Extracto
Romper el equilibrio entre la proliferación y la diferenciación en células animales puede conducir al cáncer, pero los mecanismos que mantienen este equilibrio siendo en gran medida sin definir. El canal de cloruro de calcio activado A1 (CLCA1) es un miembro de la familia de cloruro sensible al calcio de conductancia de las proteínas y se expresa principalmente en el colon, el intestino delgado y el apéndice. Se demuestra que CLCA1 juega un papel funcional en la diferenciación y proliferación de células Caco-2 y del tejido intestinal. Caco-2 células se diferencian espontáneamente, ya sea en cultivo confluente o cuando se trataron con butirato, una molécula presente de forma natural en la dieta. A continuación, se compararon los niveles expressional CLCA1 entre los pacientes con y sin cáncer colorrectal (CCR) y se determinó el papel funcional de CLCA1 en la diferenciación y proliferación de células Caco-2. Hemos demostrado que: 1) CLCA1 y CLCA4 expresión se redujeron regulado de manera significativa en los pacientes con CCR; 2) la expresión CLCA1 fue hasta reguladas en las células Caco-2 inducidas a diferenciarse mediante cultivo confluente o por tratamiento con butirato sódico (NABT); 3) Desmontables de CLCA1 con siRNA diferenciación celular significativamente inhibido y promueve la proliferación celular en cultivos de células Caco-2 confluentes, y 4) En Caco-2 cultura 3D, la supresión de CLCA1 aumentó significativamente la proliferación celular y comprometida inducida por la inhibición de la proliferación NABT. En conclusión, CLCA1 puede contribuir a la promoción de la diferenciación espontánea y la reducción de la proliferación de células Caco-2 y puede ser un objetivo de la inhibición inducida por NABT de la proliferación y por lo tanto un marcador de diagnóstico potencial para el CRC pronóstico
Visto:. Yang B , Cao L, Liu B, CD McCaig, Pu J (2013) la transición de la proliferación de diferenciación en el cáncer colorrectal es regulada por el calcio activado Cloruro Canal A1. PLoS ONE 8 (4): e60861. doi: 10.1371 /journal.pone.0060861
Editor: Hiromu Suzuki, de la Universidad Médica de Sapporo, Japón
Recibido: 14 Diciembre, 2012; Aceptó 3 de marzo de 2013; Publicado: 12 Abril 2013
Derechos de Autor © 2013 Yang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por el Fondo de Dotación NHS (12/50) de LC, JP y CDM, y Amigos de anclaje a JP y CDM. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
En el intestino de los mamíferos los enterocitos se renuevan continuamente cada 4-8 días. Esto ocurre a través de una serie coordinada de acontecimientos que implican la proliferación, diferenciación y migración de las criptas intestinales hacia arriba, hacia el lumen de [1]. La alteración del equilibrio entre la división celular y la diferenciación puede conducir a enfermedades tales como el cáncer [2]. Las alteraciones del equilibrio estrechamente regulado entre los enterocitos de proliferación /menos diferenciadas y el estado no proliferativo /muy diferenciados pueden conducir a la hiperplasia, benignos (pólipos) o tumores malignos [3]. La vía de señalización Wnt es el principal mecanismo control de la proliferación de enterocitos en las criptas intestinales [4].
Canales
Ion contribuyen a tumores mediante la regulación de los procesos celulares básicos de la proliferación, la diferenciación y la apoptosis [5]. Por ejemplo, KCNK9 (canal de potasio subfamilia miembro de K 9) se sobreexpresa y contribuye a la tumorigénesis mediante la promoción de la supervivencia de células de cáncer en cáncer de mama [6]. GIRK1 (proteína G por dentro rectificación de los canales de potasio 1) la expresión aumentada en los pacientes con cáncer de pulmón 50/72 de células no pequeñas y la presencia de este ARNm se asoció con tasas de supervivencia a cinco años significativamente reducida [7]. Además, la proteína del canal TRPM8 (transitoria del receptor potencial canal catiónico subfamilia miembro de M 8) un marcador específico de la próstata fue hasta reguladas en el tejido tumoral [8]. Los estudios que describen la aparición de canales de iones individuales en las células tumorales y sus consecuencias funcionales en el crecimiento, la migración, o la invasión están aumentando [9].
