Extracto
El principal objetivo del presente trabajo fue investigar el efecto potencial del extracto de acetona de
Ficus religosa
hoja (FAE) en múltiples señalización de apoptosis en células de cáncer de mama humano. tratamiento FAE dosis y dependiente del tiempo inducida significativamente, la inhibición irreversible del crecimiento de células de cáncer de mama con una toxicidad moderada a las células epiteliales de mama normales. Esta observación fue validada utilizando el ensayo Sulforodamina B. Análisis del ciclo celular por citometría de flujo mostró la detención del ciclo celular en la fase G1 y la inducción de pico sub-G0. FAE induce la condensación de la cromatina y muestra un aumento de la población apoptótica en Anexina V-FITC /PI (isotiocianato de fluoresceína /yoduro de propidio) doble tinción. FAE estimuló la pérdida de potencial de membrana mitocondrial en múltiples líneas celulares de cáncer de mama en comparación con las células diploides normales. Para entender el papel de Bax en la apoptosis inducida por la FAE, se empleó una plataforma basada en células sensibles de las células MCF-7 células que expresan Bax-EGFP. Bax translocación a la mitocondria fue acompañado por la alteración de la membrana elevación potencial y marcado mitocondrial en la actividad LEHDase (caspasa 9). De acuerdo con estos datos, FAE inducida por la activación de la caspasa como se evidencia por el cambio en relación sensor FRET caspasa expresar MCF-7 línea celular y la escisión de las caspasas prominentes y PARP. Curiosamente, FAE acelera la muerte celular en una forma dependiente de la mitocondria en el modo de imágenes de células vivas continua que indica su posible efecto fotosensibilizante. generación intracelular de especies reactivas de oxígeno (ROS) por FAE jugó un papel crítico en la mediación de la muerte celular por apoptosis y la actividad fotosensibilizante. dosis inducida FAE y la inhibición dependiente del tiempo de crecimiento de células cancerosas que se asoció con la translocación y las mitocondrias Bax apoptosis mediada con la activación de la caspasa 9 dependiente cascada de caspasas. FAE también poseía fuerte efecto fotosensibilizante en la línea celular de cáncer que fue mediado a través de la rápida pérdida de potencial de membrana mitocondrial y la generación que implica la activación de la caspasa parcial de ROS intracelulares
Visto:. Haneef J, MP, Thankayyan R SK, Sithul H, Sreeharshan S (2012) Bax translocación mediada por apoptosis mitocondrial y la caspasa dependiente fotosensibilizante Efecto de
Ficus religiosa
en las células cancerosas. PLoS ONE 7 (7): e40055. doi: 10.1371 /journal.pone.0040055
Editor: Venugopalan Cheriyath, Texas A & amp; M University, Estados Unidos de América
Recibido: 2 de noviembre de 2011; Aceptado: 4 Junio 2012; Publicado: 6 Julio 2012
Derechos de Autor © 2012 Haneef et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Universidad Comisión de subvenciones (UGC) y el Consejo de Investigación Científica e Industrial (CSIR), Gobierno de la India, como senior becas de investigación para el Dr. Haneef y el Dr. Parvathy M, respectivamente. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
plantas de hierbas y medicinas derivadas de plantas han sido ampliamente utilizados en las culturas tradicionales en todo el mundo y han ganado popularidad en la sociedad moderna como alternativas naturales para producir nuevos compuestos terapéuticos potenciales para la lucha contra las enfermedades [1]. La promoción de la salud efectos de los componentes y extractos de plantas están siendo cada vez más estudiada y su consumo va en aumento [2]. Muchas hierbas han sido evaluadas en estudios clínicos y en la actualidad están siendo investigados fitoquímicamente para entender sus acciones tumoricida contra varios tipos de cáncer. Desafortunadamente, la mayoría de los estudios se llevaron a cabo en las moléculas individuales que se encontraron a ser menos eficaces como agentes quimiopreventivos en comparación con cócteles fitoquímicos que pueden inducir su actividad por sinergismo [3].
