resveratrol redujo la viabilidad de los cuatro de estas líneas celulares de una manera dosis-y dependiente del tiempo. MCF-7, células A549 y H460 eran más sensibles a resveratrol que eran células H1299 cuando se expone a la droga durante 24 h con concentraciones superiores a 100 mM. El resveratrol también aumentó los niveles de proteína p53 en células MCF-7 sin alterar los niveles de mRNA p53, lo que sugiere una modulación post-traduccional de la proteína. La citotoxicidad resveratrol inducida en estas células fue mediada en parte por p53 e implicó la activación de las caspasas 9 y 7 y la escisión de PARP. En células H1299, citotoxicidad resveratrol inducida fue menos pronunciado y (en contraste con células MCF-7) la muerte celular no fue acompañada de la activación de caspasa. Estos resultados son consistentes con la observación de que células MCF-7 fueron marcadas positivamente por TUNEL tras la exposición a 100 resveratrol mu M, mientras que las células H1299 en condiciones similares no se marcaron por TUNEL. La transfección transitoria de un gen p53-GFP de tipo salvaje causó células H1299 a ser más sensible a las propiedades pro-apoptóticos de resveratrol, de manera similar a los hallazgos en las células MCF-7 p53 positivo. Nuestros resultados sugieren una posible estrategia terapéutica basada en el uso de resveratrol para el tratamiento de tumores que son típicamente no responde a las terapias convencionales, debido a la pérdida de la función normal de p53
Visto:. Ferraz da Costa DC, Casanova FA, quarti J, Malheiros MS, Sanches D, dos Santos PS, et al. (2012) transfección transitoria de un gen p53 de tipo salvaje Triggers Resveratrol inducida por apoptosis en células cancerosas. PLoS ONE 7 (11): e48746. doi: 10.1371 /journal.pone.0048746
Editor: Waldemar Debinski, Wake Forest University, Facultad de Medicina, Estados Unidos de América
Recibido: 7 Febrero, 2012; Aceptado: 1 de octubre de 2012; Publicado: 12 Noviembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Costa et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por el Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (CNPq); Coordinación de Perfeccionamiento de Personal de Nivel Superior (CAPES); Fundación de Amparo a la Investigación del Carlos Chagas Filho do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ); y la Fundación hacer El cáncer de Brasil. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer es un importante problema de salud pública en todo el mundo, y se espera que el número de muertes relacionadas con el cáncer se duplique en los próximos 50 años [1]. La evidencia epidemiológica sugiere que los hábitos dietéticos son importantes factores de riesgo asociados con el desarrollo del cáncer y que los fitoquímicos que se encuentran de forma natural en frutas y verduras puede mediar una serie de dianas tumorales [2], [3]. Las aplicaciones clínicas se han sugerido para estas moléculas bioactivas en la dieta debido a su gran capacidad de inhibir, recuperar o retrasar varios pasos cancerígenos [4], [5], [6].
El resveratrol (3,5,4 '-trihydroxy-
trans
estilbeno), que fue descrita por primera vez en 1940, es un polifenol natural que se encuentra en una amplia variedad de plantas, incluidas las uvas, las fresas y los cacahuetes. Esta molécula ha sido clasificada como una fitoalexina porque se sintetiza por las plantas en respuesta a una variedad de condiciones de estrés ambiental tales como infecciones por hongos y la radiación UV [7], [8]. El resveratrol se encuentra tanto en
cis
y
transporte
formas estereoisómeras; la
trans
isómero es la forma que se asocia con la mayoría de las actividades biológicas de la molécula. Resveratrol como un compuesto de la dieta ha sido descrito como un poderoso agente que es capaz de prevenir las enfermedades cardiovasculares, inflamatorias y neurodegenerativas, incluyendo la obesidad y la diabetes [7], [9]. La molécula también es capaz de modular un amplio espectro de objetivos moleculares, incluyendo los que están involucrados en la señalización de cáncer de las vías de [8], [10].