En el colon, los canales de cloro (CLC) forman una familia funcional grande con estructuralmente diversos miembros que desempeñan un papel importante en la regulación de líquido epitelial y el transporte de electrolitos [10]. La activación de la corriente de cloruro a través de canales especializados de volumen regulado de aniones (VRACs) en respuesta a la celda hinchazón (I
Cl, oleo) es uno de los principales mecanismos por los cuales las células restaurar su volumen tras el estrés hipo-osmótico (RVD) [ ,,,0],11]. Esto es importante ya que existe una relación directa entre la resistencia a la apoptosis conferida por la proteína antiapoptótica Bcl-2 y el fortalecimiento de la capacidad de RVD debido a la sobre regulación de I
Cl, inflamación [12]. Además, la proteína (CLC3) del canal de cloruro 3 se encuentra entre las VRACs específico de la próstata y está regulado en células de cáncer de próstata andrógeno-independiente [13]. los canales de cloruro activada por calcio (CLCAs) se expresan también en bovino [14], de ratón [15] y humanos [16] enterocitos y hay una correlación inversa entre los niveles de canal de cloruro (CLCA1 y CLCA2) expresión y tumorigenicidad, lo que indica que actúan como supresores de mama y cáncer colorrectal [17], [18], [19]. Sin embargo, la función biológica detallada de CLCAs queda por determinar. Por lo tanto, se investigó si CLCA1 contribuye a la tumorigénesis mediante la regulación del equilibrio entre la proliferación y la diferenciación en los enterocitos.
La línea celular de cáncer intestinal humano Caco-2 es un sistema modelo bien establecido para estudiar la diferenciación celular de enterocitos humanos desde se diferencia de forma espontánea en células polarizadas con características morfológicas y bioquímicas de las pequeñas enterocitos intestinales [20]. Además, células Caco-2 también se diferencian cuando se expone al ácido graso de cadena corta fisiológicamente relevante, butirato de [19]. Los ácidos grasos de cadena cortas (AGCC), principalmente butirato, propionato y acetato, se producen en el intestino a través de la fermentación de la fibra dietética por la microbiota del colon [21]. Butirato en particular, es la fuente de energía preferida para las células de la mucosa del colon y ejerce varios efectos biológicos sobre las células de mamífero en cultivo, incluyendo la inhibición de la proliferación celular, la apoptosis y la inducción de la diferenciación [22], [23]. Debido a esto, su potencial terapéutico en el cáncer de colon se ha propuesto [23]. Células Caco-2, cuando se cultiva como una monocapa confluente o se expone a tratamiento con butirato de sodio (NABT), se diferencian para imitar fenotípicamente y epitelio del colon funcionalmente maduro y son un modelo útil para la investigación de los mecanismos moleculares de la diferenciación en CRC. Aquí, demostramos que CLCA1 (cloruro de miembro de la familia de canales de calcio activados por 1) desempeña un papel funcional en la regulación de la diferenciación y proliferación de células Caco-2.
Resultados
El descenso de regulación de CLCA1 la expresión en el cáncer colorrectal (CCR) los pacientes
en primer lugar, se determinó el nivel de expresión en humanos de los canales de cloro en tejidos normales y tumorales utilizando la base de datos de microarrays de NCBI (http: //www.ncbi.nlm.nih. gov /geo /). Los niveles de expresión de CLCN2, CLCN3, CLCA1, CLCA4 y CFTR en paciente principios de CRC se redujeron significativamente 31%, 59%, 74%, 41% y 58%, respectivamente, en comparación con mucosa colónica normal (Fig. 1A). Para confirmar aún más la baja regulación de CLCA1 en pacientes con CRC, se utilizó la tinción de inmunofluorescencia para detectar la expresión CLCA1 tanto en el CRC y tejidos intestinales normales y encontramos la expresión de CLCA1 reducido significativamente en CRC tejidos intestinales (fig. 1B). Una de las características en la tumorigénesis es la tasa de diferenciación de alta proliferación /bajo de células. Tal vez CLCA1 contribuye a la tumorigénesis mediante la regulación del equilibrio entre la proliferación y la diferenciación en los enterocitos.