Los estudios farmacológicos llevado a cabo en el fresco materiales centrales de
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proporcionan un apoyo pragmático por sus numerosos usos tradicionales. Su corteza, frutos, hojas, raíces adventicias, látex y semillas se usan con fines medicinales en diferentes formas, a veces en combinación con otras hierbas [4]. investigación fitoquímico lleva a cabo en
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había conducido al aislamiento de los fitosteroles, aminoácidos, furanocumarinas, flavonoides, componentes fenólicos, hidrocarburos, alcoholes alifáticos, los componentes volátiles y algunas otras clases de metabolitos secundarios, taninos, esteroides , alcaloides y β-sitosteril-d-glucósido, la vitamina K, n-octacosanol, oleanolate metilo, lanosterol, estigmasterol, lupen-3-ona [5], [6]. Singh
et al
[7] habían sugerido una investigación detallada por su potencial contra el cáncer, enfermedades cardiovasculares, inflamatorias neuro, neuropsiquiátricos, trastornos relacionados con el estrés oxidativo y las infecciones parasitarias. La mayoría de los estudios farmacológicos fueron dirigidos en la validación de sus usos tradicionales para la curación de la herida [8], [9], anti-bacteriana [10], anti-convulsivo [11], anti-diabética [12], anti-oxidante [13] , anti-inflamatoria [14], la actividad de la acetil colinesterasa inhibitoria [15] y la actividad anti-ansiedad [16]. El extracto metanólico de
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hoja ejerce fuerte efecto neuroprotector frente a la inflamación causada por mediadores tales como óxido nítrico y citoquinas en LPS (lipopolisacárido) estimulada microglia a través de la MAPK (proteína kinasa activada por mitógeno) vía [17] .
Ficus
mostraron tener actividad anti proliferativa en líneas celulares tumorales y sus diversas partes han mostrado efectos apoptóticos, proporcionando con ello un apoyo farmacológico preliminar para su uso como medicamento contra el cáncer [18] . Hasta la fecha, no existe literatura y la evidencia experimental están disponibles para probatorias de la lucha contra el cáncer y el efecto apoptótico de
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extractos de hojas de múltiples células de cáncer de mama. Esto nos llevó a investigar el posible mecanismo de su actividad promotora de la apoptosis y para identificar la actividad biológica adicional, si lo hay.
ciclo celular es un proceso que actúa como una clave para controlar el crecimiento y la proliferación de una célula. La interrupción del proceso del ciclo celular causará un desequilibrio entre la proliferación celular y la muerte celular, que posteriormente conducen al desarrollo del cáncer. Por lo tanto, el ciclo celular puede servir como diana para agentes contra el cáncer para detener la proliferación incontrolada de las células tumorales y para iniciar a someterse a la apoptosis [19]. El proceso de apoptosis (o muerte celular programada) es un mecanismo importante en la respuesta citotóxica tratamiento y su inducción es un muy deseable
modus operandi
para un agente contra el cáncer [20]. Uno de los retos en el tratamiento del cáncer es que las células malignas poseen la capacidad de evadir la apoptosis, que es la principal causa de la ineficacia de cualquier fármaco citotóxico para matar tales células. El presente estudio muestra el efecto del extracto de acetona de
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hojas en la inhibición dosis y el crecimiento dependiente del tiempo de múltiples líneas celulares de cáncer de mama que se asoció con la translocación y las mitocondrias Bax apoptosis mediada con la activación de la caspasa 9 vía dependiente. A pesar de que FAE inducida por la activación de la caspasa significativa tanto en ensayo enzimático, así como en modelos de células sensor de caspasa de células vivas, la exposición continua de las células tratadas reveló una actividad fotosensibilizante inesperado. Este estudio es importante porque es el primer informe que proporciona evidencia para demostrar que los componentes de bio-disponible de
fotosensibilizante F.religiosa
ejercen extracto de la hoja y la capacidad de inducir la apoptosis a través de la generación de ROS intracelulares.
resultados
Análisis fitoquímico
el extracto de acetona en bruto recién preparada de
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hojas (FAE) se ensayó cualitativamente la presencia de alcaloides, flavonoides, fenoles y taninos, saponinas ( Tabla 1) usando procedimientos estándar de análisis [21]. método colorimétrico de cloruro de aluminio se utiliza para la estimación de los flavonoides [22]. El contenido de flavonoides en el extracto en términos de quercetina equivalente fue de 79 ± 4 mg /g de polvo seco FAE. Los fenoles totales estimados por el método de Folin Ciocalteu [23] en términos de equivalente de ácido gálico fue de 110 ± 2,18 mg /g en el polvo de extracto.