El potencial contra el cáncer de resveratrol fue reconocida en 1997, cuando su capacidad para inhibir las tres etapas de la carcinogénesis (es decir, la iniciación, promoción y progresión) se demostró por primera vez [10]. Estudios posteriores han demostrado que la molécula exhibe actividad contra el cáncer cuando se probó en varios modelos experimentales [11], [12]. Varios estudios han sugerido que los mecanismos responsables de las propiedades quimiopreventivos de la molécula están estrechamente relacionados con sus propiedades antioxidantes y anti-inflamatorias [13].
El resveratrol se asocia con la regulación de múltiples vías celulares, incluyendo la inhibición de la activación de carcinógenos, la estimulación de las enzimas de desintoxicación de carcinógenos, la modulación de las proteínas que están involucrados en la progresión del cáncer y la apoptosis [14], [15], [16], y la inhibición de la angiogénesis [17]. Los estudios también sugieren que el resveratrol se puede usar para sensibilizar a los tumores a agentes quimioterapéuticos de cáncer de fármacos específicos [18]. En conjunto, estos hallazgos proporcionaron pruebas suficientes para la realización de ensayos clínicos para investigar las propiedades quimiopreventivos y quimioterapéuticos de este compuesto bioactivo [4], [12].
p53 es una proteína supresora de tumores que juega un papel esencial en la prevención de desarrollo del cáncer mediante la inducción de la detención del ciclo celular o apoptosis en respuesta a estrés genotóxico. Esta proteína está regulada principalmente por la ligasa de ubiquitina MDM2, que se une a p53 y se dirige para la degradación en proteasomas. la función de p53 normal se pierde o se inactiva en aproximadamente 50% de los cánceres humanos [19], [20], [21], [22].
Resveratrol es capaz de inducir la muerte celular dependiente de p53 en el ratón JB6 línea celular epidérmica [23], y la implicación de p53 en la función anti-cancerígenos de resveratrol se ha establecido en una amplia gama de células [7], [16], [23], [24], [25], [ ,,,0],26]. Varios estudios han indicado que la apoptosis se produce sólo en las células que expresan p53 de tipo salvaje pero no en células deficientes en p53 [23] de p53 mutado o, [27]. El papel preciso de resveratrol en líneas celulares de tumor de p53-negativos, que pueden ser resistentes a los agentes quimioterapéuticos convencionales, como resultado de la pérdida de la expresión o la función de p53, no se ha estudiado ampliamente [28], [29], [30]. Es crucial para establecer si la transfección de p53 de tipo salvaje es capaz de restaurar los efectos pro-apoptóticos de resveratrol con el propósito de evaluar nuevas técnicas de terapia génica dirigidas a fijar una molécula p53 defectuoso. Varios estudios de terapia génica de p53 han demostrado la eficacia de este enfoque no sólo en líneas de células tumorales, sino también en los ensayos clínicos [31].
En el presente estudio, se investigaron los efectos del resveratrol en una línea celular que lleva un gen p53 parcialmente eliminado, y se prueba la hipótesis de que la transfección transitoria de p53 haría que estas células se vuelvan capaces de responder a las propiedades pro-apoptóticos de resveratrol. Para investigar directamente este problema, transfectadas las células H1299, que no expresan el gen p53, y se compararon los resultados con los obtenidos en las células MCF-7 de cáncer de mama humano, una línea celular que ha sido ampliamente estudiado y que expresa constitutivamente la de tipo salvaje gen p53.
Hemos encontrado que la transfección transitoria de tipo salvaje gen p53-GFP hace que las células H1299 a ser más sensibles al resveratrol y que responda a sus propiedades pro-apoptóticas, de manera similar a los hallazgos en células MCF-7. Nuestros resultados sugieren que la aplicación de resveratrol, en combinación con otros métodos de promoción de la actividad de p53 en las células, tales como la terapia génica utilizando de tipo salvaje del gen p53 o productos químicos que restauran la función de p53, es una nueva estrategia terapéutica prometedora para el tratamiento del cáncer.