A. los valores de expresión bruto normalizado de miembros de la familia de canales de cloruro se analizaron en la mucosa colónica humana y tejidos primeros CRC de Gene Expression Omnibus (serie de referencia es GSE4017). CLCA1, CLCA4, CLCN2, CLCN3 y CFTR se redujeron regulado de forma significativa en pacientes con CRC tempranas. Los valores son medias ± E.E.M, *
p Hotel & lt; 0,01. B. Análisis de inmunofluorescencia demuestra que la expresión de CLCA1 se redujo en los tejidos de CRC en contraste con la mucosa colónica normal. Bar = 50 micras.
Sobre regulación de CLCA1 inducida por butirato de sodio en células Caco-2
Un efecto pro-diferenciadora de butirato de sodio (NABT) se ha estudiado ampliamente en diversas líneas de células malignas [24], [25]. Se analizaron Ca
2 + dependiente del canal de cloruro patrones de expresión en células Caco-2 utilizando el ensayo de RT-PCR cuantitativa (qPCR). Se encontró que los niveles de expresión de CLCA1 y CLCA3 se upregulated 35 veces y más de 100 veces, respectivamente después del tratamiento 2 NABT mM durante 24 horas (Fig. 2A). Las transferencias Western, además, mostraron que el aumento de la proteína CLCA1 era dependiente del tiempo. Cuando Caco-2 células fueron tratadas con NABT durante 24 horas, la expresión CLCA1 se upregulated significativamente en comparación con el grupo sin tratamiento (Fig. 2B). Sin embargo, hubo poca o ninguna expresión de CLCA1 después de la exposición más corta (tratamientos 8 y 12 horas, Fig. 2B). Expresión de CLCA1 en monocapas no tratadas con NABT también muestran un aumento significativo a las 24 horas (en comparación con 8 y 12 horas culturas) debido a la diferenciación espontánea de células Caco-2 en cultivos confluentes (Fig. 2B). NABT también elevó la expresión de fosfatasa alcalina intestinal (ALPI) y β-catenina en células Caco-2 (Fig. 2C). Ambos son marcadores de diferenciación enterocito y están regulados positivamente en células diferenciadas. Nuestros datos sugieren que CLCA1 puede mediar la diferenciación celular inducida por cultivo confluente y por NABT en células Caco-2.
A. La expresión de mRNA CLCA1, A2, A3 y A4 se midieron utilizando RT-PCR cuantitativa. CLCA1 y CLCA3 fueron reguladas, respectivamente, en células Caco-2 después del tratamiento con NABT 2 mM durante 24 horas. Los datos se presentan como media ± S.E.M. de tres experimentos independientes, *
p
& lt; 0,01. B. Caco-2 monocapa se cultivó durante diferentes períodos de tiempo con /sin tratamiento 2 NABT mM. Expresión de CLCA1 se detectó por Western blot. En 8 y 12 horas cultivo confluente, controlar ni NABT aumentaron la expresión de CLCA1. Cuando Caco-2 monocapas se cultivaron durante 24 horas, tanto de control y de expresión NABT CLCA1 hasta reguladas, pero NABT mayor expresión CLCA1 mucho más de lo que se ve en los controles. C. NABT elevado ALPI y expresión β-catenina (marcadores de diferenciación) en cultivos confluentes de células Caco-2. Los histogramas en B y C muestran la intensidad relativa de CLCA1 90 KD, ALPI y β-catenina expresado como una proporción con respecto al control GAPDH. Todos los resultados fueron de tres experimentos independientes.
CLCA1 está regulada positivamente en una etapa temprana durante la diferenciación espontánea de células Caco-2 en el confluente Cultura y
Cultura hasta la confluencia induce la diferenciación espontánea de células Caco -2 células [19], [24], [25], [26]. Usando este modelo, nos preguntamos si CLCA1 contribuyó a la diferenciación de las células Caco-2. En primer lugar, se detectó la expresión de CLCA1 y los dos marcadores de diferenciación ALPI y sacarasa-isomaltasa (SI) en el cultivo confluente. Hemos encontrado que la expresión de CLCA1 (incluyendo los dos diferente asociada a la superficie celular subunidades 38 KD y 90 KD [16]) se detectó a niveles muy bajos en el inicio del cultivo. Sin embargo, como cultivos se hicieron confluentes, expresión CLCA1 comenzó a aumentar de una manera dependiente del tiempo. Este aumento de la expresión era evidente dentro de 1 día (Fig. 3A, 3B). La expresión de ALPI y SI también mostró un tiempo significativo dependiente de la regulación, pero esto no ocurrió hasta el día 4, a más tardar para la expresión CLCA1 (Fig. 3C, 3D). Además, se detectó también la expresión de β-catenina en diferentes días de Caco-2 cultivo confluente de células. Se encontró que la β-catenina aumentó ligeramente en Caco-2 confluentes monocapa (Fig. 3E). estudios de fraccionamiento subcelular mostraron que el aumento de la β-catenina se debió a un aumento en la fracción de membrana de β-catenina, mientras que los niveles citosólicos se mantuvo sin cambios (Fig. 4B) [27]. Estos datos sugieren que la expresión de CLCA1 puede contribuir a la diferenciación espontánea de células Caco-2.