FAE inhibió la proliferación de líneas celulares de cáncer de mama
el efecto anti-proliferativo de FAE en el crecimiento de las células epiteliales mamarias, MCF-10A, MCF-7, células MDAMB231, T47D y SKBR3 se determinó inicialmente por MTT (3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, bromuro de 5-difeniltetrazolio) de ensayo y la citotoxicidad por el ensayo de exclusión de colorante azul de tripano. Las células se trataron con concentraciones crecientes de FAE (20-320 mg /ml) durante 24, 48 y 72 h. FAE inhibió el crecimiento de células de cáncer de mama en una dosis y manera dependiente del tiempo (Figura 1A). IC
50 valor para cada líneas celulares determinados a partir de los datos de MTT son - 363,6 g /ml (células epiteliales mamarias), 800 g /ml (MCF10A), 83,3 mg /ml (MCF-7), 121,2 mg /ml ( MDAMB231), 81,6 g /ml (T47D) y 75,47 g /ml (SKBR3). En las dos células epiteliales mamarias no tumorigénicas, FAE mostró citotoxicidad moderada que las células de cáncer. Un ensayo basado en proteína sulforodamina B se realizó también que fundamenta los resultados de MTT (Figura 1B). Estos resultados sugieren que FAE mostró una gran selectividad hacia las células de cáncer que las células normales. Además, la observación microscópica de la morfología celular reveló que el tratamiento con FAE indujo alteraciones de la morfología notables, incluyendo la formación de ampollas de la membrana y la contracción de las células aparte de la reducción de la densidad celular de una manera dependiente del tiempo (Figura 1E) que era consistente con los datos de tinte azul de tripan exclusión ( Figura 1C). Hemos realizado ensayo de supervivencia de células clonogénicas para evaluar el efecto de FAE en la formación de colonias. tratamiento FAE disminuyó significativamente el número de colonias de una manera dependiente de la dosis en células MCF-7 (Figura 1D).
(A) MCF-7 proliferación celular se evaluó mediante células MTT assay- fueron tratados con 20, 40 , 80, 160 y 320 g /ml de FAE para 48 h. IC
50 valor para cada líneas celulares determinados a partir de los datos de MTT son- 363,6 g /ml (células epiteliales mamarias), 800 g /ml (MCF10A), 83,3 mg /ml (MCF-7), 121,2 g /ml ( MDAMB231), 81,6 g /ml (T47D) y 75,47 g /ml (SKBR3). (B) La citotoxicidad se determinó usando un ensayo de viabilidad La viabilidad celular a base de proteínas de ensayo Sulforodamina B (C) por el ensayo de exclusión de colorante azul de tripano, MCF-7 células fueron tratadas con IC
50 de FAE para 24, 48 y 72 h. Los datos mostrados representan media ± SD de tres experimentos independientes. (D) FAE inhibe la formación de colonias de células de cáncer de mama. MCF-7 células fueron sembradas en placas de seis pocillos a 500 células /pocillo en DMEM libre de fenol rojo que contiene 10% de FBS. Después de 12 h, las células se trataron con diferentes concentraciones de FAE. El medio con FAE se cambió después cada 4 días. Después de 14 días de incubación, las colonias se tiñeron con solución de cristal violeta 0,3% durante 2 minutos, se lavaron con PBS, y se contaron secaron al aire. Cada experimento se realizó por triplicado. (E) La inhibición del crecimiento y cambios morfológicos de las células MCF-7 tratadas en IC
50 valor de FAE para 24, 48 y 72 h, en comparación con las células no tratadas. Las células se fotografiaron con un microscopio invertido Leica DMIL (200 ×).
FAE provocó leve detención del ciclo celular y Sub-Go inducción
Ensayos de viabilidad celular confirmaron la capacidad de los FAE para inhibir MCF-7 el crecimiento celular. Análisis del ciclo celular utilizando citometría de flujo se llevó a cabo para determinar si la inhibición inducida por FAE de MCF-7 crecimiento celular fue el resultado de la inducción de la apoptosis o la detención del ciclo celular o la activación simultánea de estos dos modos. Un histograma representante, junto con datos adjunta se da (Figuras 2 A y B). Los resultados revelaron que el tratamiento FAE a 100 mg /ml durante 24, 48 y 72 h indujo un aumento dependiente de la dosis y el tiempo en el porcentaje de células en G sub
0 fase, que estuvo acompañado por una reducción correspondiente en el porcentaje de las células en S y G
2 /M fase. En 24 h de exposición, no hubo alteración considerable en la distribución de fase del ciclo celular. El tratamiento con FAE durante 48 y 72 h aumentó la población celular de G
1 fases para el 60,4% y 58,3%, respectivamente, en comparación con el control de 56,6% (Figuras 2 A y B). Todos estos resultados indican que la FAE inducida leve G
1 fase de la detención y la inducción de la sub-Go población. Todos los valores se obtuvieron a partir de tres experimentos independientes. Las diferencias significativas de valor de control se indican mediante * (p & lt; 0,05), ** (p & lt; 0,01) o *** (p & lt; 0,001).