Materiales y Métodos
1. Reactivos
Todos los reactivos utilizados en este estudio fueron de grado analítico. Anexina V /yoduro de propidio kit Apoptosis ensayo, la insulina bovina, MTT (3,4,5-dimethiazol-2,5-difeniltetrazolio bromuro), óxido de fenilarsina, pifithrin-α, PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonilo), PRIMA-1, inhibidores de la proteasa cóctel (# 8340), y
transporte
resveratrol (3,5,4-trihidroxi
trans
estilbeno) fueron adquiridos de Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.). ácido okadaico y BAX péptido inhibidor (V5) eran de Roche Applied Science (Indianapolis, IN, EE.UU.). Z-VAD-FMK [Z-Val-Ala-Asp (OMe) -CH2F] era de Calbiochem (San Diego, CA, EE.UU.). Z-LEHD-FMK era de I + amp; D Systems (Minneapolis, MN, USA). DMEM (Dulbecco modificada de Eagle Medium), RPMI-1640, penicilina y estreptomicina eran de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.).
2. Cultivo de células
línea celular de carcinoma de mama humano MCF-7 (p53 de tipo salvaje), línea celular de carcinoma de pulmón no microcítico humano H1299 (p53 negativo), adenocarcinomic A549 línea de células epiteliales basales humanos alveolar (p53 de tipo salvaje ), y no pequeña línea celular de carcinoma de pulmón humano H460 (p53 de tipo salvaje) se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, EE.UU.). Células MCF-7 se cultivaron en DMEM que contenía 1,0 g /l de glucosa, suplementado con 2,0 g /L de HEPES, 3,7 g /L de bicarbonato sódico, suero bovino fetal 10%, y la insulina bovina 5 g /ml. H1299, células A549 y H460 se cultivaron en medio RPMI-1640 que contiene 2,0 g /l de glucosa, suplementado con 2,0 g /L de HEPES, 1,5 g /L de bicarbonato de sodio y suero bovino fetal al 10%. células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se aislaron y cultivaron como se describe anteriormente [32]. La penicilina (100 U /ml) y estreptomicina (100 mg /ml) se añadieron a placas de cultivo antes del tratamiento con resveratrol. Las células se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2.
3. MTT ensayo de viabilidad celular reducción
Las células en 70-80% de confluencia se subcultivaron en una placa de 24 pocillos y se trataron con
trans- resveratrol
diluido en DMSO durante 5 min, 24 h ó 48 h . Después se retiró el medio de cultivo, las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS), y se añadió 0,5 mg /ml de MTT. Después de 3 h a 37 ° C en una atmósfera humidificada que contiene 5% de CO
2, MTT fue cuidadosamente aspirado y el formazán producido se disolvió con 0,4 M de ácido-isopropanol. Los controles se realizaron mediante la adición de 0,5% de DMSO a las placas. La viabilidad celular se midió como la diferencia entre las absorciones a longitudes de onda de 570 vs. 650 nm [33].
4. análisis de transferencia de Western
Para preparar extractos de células enteras para el Western Blot, se retiró el medio de cultivo, y las células se lavaron dos veces con PBS y se lisaron con nitrógeno líquido en un tampón que contenía Tris-HCl 5 mM pH 7,4, 10 mM EDTA, Na 1 mM
3Vo
4, 5 mM NaF, óxido de fenilarsina 1 mM, 1 mM de ácido ocadaico, mM PMSF 1, y un cóctel inhibidor de la proteasa. Se determinó la concentración de proteínas como se ha descrito por Lowry
et al
. (1951) [34], utilizando albúmina de suero bovino como estándar. Los lisados celulares (100 g) se resolvieron mediante SDS-PAGE (10%), y las proteínas separadas se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF). Las membranas se bloquearon durante la noche a 4 ° C en solución salina tamponada con Tris que contiene 1% de Tween 20 (TBS-T) y 5% de leche sin grasa y se incubaron durante 2 h con el anticuerpo primario (1:10000). Se utilizaron los siguientes anticuerpos: anti-p53 (DO-1), anti-MDM2 (D-7), y anti-GAPDH (0411) de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, EE.UU.) y anti-caspasa 9 (# 9502), anti-caspasa 7 (# 9492), anti-PARP (# 9542), anti-fosfo-Chk2 (Thr68) (# 2661), y anti-p21 (# 2946) de Señalización celular Tecnología (San Diego, CA, EE.UU.). Las membranas se lavaron con TBS-T y se incubaron con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa (1:5000) durante 1 h. Las bandas inmunorreactivas se visualizaron mediante un sistema ECL Western Blotting de detección (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido) según las instrucciones del fabricante. GAPDH (gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa) niveles en los lisados celulares se utilizaron como control. La cuantificación densitométrica de las bandas se realizó utilizando el software ImageJ, versión 1.43r (NIH, EE.UU.).
5. reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR)
Para la determinación semi-cuantitativa de la expresión del ARNm de p53, el ARN total fue extraído y purificado a partir H1299 y células MCF-7 utilizando el Kit de Illustra RNAspin Mini (GE Healthcare , Buckinghamshire, Reino Unido), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las concentraciones de ARN se midieron usando un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE.UU.). En general, se utilizó 4 g de ARN total para la producción de ADNc con los cebadores siguientes: p53 fwd: 5'-GCT TCT TGC ATT CTG CAG GGA-3 '; p53 rev: 5'-CTT CTT TGG CTG AGA GGG GG-3 '(626bp); GAPDH fwd: ATC ATC ACC TTC CAG GAG GCG; GAPDH rev: CCT GCT TCA CCA CCT TCT TG (574bp). La cuantificación densitométrica de las bandas se determinó utilizando el software ImageJ, versión 1.43r.
6. transfección de células H1299
La larga duración p53-EGFP plásmido se obtuvo de Genscript Corp. (Piscataway, NJ, EE.UU.). Los experimentos de transfección transitoria se realizaron utilizando Fugene (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Para el análisis de GFP-p53, las células se sembraron en placas con fondo de vidrio 48 h antes del inicio del tratamiento. Las células se marcaron con 10 mg /ml Hoechst 33342 (Molecular Probes, Eugene, Oregón, EE.UU.) durante 30 minutos y se lavaron con PBS tres IME [35]. Las imágenes se recogieron usando un microscopio confocal (LSM Meta 510, Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania) y se analizaron mediante el programa de software Image Browser Zeiss LSM, versión 4,2,0121.
7. Anexina V /yoduro de propidio ensayo de apoptosis
Las células en el 70-80% de confluencia se sembraron en platos con fondo de vidrio de 24 pocillos y los ensayos se realizaron utilizando la anexina V /yoduro de propidio Apoptosis Kit de ensayo de acuerdo con las instrucciones del fabricante . Las imágenes se recogieron usando un microscopio confocal (LSM Meta 510, Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania). Para obtener las imágenes se utilizaron las siguientes longitudes de onda: anexina V-FITC (EX /EM ~488 nm /~540 nm) y yoduro de propidio (EX /EM ~495 nm /~635 nm). Las imágenes fueron analizados utilizando el programa de software Image Browser Zeiss LSM, versión 4,2,0121.
8. TUNEL ensayo
desoxinucleotidil Terminal dUTP nick fin de etiquetado transferasa mediada (TUNEL) se realizó utilizando un kit de Click-it® TUNEL Alexa Fluor ® Imaging Ensayo (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Los controles positivos fueron obtenidos por el tratamiento de células con desoxirribonucleasa I, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras se analizaron usando un microscopio de fluorescencia confocal (Carl Zeiss International, Oberkochen, Alemania). Las imágenes fueron analizados utilizando el explorador de imágenes Zeiss LSM, versión 4,2,0121.