A y B. Expresión de subunidades CLCA1 (38 KD y 90 KD) fueron reguladas hasta después de 24 horas del confluente la cultura y alcanzó un pico a los 10 días de cultivo. C. ALPI como marcador de células Caco-2 diferenciación celular fue hasta reguladas de manera significativa después de 4 días de cultivo confluente. D. Expresión de sacarasa-isomaltasa (SI), otro marcador de diferenciación celular, también se incrementó significativamente después de 4 días de cultivo confluente. E. Expresión de β-catenina se mejoró ligeramente con el tiempo en cultivo. Los histogramas en A a E muestran la intensidad relativa de CLCA1, ALPI, SI y β-catenina expresan como una proporción con respecto al control GAPDH. Todos los resultados fueron analizados a partir de tres experimentos independientes.
A. Caco-2 células fueron transfectadas transitoriamente con 0, 50, 100, 150 y 200 nM siRNA
clca1 y se transfirieron para CLCA1. siRNA
clca1 a 100 nm o por encima de CLCA1 efectivamente inhibe y regulados a la baja expresión de ALPI y β-catenina. B. Inmunofluorescencia tinción mostró la expresión de β-catenina en cultivos confluentes de células Caco-2. β-catenina se encuentra principalmente en el núcleo de las células en las primeras etapas de la cultura (2 días). Después de 10 días de cultivo, β-catenina había translocado a la membrana celular. Desmontables de CLCA1 reduce distribución de β-catenina en la membrana. C. células Caco-2 se trataron con control negativo siRNA o siRNA
clca1 y luego se cultivaron durante 72 horas. Los lisados celulares se recogieron para la detección de la actividad de ALP usando el kit de detección de fosfatasa alcalina o para la expresión ALP por Western blot. El resultado muestra que tanto la actividad de la ALP y de expresión se redujeron significativamente en células CLCA1 desmontables. Los histogramas en A mostraron la intensidad relativa de CLCA1 38 KD, 90 KD, ALPI y β-catenina expresado como una proporción con respecto al control GAPDH. Todos los resultados fueron de tres experimentos independientes. **
p
. & Lt; 0,01
CLCA1 Se Requiere Para espontánea La diferenciación de las células Caco-2
Para determinar el papel funcional de CLCA1 en células Caco-2 la diferenciación celular, que utiliza un sigilo ARN corto de interferencia (siRNA
clca1) para golpear hacia abajo la expresión de CLCA1 en células Caco-2. Después de 72 horas de la transfección, las células se ensayaron para la expresión de CLCA1, ALPI y β-catenina por Western blot (Fig. 4A). Nuestros datos mostraron que la expresión CLCA1 se downregulated en una forma dependiente de la dosis en respuesta al aumento de las concentraciones de transfección de siRNA
clca1. Para evitar efectos fuera de la meta por una mayor concentración de siRNA, elegimos 100 nM siRNA
clca1 como una concentración óptima para posteriores experimentos.
ALPI y expresión β-catenina se redujeron significativamente en caída CLCA1. Por otra parte, la imagen confocal mostró una tinción de la membrana celular reducida de β-catenina en siRNA
células clca1 desmontables (Fig. 4B). Para confirmar aún más el papel pro-diferenciación de CLCA1 en células Caco-2, se detectó la actividad de ALP usando un kit de detección de la diferenciación celular en células Caco-2. Nuestros datos demuestran que la actividad ALP fue significativamente inhibida en las células CLCA1 desmontables (Fig. 4C). Estos resultados indican que la CLCA1 juega un papel clave en la regulación de la diferenciación espontánea de células Caco-2.