MCF-7 células fueron cultivadas con FAE a 100 g /valor ml para 24, 48 y 72 h y la distribución de fase del ciclo celular se determinó mediante tinción con PI y se analizó usando software Diva BD (a). El porcentaje de fases del ciclo celular se muestran en el histograma (B).
FAE inducida por condensación de la cromatina y la apoptosis
Hoechst 33342 tinción de las células MCF-7 tratadas con FAE en IC
50 para 24, 36 y 48 h también mostraron la aparición de cambios apoptóticos característicos tales como la condensación de la cromatina nuclear (Figura 3A). apoptosis inducida FAE se confirmó además por Anexina V-FITC /PI tinción doble. Los cambios celulares implicados en el proceso de la apoptosis incluyen la pérdida de asimetría de fosfolípidos. En el inicio de la apoptosis, la fosfatidilserina, que se encuentra normalmente en la capa interna de la membrana plasmática, se convierte en translocado al exterior. La Anexina V-FITC se puede unir a la fosfatidilserina expuesta en la superficie de la membrana plasmática [24]. Anexina V-positivo /negativo células PI se consideraron temprana de apoptosis, las células positivas anexina V y PI positivas fueron apoptótica tardía o necrótico. No hubo un incremento importante en la población celular apoptótica temprana o tardía en 24 h de tratamiento con FAE (Figura 3B). Sin embargo, tras 36 h de tratamiento, el porcentaje de células apoptóticas tempranas aumentó a 16,85% en comparación con el control de 3,15%. Después de 48 h de tratamiento, la población apoptótica total se incrementó hasta 53,4% (41,4% de apoptosis temprana y 12% de apoptosis tardía, p & lt; 0,05; Figura 3C).
cambios nucleares (A) asociados con las células MCF-7 las células tratadas con IC
50 valor de FAE después de Hoechst 33342 tinción bajo Eclipse E-600 microscopio de fluorescencia (400 ×). El número de células que muestran la morfología apoptótica característica de emisión de fluorescencia brillante aumentó de una manera dependiente del tiempo. (B) Análisis de FACS a través de Anexina V-FITC /PI tinción se utilizó para observar la inducción de la apoptosis. Las células en el cuadrante inferior derecho indican Anexina-positivo /negativo PI, las primeras células apoptóticas. Las células en el cuadrante superior derecho indican Anexina-positivo /PI positivo, a finales de células apoptóticas o necróticas. (C) El porcentaje de células en proceso de apoptosis temprana y tardía en comparación con el control correspondiente en el tratamiento con FAE durante 48 h, en IC
50 valor. Cada valor representa la media ± SD de tres experimentos independientes. Diferencia significativa del valor de control se indica mediante * (p & lt; 0,05).