9. El análisis estadístico
Los resultados se expresaron como la media ± error estándar de la media (S.E.M.). El análisis de datos y regresiones no lineales se realizaron utilizando el programa de software SigmaPlot (v. 10.0, Systat Inc, CA, EE.UU.) integrado con el software SigmaStat (v. 3.2, Systat Inc. CA, EE.UU.). Estudiante de
t-test
se utilizó para la comparación de medias, y
p Hotel & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
1.. Resveratrol reduce de mama humano y la viabilidad celular de cáncer de pulmón en un tiempo y dependiente de la dosis de manera
Debido a que p53 se ha sugerido que desempeñar un papel en las propiedades contra el cáncer del resveratrol, hemos probado los efectos citotóxicos de este compuesto en la MCF-7 de cáncer de mama, cáncer de pulmón A549 y H460 líneas celulares de cáncer de pulmón (que expresan p53 de tipo salvaje) y en la línea celular de cáncer de pulmón no microcítico deficientes en p53 H1299. Como se esperaba, la expresión de ARNm de p53 fue confirmada por RT-PCR en las líneas celulares p53 positivas pero no en células H1299 (datos no mostrados). Para probar si el resveratrol tuvo un efecto citotóxico, cada una de las líneas de células se cultivó con varias concentraciones de resveratrol que van desde 10 a 500 mM durante 5 min, 24 h, y 48 h. La viabilidad celular se midió por el ensayo de reducción de MTT. Resveratrol reduce MCF-7, A549, H460 y H1299 la viabilidad celular en un tiempo y manera dosis dependiente (Fig. 1). La sensibilidad de las células MCF-7, células A549 y H460 fue mayor que la de H1299, particularmente cuando las células se expusieron durante 24 h a concentraciones de resveratrol superiores a 100 mM. La exposición a 500 resveratrol mu M durante 24 o 48 h reduce la viabilidad de las células MCF-7 a casi cero (Fig. 1A). Se observaron perfiles muy similares para A549 y células H460 (Fig. 1C y 1D). En contraste, aproximadamente el 50% y el 20% de las células H1299 permanecieron viables a las 24 y 48 h, respectivamente (Fig. 1B). El vehículo DMSO (0,5%) no afectó a la viabilidad de las células de control (datos no mostrados). También hemos probado los efectos del resveratrol en las células mononucleares de sangre periférica (CMSP), una línea celular transformada menos en comparación con las líneas celulares de cáncer estudiados. Resveratrol muestra un efecto no significativo en PBMC viabilidad (Fig. S1), lo que sugiere que el efecto citotóxico de este compuesto es específico de líneas celulares de cáncer.
MCF-7 (A), H1299 (B), A549 (C), y las células H460 (D) se trataron con diversas concentraciones de
trans
-resveratrol (10-500 M) diluido en DMSO durante 5 minutos, 24 h y 48 h. La viabilidad celular se midió por el ensayo MTT. La concentración final de DMSO en el medio de cultivo era 0,5%. Los resultados (n = 4) se expresan como% del valor de control, y los datos presentados son la media ± S.E.M.
2. El resveratrol inducida por citotoxicidad en células MCF-7 está mediada por la activación de p53
Los niveles celulares de p53 se investigaron en las células MCF-7 tratadas con resveratrol. Las células se expusieron a diversas concentraciones de resveratrol durante 24 h, y los niveles de p53 y MDM2 se determinaron por análisis de transferencia de western (Fig. 2A). El resveratrol a concentraciones de 100 y 200 mM produjo un (
p Hotel & lt; 0,05) significativa aumento dependiente de la dosis en el nivel total de p53. Este aumento no fue acompañado por un aumento en el nivel celular de MDM2. La relación p53 /MDM2, como se determina por cuantificación densitométrica, reveló que los niveles elevados de p53 después de la estimulación por el resveratrol no fueron acompañados por un aumento en la degradación de proteínas MDM2 mediada. los niveles de mRNA p53 no cambiaron cuando MCF-7 células fueron tratadas con resveratrol en las mismas condiciones experimentales (Fig. 2B), lo que sugiere que el aumento de los niveles celulares de la proteína p53 no se debían a una estimulación de la expresión del gen p53.