CLCA1 juega un papel antiproliferativo en células Caco-2
El efecto antiproliferativo de NABT ha sido ampliamente estudiado en diversas líneas celulares malignos [25]. Para verificar si CLCA1 presentó un efecto antiproliferativo sobre las células Caco-2, cultivamos células en 3D Matrigel durante 5 días para formar colonias. Se encontró que el tamaño medio de colonias en las células Caco-2 CLCA1KD aumentó significativamente en comparación con células de tipo salvaje (p & lt; 0,01, n = 50 cada uno). Cuando las células se trataron con NABT 2 mM, el tamaño de la colonia fue significativamente inhibida en las células Caco-2, pero en CLCA1KD células con tratamiento de NABT el tamaño de las colonias no se redujo significativamente (
p
& gt; 0,05, n = 50 cada uno) (Fig. 5A). Estos resultados indican que el efecto antiproliferativo de NABT podría estar mediada por CLCA1. Para confirmar aún más el efecto de CLCA1 sobre la proliferación, se evaluó a través de este ethynyldeoxyuridine incorporación (EDU) en células Caco-2. Se encontró que la proliferación de células Caco-2 se redujo en cultivos confluentes de 3 días. Sin embargo, la proliferación de células Caco-2 se promovió significativamente en siRNA
células tratadas clca1 en comparación con un control de las células negativas siRNA (
p
& lt; 0,01, n = 100 cada uno) (Fig 5B.). Junto con la cultura en 3D, estos resultados muestran que la expresión de CLCA1 contribuye a la regulación de la proliferación en células Caco-2.
A. Caco-2 células, ya sea tratado por control negativo siRNA, o con CLCA1 siRNA solo, o con adición de NABT se sembraron en el 25% de Matrigel y se mantuvo en 5% de CO
2 y 37 ° C durante 5 días. El diámetro de los quistes se midió y se analizó usando software Metamoph. El tamaño medio de colonia en 2 Caco-células CLCA1 desmontables aumentó significativamente en comparación con las células de control. NABT inhibió significativamente el tamaño de las colonias, pero desmontables de CLCA1 comprometida reducción inducida por NABT del tamaño de la colonia. Aumentos del objetivo es de 10 ×. 50 quistes se midieron en cada grupo en un experimento. B. Las células Caco-2 fueron tratados con el control negativo o CLCA1 siRNA y se cultivaron durante los días indicados. La proliferación celular se detectó con ensayo de incorporación de edu. EdU se visualizó utilizando Alexa Fluor 594 (rojo) y el ADN de DAPI (azul). El histograma presenta la UDE% positiva de células en los diferentes grupos, y muestra que desmontables de CLCA1 aumentó significativamente la proliferación celular.
Los valores P
se muestran en el histograma. N = 100 en cada grupo en un experimento. Barra de escala = 100 micras en A, 50 micras de B. Los resultados se muestran como media ± SEM de tres experimentos independientes.
Discusión
La proliferación de transición diferenciación (PDT ) es un paso crítico en la renovación continua de un epitelio intestinal normal de las células [1] y epiteliales de colon son algunos de los modelos mejor estudiados de la tumorigénesis ya que su constante renovación requiere una estrecha regulación del PDT [3], [28]. Muchas lesiones genéticas, incluyendo la mutación de APC y p53, producen la transformación neoplásica del enterocito colon. Además, durante la organogénesis, las células madre ejecutan el silenciamiento de genes de proliferación y la activación de genes de diferenciación de una manera temporal paso a paso. importantes conocimientos sobre las moléculas que pueden servir como objetivos para la terapia se habría obtenido con una plena comprensión de los mecanismos moleculares de estos procesos. Aquí, encontramos que el calcio activado CLCA1 canal de cloruro juega un papel crucial en la regulación y el mantenimiento de la TFD en el enterocito de colon, ya que la pérdida de CLCA1 condujo a la reversión de las células a un estado de bajo diferenciada.