FAE estimulada por translocación de Bax-GFP a las mitocondrias y la pérdida de potencial transmembrana mitocondrial en una manera dependiente del tiempo
Bax es una proteína pro-apoptótica fuerte multi-dominio que reside en el citoplasma como monómero inactivo en las células sanas. Tras estímulos apoptóticos, Bax se somete a la activación conformacional que conduce a su translocación a la mitocondria. Varios estudios habían implicado previamente papel de Bax y su activación conformacional como los primeros acontecimientos que contribuyen a la liberación de citocromo c de la mitocondria y la activación de la caspasa posterior en la apoptosis inducida por fármacos intrínseca de señalización [25]. Hemos empleado una plataforma basada en células sensibles, MCF-7 células que expresan Bax-EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein) y Mito DsRed para detectar Bax translocación a la mitocondria en FAE la muerte celular inducida. Con el fin de marcar la actividad en gran número de células vivas, Camino Bio generador de imágenes se utilizó con 2 × 2 montajes como se describe [26]. La imagen representativa de células MCF-7 Bax EGFP después del tratamiento con 100 mg /ml de FAE se muestra en la Figura 4A. Como se muestra en la Figura 4B, tan pronto como a 3 h de tratamiento de drogas casi 33,3% de células mostraron patrón mitocondrial granular en las células tratadas en comparación con las células no tratadas. Antes del tratamiento EAF, el Bax-EGFP mostró patrón citosólico difuso que indica su estado monomérico. En horas más tarde, la mayoría de las células mostró patrón granular con masivos grandes oligómeros Bax en la mitocondria (Figura 4B). Una imagen de gran aumento de Bax agregados en las mitocondrias también se muestra en la Figura 4B. Hemos observado un aumento en la translocación de Bax Bax temprana sobre-expresión de las células, de manera consistente con el informe anterior que la sobre-expresión de Bax células sensibilizadas a la muerte debido a su actividad pro-apoptótica intrínseca [27]. El resultado justificó claramente que la activación de Bax temprana juega un papel crítico en la señalización de la apoptosis inducida FAE. El silenciamiento de Bax utilizando ARNsi reduce la condensación de la cromatina en FAE células tratadas en comparación con células transfectadas de secuencia revueltos (Figuras 4 ii y iii). líneas celulares de cáncer de mama adicionales tres más, habíamos utilizado, MDAMB 231, SKBr3, T47D y dos células diploides normales al perfil de actividad apoptótica de FAE. Para visualizar la condensación de la cromatina y el potencial de membrana mitocondrial de forma simultánea, las células después de tratar con 100 g /ml de FAE durante 36 h se tiñeron con colorante de potencial de membrana mitocondrial específica TMRM y tinción nuclear Hoechst 33342 como se describe [28]. Como se muestra en la Figura 5A, la mayoría de las células de cáncer de mama tratados mostraron una disminución en la intensidad TMRM lo que indica que el potencial de membrana mitocondrial se perdió que correlaciona bien con la cromatina condensada. Curiosamente tanto en células endoteliales humanas, así como células epiteliales mamarias humanas mostraron menos pérdida de intensidad TMRM y menos condensación de la cromatina de las células cancerosas. Los resultados sugieren que FAE indujo la muerte celular en la mayoría de las células de cáncer de mama con la pérdida de potencial de membrana mitocondrial y la condensación de la cromatina. Las células diploides normales en proliferación eran relativamente resistentes a la muerte celular apoptótica inducida por FAE. Sin embargo, también mostró una diferencia en la fluorescencia TMRM en comparación con las células no tratadas, lo que indica que la permeabilidad de la membrana mitocondrial se altera.
MCF-7 células (A) que expresan Bax EGFP y Mito DsRed se sembraron en 96 fondo de cristal bien placa (BD, EE.UU.) con baja densidad y después de 48 h, se trató con FAE a 100 mg /ml. La imagen fue tomada usando BD Camino Bioimager 435 (Becton Dickinson, EE.UU.) a los 3, 18 y 27 h mediante el establecimiento de Montaje (2 × 2) y el Macro específica utilizando el software AttoVision ™. El agregado granular verde indica que la translocación de Bax a la mitocondria, tal como se indica por las flechas. Las imágenes representativas recogidas en los puntos de tiempo indicados se utilizaron para el análisis de las células positivas porcentuales con Bax EGFP en las mitocondrias en comparación total en el campo. (B) Gráfico que muestra el porcentaje de células en proceso de Bax translocación a la mitocondria en el tratamiento FAE. células (C) La MCF-Bax-DS rojas fueron tratados como se ha indicado anteriormente. la acumulación de Bax-EGFP en las mitocondrias se indica en imágenes de gran aumento con flechas. También se muestra una imagen fusionada ampliada de las células tratadas. (D) células MCF-7 se transfectaron con Control (SCR) siRNA o Bax siRNA. Después de 48 h de transfección, extracto de células enteras se preparó y se immunoblotted de Bax y actina. Las mismas células también se tiñeron con Hoechst 33342 después de 48 h de tratamiento FAE para visualizar condensación de la cromatina (panel izquierdo). La gráfica es la representación cuantitativa del porcentaje de células con cromatina condensada en las células transfectadas y revueltos-transfectadas Bax-FAE después del tratamiento.