Los efectos del resveratrol sobre p53 y MDM2 los niveles de proteína (a) y en los niveles de mRNA p53 (B) en células MCF-7. Las células se expusieron a diversas concentraciones de resveratrol o DMSO (0,5%) durante 24 h. Los niveles de proteína se determinaron por análisis de transferencia Western como se describe en Materiales y Métodos. expresión de GAPDH se utilizó como control. En los paneles A y B representan los datos de 3-5 experimentos independientes, y las intensidades de las bandas se representan gráficamente con cada grupo de imágenes. (C) MCF-7 de la viabilidad celular en presencia de la p53-inhibidor específico pifithrin-α. Las células fueron expuestas a pifithrin 30 M durante 1 h antes del tratamiento con diversas
trans
concentraciones -resveratrol (50 a 200 m). La viabilidad celular se midió por el ensayo MTT. Los resultados (n = 3) se expresan como% del control, y los datos mostrados son la media ± S.E.M. *
p
. & Lt; 0,05 en comparación con el control respectivo (de Student
t-test
) guía empresas
no se observó un aumento resveratrol mediada de los niveles de p53 cuando la exposición de las células a este compuesto por 24 h fue seguida de la eliminación de resveratrol del medio de cultivo por un período adicional de 24 h (datos no mostrados). La exposición de células MCF-7 a 200 resveratrol M promovió la fosforilación de la proteína de punto de control-2 (Chk2, una proteína implicada en varios procesos celulares, incluyendo la activación de p53 en respuesta al daño del ADN) a Thr68 (Fig. 3A) y aumentó el nivel celular de p21, que es uno de los principales genes sensible a p53 (Fig. 3B).
efectos del resveratrol en fosfo-Chk2 (a) y sobre los niveles de proteína p21 (B) en células MCF-7. Las células se expusieron a diversas concentraciones de
trans- resveratrol
o DMSO (0,5%) durante 24 h. Los niveles de proteína se determinaron por análisis de transferencia Western como se describe en Materiales y Métodos. expresión de GAPDH se utilizó como control. Los datos son representativos de 3 experimentos independientes, y las intensidades de banda se representan gráficamente con cada grupo de imágenes.
*,
p Hotel & lt; 0,05 en comparación con el control respectivo (
t de Student
) guía empresas
Para determinar si las células MCF-resveratrol inducida. -7 muerte celular está mediada por p53, el ensayo de reducción de MTT se realizó en presencia de pifithrin-α, un inhibidor de p53 específico que bloquea la transcripción de los genes p53 sensible y también bloquea la apoptosis mediada por p53 [36] (Fig. 2C ). Las células se expusieron a pifithrin-α 30 mM durante 1 h y después se trataron con varias concentraciones de resveratrol para 24 h. Se observó un mayor número de células viables en estas condiciones (Fig. 2C, barras grises) que en la ausencia de pifithrin-α (Fig. 2C, barras negras), lo que sugiere la posible implicación de p53 en la muerte celular resveratrol inducida.
también investigaron los efectos de PRIMA-1, un fármaco activador de p53, en las líneas celulares de cáncer de p53-positivos. PRIMA-1 a una concentración de 100 mM reducción de la viabilidad celular, y la combinación de este fármaco con 100 M resveratrol potenció el efecto citotóxico de resveratrol en las células MCF-7, células A549 y H460 (Fig. 4).
las células fueron expuestas durante 24 horas a 100 M
transporte
resveratrol, 100 M PRIMA-1, o 100 M
trans- resveratrol
más 100 M PRIMA-1 100 mM. Los datos representan 3 experimentos independientes.