CLCA1 Regula la TFD en células epiteliales intestinales
El PDT de células progenitoras solo está estrechamente regulada por morfógenos, factores de crecimiento y hormonas [29] y las alteraciones moleculares a componentes específicos de las vías de señalización utilizados por estas diferentes clases de moléculas que son importantes durante el desarrollo del cáncer [30]. De estos cambios, la regulación al alza de los inhibidores de CDK (CKI) p21
Cip1 /WAF1 y p27
Kip1 en muchas células que se diferencian terminalmente [31], la señalización Wnt /β-catenina inducir la diferenciación de las células musculares [32], SOX9 dependiente PKCa se ha informado de la represión que favorece la proliferación y la inhibición de la diferenciación [33]. Nuestro estudio anterior ha demostrado que CLC-2, CLC-4 (canal de cloruro 2 y 4) y CFTR (regulador de transmembrana de la fibrosis quística, un canal de cloruro) se expresaron en niveles significativamente más altos en los tejidos de la córnea humana recién aisladas que en las células epiteliales cultivadas ( cultivo primario o una línea celular) [34]. Como el número de células de capas aumenta, la intensidad de la tinción nivel de expresión de genes y proteínas de CLCA2 (miembro de canal de cloruro activado por calcio 2) se incrementó significativamente [35]. Esto indica que los CACs (canales de cloro) pueden contribuir a la regulación de la diferenciación en el desarrollo de los tejidos epiteliales. Además, la actividad de Cl
- canales varía con el ciclo celular y la pérdida de los canales de cloruro de calcio activado permita una ventaja significativa el crecimiento de las células tumorales [14], [15], [35], [36], [37]. En CRC, CLCA1 y CLCA2 se downregulated significativamente en aproximadamente el 80% de los pacientes [19]. La pérdida de expresión de ambos mCLCA1 y mCLCA2 durante la tumorigénesis sugirió que una fuerte activación de cualquiera podría inhibir la supervivencia de las células tumorales [16]. CLCA2 es necesario para la diferenciación del epitelio, y su pérdida durante la progresión del tumor contribuye a la metástasis [38]. La proliferación células Caco-2 iniciar espontáneamente el proceso de diferenciación cuando las células han alcanzado la confluencia. Este programa de diferenciación celular se inicia tras el contacto célula-célula y el interruptor de la proliferación de diferenciación pueden ser desencadenadas por eventos bioquímicos específicos que incluyen mediada por E-cadherina adhesión célula-célula [20]. Los canales de cloruro son proteína de la membrana y pueden desempeñar un papel importante en la comunicación célula-célula después de la adhesión célula-célula. En conjunto, esto implica que los CLCAs podrían desempeñar un papel funcional en la tumorigénesis a través de controlar el equilibrio proliferación y la diferenciación.
El precursor CLCA1 es de aproximadamente 900 aminoácidos de longitud con un sitio de escisión proteolítica después de la secuencia señal amino-terminal. Eventualmente, dos productos de una 90-kDa y un 30 a 40-kDa desempeñan papeles funcionales [15], [16], [36], [37]. CLCA1 está estrechamente correlacionada con la transcripción de c-
myc, España un proto-oncogen cuyo producto está íntimamente involucrado en la regulación de la proliferación celular y la apoptosis [39]. En este estudio, encontramos el uso de microarrays que la expresión de CLC2, CLC3, CLCA1, CLCA4 y CFTR se redujeron regulado de forma significativa en pacientes con CRC primeros y esta expresión reducida de CLCA1 fue confirmada por tinción de inmunofluorescencia de tejido de pacientes con CRC (Fig. 1 ). Además,
in vitro
demostramos que CLCA1 estaba involucrado en la regulación de la diferenciación y proliferación de células Caco-2. Cuando CLCA1 en células Caco-2 se inhibió con siRNA
clca1, tanto NABT inducida y la diferenciación espontánea se redujo significativamente (Fig. 4), mientras que la proliferación se incrementó significativamente (Fig. 5). Estos datos sugieren que la activación de CLCA1 puede ser crucial en el mantenimiento del equilibrio entre la diferenciación y proliferación de los enterocitos.