Las células de cáncer de mama (A), MDAMB231, T47D, y SKBr3 las células normales como las células humanas epiteliales mamarias y células endoteliales humanas después del tratamiento con FAE a 100 g /ml durante 24 h se tiñeron con 50 nM de TMRM y 0,5 g /ml de Hoechst 33342 durante 15 minutos. Luego, las células fueron imágenes bajo microscopio de fluorescencia utilizando DAPI y conjuntos de filtro de rodamina utilizando 40 × objetivo. Las imágenes fueron capturadas con la cámara Retiga Exi usando software de elementos NIS (Nikon). (B) Ac-LEHD-AFC división (caspasa 9 actividad) (C) Ac-DEVD-AMC hendidura (caspasa 3/7 de actividad). MCF-7 células fueron tratadas en el IC
50 valor de FAE durante 24, 36 y 48 h. Los resultados se midieron fluorométricamente. Los valores se expresan como media ± desviación estándar de muestras por triplicado. Diferencia significativa del valor de control se indica mediante * (p & lt; 0,05), ** (p & lt; 0,01) o *** (p & lt; 0,001). tratamiento FAE resultó en un incremento dependiente del tiempo en la escisión de Ac-LEHD-AFC (Acetil-Leu-Glu-His-Asp-7-amino-4-trifluorometil cumarina), sugiriendo aumento de la actividad de la caspasa 9 (Figura 5B). En 24 h de tratamiento, no escisión prominente de Ac-DEVD-AMC (sustrato para caspasas 3/7; Acetil-Asp-Glu-Val-Asp-7-amino-4-metil-cumarina) se observó. actividad DEVDasa notable se produjo sólo a 36 h de tratamiento con FAE. La barra de escala representa 50 micrómetros.
FAE Triggerd activación de la caspasa 9
Para examinar la participación de las caspasas en la apoptosis inducida por la FAE, la actividad de la caspasa iniciadora 9 como (LEHDase) y el efector caspasa 7/3 como actividades (DEVDasa) se investigaron mediante el ensayo fluorométrico de la proteasa. MCF-7 células fueron tratadas con FAE en IC
50 valor se determinaron para 24, 36 y 48 horas y las actividades de caspasa. tratamiento FAE resultó en un incremento dependiente del tiempo en la escisión de Ac-LEHD-AFC (Acetil-Leu-Glu-His-Asp-7-amino-4-trifluorometil cumarina), sugiriendo aumento de la actividad de la caspasa 9 (Figura 5B). En 24 h de tratamiento, no escisión prominente de Ac-DEVD-AMC (sustrato para caspasas 3/7; Acetil-Asp-Glu-Val-Asp-7-amino-4-metil cumarina) se observó. actividad DEVDasa notable se produjo sólo a 36 h de tratamiento con FAE (Figura 5C).
FAE inducida por la caspasa activación en vivo Modelo de la célula de la caspasa activación
Los resultados anteriores indican que la apoptosis inducida por FAE principalmente a través de las mitocondrias mediada vía intrínseca implica Bax permeabilización mitocondrial mediada seguido de la caspasa 9 y caspasa 3/7 activación. Además, para demostrar el papel de las caspasas en la muerte celular inducida FAE, hemos utilizado un FRET (transferencia de energía de resonancia de fluorescencia) modelo de células vivas en base como se describió anteriormente [28] para monitorear activa caspasas en células vivas. En resumen, la línea celular de cáncer de mama que expresan la sonda FRET ECFP-DEVD-EYFP (Enhanced Cyan fluorescente Proteína- caspasa 3 escisión de secuencia mejorada de proteína amarilla fluorescente) fue expuesto a FAE en 100 mg /ml y la imagen en el modo de relación. Tras la activación de la caspasa, la FRET desde el donante al aceptor fluoróforo se perdió con el aumento de ECFP y disminución de la fluorescencia EYFP. Como se muestra en la Figura 6A, las células de control no tratadas mostraron un aumento de la fluorescencia del aceptor de la fluorescencia del donador que se refleja como disminución de la relación /EYFP ECFP (0,04) debido al aumento de la transferencia de energía de fluorescencia aceptor mediada. Sin embargo, en los pocillos tratados, la mayoría de las células mostraron un aumento de la relación de 1.005 lo que indica la pérdida de FRET, debido a la escisión mediada por caspasa de la DEVD enlazador colocada en entre el donante y aceptor con el aumento de ECFP y disminución de la fluorescencia EYFP. Las células apoptóticas con fines de encogimiento celular apreciable fueron vistos como cuerpos brillantes en la imagen con la suficiente cambio de relación de imagen de relación (Figura 6A) en.