3. El resveratrol no induce la apoptosis en las células p53 nulo H1299
Para probar si el resveratrol inducida por las células MCF-7 de la muerte celular es la apoptosis mediada, se realizó un ensayo de yoduro de anexina V /propidio. Resveratrol en 100 M inducidas externalización fosfatidilserina (un proceso que indica apoptosis), como se muestra por las células V marcada con anexina en la Figura 5. Este efecto fue abrogada en presencia de pifithrin-α, lo que indica que la apoptosis mediada por p53 se estaba produciendo en el Células. células de yoduro de propidio marcado no se detectaron en las mismas condiciones. Un ensayo de TUNEL se realizó también en las células MCF-7 y H1299. Se observó muerte celular por apoptosis inducida por resveratrol en células MCF-7, pero no en células H1299 (Fig. 6). Resveratrol inducida por apoptosis en células MCF-7 fue acompañado por una escisión proteolítica significativa de la caspasa 9 y caspasa 7 (Fig. 7A). Poli (ADP) ribosa polimerasa se escindió en dos pequeños fragmentos por la exposición a concentraciones crecientes de resveratrol. No se detectó la activación de las caspasas 9 y 7 en las células H1299 p53-negativos (Fig. 7B). Para probar la posibilidad de que la muerte celular resveratrol inducida está mediada por las vías de señalización de caspasa en células MCF-7, pero no en H1299, se realizó un ensayo de reducción de MTT en presencia del inhibidor de caspasa pan Z-VAD-FMK (Fig. 4C). Las células se expusieron a 50 mM Z-VAD-FMK durante 1 h y después se trataron con varias concentraciones de resveratrol para 24 h. El número de células viables MCF-7 fue significativamente mayor en la presencia de 100 o 200 resveratrol mu M (Fig. 7C, barras grises) que en ausencia de inhibidor (Fig. 7C, barras negras), lo que sugiere que las caspasas están implicadas en resveratrol la muerte celular inducida. Z-VAD-FMK no afectó a la viabilidad de las células H1299 en las mismas condiciones. La posible implicación de las caspasas también se investigó mediante la caspasa 9-inhibidor específico de Z-LEDH-FMK. MCF-7, pero no H1299 mostraron un mayor porcentaje de células viables en comparación con el control en presencia de Z-LEDH-FMK (Fig. S2).
Las células fueron tratadas con
trans-
resveratrol (100 mM) o DMSO (0,5%) y se ensayaron usando el anexina V /yoduro de propidio apoptosis Assay kit (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. En un experimento, las células fueron expuestas a pifithrin 30 M durante 1 h antes del tratamiento con
trans
-resveratrol. Las imágenes se recogieron por microscopía confocal (LSM Meta 510, Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania). Anexina V-FITC fluorescencia: EX /EM ~488 nm /~540 nm; y yoduro de propidio de fluorescencia: EX /EM ~495 nm /~635 nm. Cada imagen se muestra es representa dos experimentos independientes.
Las células fueron tratadas con
transporte
resveratrol (100 M) y etiquetados con una Fluor ® Imaging Ensayo de Click-it® TUNEL Alexa kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). TUNEL fluorescencia: EX /EM ~495 nm /519 nm. Cada imagen representa dos experimentos independientes.
(A) La activación de la caspasa 9, caspasa 7, y PARP por el resveratrol en células MCF-7. (B) Niveles de la caspasa 9 y caspasa 7 en H1299 células expuestas a resveratrol. Para el análisis de transferencia Western, las células se expusieron a diversas concentraciones de resveratrol. Los datos representan 3-4 experimentos independientes, y las intensidades de las bandas se representan gráficamente con cada grupo de imágenes. células MCF-7 y H1299 (C) se pre-incubaron con 50 mM del inhibidor de caspasa Z-VAD-FMK para 1 h antes del tratamiento con diversas concentraciones de
trans
-resveratrol. La viabilidad celular se midió por el ensayo MTT. Los resultados (n = 3) se expresan como% del control, y los datos mostrados son la media ± S.E.M. *
p Hotel & lt; 0,05 en comparación con el control respectivo (de Student
t-test
) guía empresas
Hemos examinado la posible participación de Bax en el resveratrol-. inducida por la apoptosis de las células MCF-7 mediante la medición de los niveles celulares de esta proteína y mediante la aplicación de un inhibidor específico Bax péptido (V5) después del tratamiento de las células con resveratrol. Hemos observado niveles más altos Bax en las células tratadas con 100 mM resveratrol y un mayor número de células viables en presencia de V5, lo que sugiere la implicación de esta proteína pro-apoptótica en la MCF-7 células cascada de muerte (Fig. S3).