Además, la alta especificidad de tejido de la transcripción de algunos CLC [40], inicialmente sugirió que la detección de su mRNA en tejidos específicos podrían ser útiles para el diagnóstico precoz, estadificación molecular, y la vigilancia postoperatoria [19]. Es importante destacar que, nuestros datos muestran que la transcripción inadecuado de los canales de cloro no sólo incluye CLCA1, sino también CLC2, CLC3, CLCA4 y CFTR, lo que indica que los defectos de cloruro de transporte o de corriente de cloruro pueden jugar un papel clave en el CCR. La activación de corriente de cloruro a través de canales de aniones de volumen regulado especializados (VRACs) es uno de los principales mecanismos por los que las células restaurar su volumen tras el estrés hipo-osmótico (RVD) [11], mientras que el transporte transepitelial de cloruro también contribuye a la potencial transepitelial diferencia (TEP) en el intestino [41]. El TEP es una propiedad inherente de los epitelios transporte y surge de gradientes de iones transportados direccionalmente a través de capas de células epiteliales. Al otro lado de intestino humano, hay un TEP de -25 ± 7 mV, Lumen negativo. Será interesante para probar la nueva noción de que el TEP puede desempeñar un papel regulador en el control de PDT y tumourgenesis del intestino.
β-catenina está implicada en la proliferación celular CLCA1 impulsada y Diferenciación
La vía Wnt está altamente conservada en todo el mundo animal [4]. β-catenina es una molécula central en la vía Wnt canónica que regula la diferenciación del epitelio intestinal [4], [42], [43]. Además, la β-catenina /TCF (factor de células T) vía también regula la proliferación de células epiteliales del colon [33]. En las células de mioblastos de ratón C2C12, Wnt de señalización a través de β-catenina puede actuar como un interruptor molecular que regula la transición de la proliferación de las células a la diferenciación miogénica [44]. Además la mayoría de los casos de CCR surgen de mutaciones que inactivan la poliposis adenomatosa coli (
APC
) gen, que controla la degradación de β-catenina [28], [45], [46]. En conjunto, esto sugiere que la vía de β-catenina desempeña un papel clave en la PDT. En Caco-2 cultivos confluentes, medida que se diferencian, β-catenina mostró un aumento dependiente del tiempo en la membrana celular (Fig. 3) [27] y cuando CLCA1 fue derribado, β-catenina se había reducido regulado de manera espectacular en la membrana celular (Fig. 4). Nuestros datos implica que β-catenina está implicada en la cascada de eventos que conducen a la diferenciación y esto se debe a la activación CLCA1 en células Caco-2.
CLCA1 como un destino de butirato en Pro-diferenciación y Anti-proliferación
el butirato es uno de los ácidos grasos de cadena corta (AGCC más abundantes) y juega un papel clave en la homeostasis del epitelio del colon. Se oxida a acetil CoA en la mitocondria y representa el principal combustible para los enterocitos normales [47], [48], así como para las células de cáncer de colon [49]. En las células de cáncer de colon humano, butirato inhibe el crecimiento celular [49], [50], [51] y promueve la diferenciación celular [52]. Además, la diferenciación inducida por butirato de las células PC12 a células cromafines implica apretado la adhesión celular y la inducción de proteínas de adhesión celular extracelulares [53]. Se han observado efectos anticancerígenos de butirato usando líneas celulares de carcinoma
in vitro
. En estos modelos, butirato conduce a la inhibición de la proliferación, la inducción de la apoptosis, o la diferenciación de células tumorales [54], [55], [56], [57]. Además, se han descrito muchos mecanismos de los efectos anticancerígenos de butirato, por ejemplo, es un inhibidor de la histona deacetilasa [58], [59], [60], [61], aumenta la p21 (
WAF1
) la expresión génica y induce la detención del ciclo celular G1 [62]. El butirato también regula a la baja la clave de apoptosis y la angiogénesis regulador neuropilina-1 (NRP-1) para inhibir la migración de células tumorales y la supervivencia en cáncer de colon [63]. Además, butryrate dysregulates proteínas de la familia Bcl2 [64], [65], induce la expresión GPR109A y la activación del receptor para provocar células específicas de la apoptosis tumoral [66], y modula la señalización Wnt canónica [67]. El butirato también aumenta la diferenciación de células de cáncer de colon humano LIM2537, disminuye la actividad de GSK-3β y aumenta los niveles de tanto unida a la membrana y Apc /Axin /piscinas de complejos asociados GSK-3ß de β-catenina [39]. El butirato es reconocida por su potencial para actuar en la quimioprevención secundaria [68]. Nuestros resultados indican que CLCA1 como un objetivo de butirato, a regular de manera efectiva a favor de la diferenciación y la prevención de la proliferación de células Caco-2 (Fig. 2 y 5).