MCF-7 células (A) que expresa caspasa sondas FRET fueron expuestos a 100 mg /ml de FAE para 24 h y 48 h. Los canales ECFP, EYFP-traste y se fusionaron imágenes de DMSO tratada y tratada FAE se muestran las células. También se muestra la imagen de relación de ECFP /EYFP. El gráfico mostrado es el cambio de relación cuantitativa en DMSO y FAE tratados morir las células como se analiza en software elementos NIS (n = 4). (B) Las mismas células se tiñeron con TMRM y se expusieron a 100 g /ml de FAE y la imagen de TMRM, ECFP, EYFP-FRET en un modo de lapso de tiempo en un intervalo de 5 minutos como se ha descrito. La imagen resultante de la fusión de TMRM, ECFP, EYFP-FRET partir de las imágenes de lapso de tiempo para los puntos de tiempo indicados se muestran. El cambio de relación ECFP /EYFP en DMSO y FAE células se muestra como un gráfico tratada. El gráfico indica el cambio de la relación cuantitativa en DMSO y FAE tratados con las células que mueren (estructura completa se muestra como vídeo S1). (C) El FRET células que expresan fueron tratados como anteriormente y la formación de imágenes se llevó a cabo como se describe con un intervalo de 2 minutos. Una imagen representativa durante el tiempo indicado se muestra (estructura completa se muestra como vídeo S2). (D) Las mismas células tratadas con DMSO y la imagen como se describe para C. Se muestra una imagen representativa durante el tiempo indicado (estructura completa se muestra como vídeo S3).
FAE Possessed fuerte efecto fotosensibilizante
Para el análisis del efecto fotosensibilizante de FAE, el sensor de las células que expresan caspasa se sembraron en placas de fondo de vidrio de 8 cámaras así-y se tiñó con (éster metílico tetrametil rodamina) potencial de membrana mitocondrial colorante fluorescente específico TMRM como se describió anteriormente [28 ]. Las células se trataron con 100 g /ml de FAE y se expusieron a formación de imágenes continua de TMRM así como donante y aceptor de fluorescencia utilizando CARV (BD Biosciences) microscopio confocal de 24 h en un intervalo regular de 5 minutos. Como se muestra en la Figura 6B y de vídeo S1, dentro de los 30 minutos de formación de imágenes, las células perdieron TMRM de fluorescencia que indica la pérdida de potencial de membrana mitocondrial. pérdida de células notable fue evidente tan pronto como 60 minutos que rápidamente se procedió a la pérdida completa de las células en el plano de la imagen por 7 h. Sólo se observó un cambio leve en relación /EYFP ECFP en estas células que indican la activación de la caspasa parcial (Figura 6B). Por otra parte, para corroborar el papel fotosensibilizante de FAE, hemos reducido el tiempo de exposición a 2 minutos con imágenes de continuo hasta 200 fotogramas. Curiosamente, la pérdida de células correlaciona bien con el número de marco en lugar de la sincronización de la FAE tratamiento que justifique que el efecto sensibilizante fue muy influenciado por exposición a la luz de excitación en lugar de la duración del tratamiento FAE. Las células no tratadas expuestas a la mismas condiciones de formación de imágenes no mostraron ningún cambio en la relación o la pérdida de células durante un máximo de 24 h de formación de imágenes que validan que el efecto observado fue causado por la FAE (S2 Figuras 6B, C, D y Vídeos, S3). Las células también mantienen TMRM fluorescencia que indica el mantenimiento del potencial de membrana mitocondrial durante todo el período de formación de imágenes. En general, los resultados confirmaron que poseía FAE efecto que se asocia con la pérdida rápida de transmembrana mitocondrial potencial de activación y parcial caspasa fotosensibilizantes.