4. células H1299 requieren p53 para someterse a apoptosis en respuesta a la exposición resveratrol
Para determinar si la expresión de p53 en células H1299 hace que las células a ser susceptible a los efectos del resveratrol, se realizó ensayos de transfección transitoria de p53 de tipo salvaje plásmido GFP. Un ensayo de MTT se realizó en H1299 p53 transfectadas para poner a prueba la citotoxicidad de resveratrol en estas células. Veinticuatro horas después de la transfección, las células fueron tratadas con 100 resveratrol mu M durante 24 h más. se mejoró el efecto citotóxico de resveratrol en células H1299 (es decir, las células se hicieron más susceptible a este compuesto) a través de la expresión de p53 (Fig. 8A). Los efectos del resveratrol en las células H1299, así como sobre células MCF-7 parecen ser dependientes de la función de p53 de tipo salvaje. La transfección transitoria de p53-GFP desencadena la apoptosis inducida por resveratrol en H1299 (Fig. 8B). La tasa de eficacia de transfección obtenida en estos experimentos fue de aproximadamente 60% (Fig. 8C). las imágenes fusionadas de microscopía de fluorescencia (Fig. 8D) indican que la mayoría de las células transfectadas con p53 fueron sometidas a la apoptosis (flechas blancas).
(A) p53 transfectadas y no transfectadas H1299 células fueron tratadas con resveratrol ( 100 M). La viabilidad celular se midió por el ensayo MTT. Los resultados (n = 4) se expresan como% del control, y los datos mostrados son la media ± S.E.M. *
p Hotel & lt; 0,05 en comparación con el control respectivo (de Student
t-test
). (B) Las células fueron transfectadas transitoriamente con el de larga duración p53-EGFP plásmido y se trataron con resveratrol (100 M). Las células fueron luego doble etiquetados con Hoechst 33342 (Molecular Probes, Eugene, Oregón, EE.UU.) y con Click-it® TUNEL Alexa Fluor ® Imaging Ensayo (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). fluorescencia Hoeschst: EX /EM ~ 350 nm /461 nm. TUNEL fluorescencia: EX /EM ~495 nm /519 nm. En las imágenes fusionadas, las flechas indican la muerte celular de las células p53 transfectadas. (C) La tasa de eficacia de transfección de células H1299. (D) La cuantificación de la apoptosis y la no-apoptóticos transfectaron células H1299 después de la exposición al resveratrol.
Discusión
En este estudio, hemos examinado los efectos del resveratrol en la deficientes en p53 no pequeñas humano línea celular de cáncer de pulmón H1299 en comparación con los efectos del resveratrol en las líneas celulares de cáncer (cáncer de mama humano MCF-7, A549 de células de cáncer de pulmón y H460) que expresan p53 de tipo salvaje. La hipótesis planteada fue que la transfección de p53 en células H1299, que llevan un gen p53 parcialmente eliminado, hace que estas células capaces de responder al resveratrol propiedades pro-apoptóticas. MCF-7, se encontró que las células A549 y H460 a ser más sensibles a los efectos citotóxicos de resveratrol inducida que eran células H1299. El resveratrol inducida por la apoptosis mediada por caspasa en células MCF-7, pero no en las células H1299, y transfección transitoria de p53 de tipo salvaje mostrada H1299 susceptibles a los efectos pro-apoptóticos de resveratrol.
H1299 células fueron más resistentes al resveratrol , sobre todo a altas concentraciones, que fueron las líneas celulares de cáncer de p53 positiva. La falta de expresión de p53 en H1299 puede dar cuenta de su mayor resistencia a la muerte celular en comparación con las células MCF-7 de p53-positivo. H1299 no sufrió apoptosis tras la exposición a resveratrol, en contraste con las células MCF-7. Otros mecanismos de muerte celular pueden estar relacionados con este efecto;
por ejemplo
., Un estudio reciente indica que el resveratrol activa una interacción de los procesos que ocurren durante la apoptosis, la detención del ciclo celular, y la autofagia en las células tumorales [37].
El resveratrol citotoxicidad inducida y la apoptosis estaban mediados en parte por p53 en células MCF-7, como se indica por los experimentos de viabilidad celular realizados en presencia de la p53-inhibidor específico pifithrin-α. Los niveles endógenos de proteína p53 fueron significativamente mayores en presencia de resveratrol, que está de acuerdo con otros informes [38], [39]. En el presente estudio, el aumento de los niveles de p53 no fue seguido por un aumento en los niveles de MDM2, lo que sugiere que la alta relación de p53 /MDM2 refleja un nivel de degradación de p53 dependiente de ubiquitina inferior, muy probablemente como resultado de mecanismos estabilizadores que operan en la proteína .