En resumen, nos revelan un nuevo mecanismo que regula CLCA1 el /β-catenina vía impulsada diferenciación espontánea y butirato inducida de los enterocitos. Esto indica que CLCA1 puede controlar PDT de enterocito y por lo tanto actuar como un supresor de tumor en la tumorigénesis colorrectal. La pérdida de expresión CLCA1 inhibe la diferenciación de los enterocitos y puede conducir al desarrollo de cáncer de colon. Por lo tanto, una mejor comprensión del fenotipo CLCA1 en el epitelio del colon y los mecanismos de pérdida de la expresión subyacentes en carcinomas puede proporcionar un medio de intervención terapéutica a través de la reversión de la progresión de la carcinogénesis colorrectal humano.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética tejidos
el colon y recto se obtuvieron de la cirugía de los pacientes en el Departamento de cirugía general, hospital de PLA 309a, Beijing, china. La aprobación ética para el estudio fue concedida por el Hospital 309a del Comité de Ética de PLA. Consentimiento informado, se obtuvo de todos los participantes involucrados en el estudio.
Cell Cultura y
células Caco-2 (ATCC, HTB-37) fueron cultivadas en la Dulbecco Modificado Medio Eagle (DMEM) (Invitrogen , Reino Unido), suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 2 mM L-glutamina, aminoácidos no esenciales, 50 U /ml de penicilina y 50 mg /ml de estreptomicina a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%. butirato sódico se adquirió de Sigma-Aldrich, Reino Unido.
Desmontables de CLCA1 con siRNA
Desmontables de CLCA1 se lleva a cabo utilizando BLOCK-iT ™ RNAi expreso motor de búsqueda (Invitrogen, Reino Unido). Stealth RNAi ™ siRNA dúplex con secuencias de sentido 5'-capítulo CAAUGCUACCCUGCCUCCAAUUACA-3 'se presentó en una explosión de búsqueda de bibliotecas EST humanos para asegurar que otros genes humanos no fueron atacados. En breve, las células se cultivaron en DMEM que contenía 10% de FBS sin antibióticos un día antes de la transfección. células Caco-2 a continuación, fueron transfectadas con siRNAs CLCA1 específicos usando lipofectamina 2000 diluidos en Opti-MEM I medio de acuerdo con el protocolo del fabricante (Invitrogen, Reino Unido) con una concentración final de siRNA 50-200 nM para la optimización de siRNA transfección. No la orientación de control negativo siRNA se utilizó para los efectos no específicos de la secuencia de estas moléculas. Durante 10 cultivos en monocapa día, 5 cubreobjetos × 10
4 células se sembraron en colágeno I Pre-recubrimiento o placas de 12 pocillos. 100 nM de ARNsi dúplex se transfectó en la 2
ª y 6
º día de la cultura. Después de 10 días en cultivo, las células en cubreobjetos se fijaron y células en placa de 12 pocillos se lisaron por Western blot.
PCR cuantitativa
Caco-2 células fueron cultivadas en DMEM con /sin tratamiento 2 NABT mM durante 24 horas a 37 ° C con 5% de CO
2. El ARN total se aisló usando reactivo TRIzol® (Invitrogen, Reino Unido). El ADNc se sintetizó con células superíndice ™ III directa cDNA Synthesis System (Invitrogen, Reino Unido). El nivel de expresión de CLCA1, CLCA2, CLCA3 y ARNm CLCA4 se determinaron utilizando la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (qPCR). Los cebadores de PCR fueron diseñados utilizando Primer3 en línea [34]. CLCA1 humana, secuencias CLCA2, CLCA3 mRNA y CLCA4 fueron descargados desde el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) GenBank. Regiones que coinciden con la secuencia consenso para CLCA1, CLCA2, CLCA3 y CLCA4 fueron elegidos para cebadores de PCR (Tabla 1). Los cebadores fueron elegidos para ser 20 pb de longitud, con un contenido de GC de 55% y no hay largas repeticiones de una sola base. 01:05 diluida cDNA se utilizó para ejecutar qPCR (SYBR verde, Roche, Suiza) el LightCycler®
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sistema.