FAE mediada por la expresión de reguladores de apoptosis
A finde para justificar la importancia de la caspasa cascada detrás de la inducción de la apoptosis, se analizó la disociación de caspasas importantes como la caspasa 8, caspasa 7, caspasa 9 y también PARP (poli (ADP-ribosa) polimerasa) en las células MCF-7, T47D y MCF10A. Como se muestra en la Figura 7A, el tratamiento FAE en 80 y 160 g /ml inducidas de escisión de la caspasa 8, caspasa 7 y la caspasa 9 en las células MCF-7, así como en T47D. La escisión de PARP también se observó en estas células. Sin embargo, en MCF10A, solamente una hendidura leve fue evidente tanto para caspasas y PARP.
células MCF-7 (A) fueron tratados con FAE (80, 160 mg /ml) durante 48 h y se recogieron. Las inmunotransferencias se realizaron en extracto de células enteras usando los anticuerpos indicados. El correspondiente de longitud completa y fragmentos escindidos se indican. Para blot PARP, las células fueron tratadas con 160 g /ml de FAE para 48 h. (B) las células MCF-7 y T47D se trataron con 100 g /ml de FAE para 24 h. FAE induce la generación de ROS en células MCF-7, así como las células T47D que el control de DMSO, como se indica por el aumento de fluorescencia DCF-DA en las células tratadas. células MCF-7 y T47D (C) se trataron con 100 g /ml de FAE solo y después del pre-tratamiento con NAC por un período de 24 h. Como se muestra, el tratamiento previo de las células con el antioxidante NAC reduce la muerte celular inducida por FAE. Porcentaje de células con cromatina condensada para cada grupo se muestra como un gráfico (N = 3) guía empresas
- FAE. Muerte celular inducida por la generación de ROS Participa
Los resultados anteriores indicaron que en la mayoría de las líneas celulares utilizadas, FAE podría provocar la pérdida de la integridad de la membrana mitocondrial y la condensación de la cromatina posiblemente a través de forma dependiente de Bax. Por otra parte, sobre imágenes de células vivas que hemos observado accidentalmente efecto fotosensibilizante de la FAE en extraer células MCF-7 que expresan caspasa sensor de la sonda con la pérdida acelerada del potencial de membrana mitocondrial. Anteriormente, se informó de que la mayoría de los fotosensibilizadores inducen la muerte celular a través de la generación de ROS [29], uno de los factores desencadenantes prominentes para la activación conformacional Bax. Por lo tanto, habíamos analizado la ROS después de tratar las células con 100 g /ml de FAE durante 24 h mediante FACS. Como se muestra en la Figura 7 B, FAE induce la generación de ROS en células MCF-7, así como las células T47D indicados por el aumento de 2 ', 7'-diacetato dichlorodihydrofluorescein (H
2-DCF-DA) de fluorescencia en las células tratadas que el control . Pre-tratamiento de las células con el antioxidante N acetil cisteína (NAC) reduce la muerte celular inducida por FAE como se muestra en los resultados de condensación de la cromatina (Figura 7 C). Otra vez validado que la generación de ROS en las células fue el desencadenante principal de la muerte celular por apoptosis y que podría contribuir a su actividad fotosensibilizante.
Discusión
extractos de productos naturales han sido ampliamente probado en la industria farmacéutica la industria y han sido considerados como una valiosa fuente de nuevos fármacos [30]. Como medio de identificación de agentes anti-cáncer, la farmacología inversa, o la "cabecera" de enfoque 'banco' se ha explorado que implica el estudio de las plantas medicinales que se han utilizado tradicionalmente para tratar diversas dolencias. Diversos estudios indican que
Ficus
especies son ampliamente utilizados en el tratamiento de varios tipos de enfermedades como trastornos respiratorios, trastornos sexuales, trastornos del sistema nervioso central (SNC), trastornos cardiovasculares (CVS), problemas gástricos, infecciones de la piel y diabetes etc [31], [6]. La mayoría de los estudios farmacológicos fueron dirigidos en la validación de sus usos tradicionales [32]. Aunque el diseño moderno de drogas hace hincapié en el desarrollo de agentes individuales con objetivos específicos, el hecho de que el extracto de conjunto se ha demostrado ser más eficaz que sus componentes individuales (un concepto conocido como la sinergia de hierbas) sugiere las limitaciones de este enfoque [3]. Muerte de las células tumorales a través de la inducción de la apoptosis es ahora reconocida como una estrategia para la identificación de fármacos contra el cáncer [33]. En el presente informe, hemos tratado de determinar los mecanismos por los que la fracción de acetona de
F.religiosa
extracto de hoja ejerce su efecto antiproliferativo en múltiples células de cáncer de mama.
Efecto
Anti-proliferativa