Extracto
1α-25 (OH)
2 vitamina D
3 (1- 25D), una forma hormonal activa de la vitamina D
3, es un agente quimiopreventivo y pro-diferenciar bien conocido. Se ha demostrado que inhibe el crecimiento de líneas celulares de cáncer de próstata varios. Las uniones comunicantes, formados por proteínas llamadas conexinas (Cx), son conjuntos de canales célula-célula, que permiten el intercambio de moléculas reguladoras pequeña de crecimiento entre las células adyacentes. la comunicación celular mediada por Gap canales de unión es un importante mecanismo de control homeostático para regular el crecimiento y la diferenciación celular. Hemos investigado el efecto de 1-25D sobre la formación y la degradación de las uniones comunicantes en una línea de andrógenos sensible cáncer de próstata de células, LNCaP, que expresa introducido retroviralmente-Cx32. Connexin32 es expresada por las luminales y bien diferenciadas células de tumores de próstata y de próstata normales. Nuestros resultados documentan que 1-25D aumenta la expresión de Cx32 y su posterior ensamblaje en uniones comunicantes. Nuestros resultados muestran además que 1-25D evita la degradación regulada por andrógenos de Cx32, después de la traducción, independiente del receptor de andrógenos (AR) de señalización mediada. Por último, nuestros hallazgos documentan que la formación de uniones gap Cx32 sensibiliza las células que expresan LNCaP a los efectos inhibidores del crecimiento de 1-25D y altera su morfología. Estos hallazgos sugieren que los efectos inhibidores de crecimiento de 1-25D en células LNCaP pueden estar relacionadas con su capacidad para modular la asamblea de Cx32 en las uniones comunicantes
Visto:. Kelsey L, Katoch P, Ray A, Mitra S, S Chakraborty, Lin MF, et al. (2014) La vitamina D
3 regula la formación y la degradación de Uniones Comunicantes en células sensibles a andrógenos cáncer de próstata humano. PLoS ONE 9 (9): e106437. doi: 10.1371 /journal.pone.0106437
Editor: Michael Koval, Escuela de Medicina de la Universidad de Emory, Estados Unidos de América
Recibido: November 26, 2013; Aceptado: 6 Agosto de 2014; Publicado: 4 Septiembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Kelsey et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud, el Departamento de Defensa CA113903 PCRP PC-081198 y PC-111867, del estado de Nebraska de Grant LB506 y R0-1DE12308. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El papel de la vitamina D
3, y su forma hormonal activa 1α-25 (OH)
2 vitamina D
3 (1-25D), como un anti-neoplásica, pro -differentiating, y el agente pro-apoptótico se ha establecido en una amplia variedad de células epiteliales normales y malignos, incluyendo el cáncer de próstata (PCA) [1] - [4]. Las acciones de 1-25D están mediadas por la unión al receptor de vitamina D, una de los miembros de la superfamilia del receptor nuclear, que se expresa en una amplia variedad de células, incluyendo el de próstata. El receptor de la vitamina D heterodimeriza con el receptor RXR y se une al elemento de respuesta de receptor de la vitamina D para alterar la expresión de genes [1]. Basa en la observación de que las tasas de mortalidad de PCA en los EE.UU. son inversamente proporcionales al ultravioleta incidente exposición a la radiación geográficamente del sol, y que la luz ultravioleta es esencial para la vitamina D
3 síntesis en la piel, un papel de esta vitamina en la disminución el riesgo de desarrollar PCA ha sugerido [5], [6]. Numerosos
in vitro
estudios muestran inhibidora del crecimiento consistente y efectos inductores de la diferenciación de la vitamina D
3 en las células de carcinoma de próstata, y los estudios en animales muestran que no sólo reduce la incidencia de PCA, actuando como un agente quimiopreventivo sino que también suprime la metástasis [7] - [10]
unión de huecos (GJ) s son conjuntos de canales célula-célula que señalan no canónicamente, al permitir el intercambio directo de moléculas pequeñas (≤1500Da) entre. los interiores citoplasmáticos de las células contiguas [11]. Las proteínas constituyentes de GJS, llamadas conexinas (CXS), están codificados por 21 genes, que han sido designados de acuerdo con su masa molecular [12]. canales célula-célula son estructuras bicelular formados por la asociación de dos células. Para formar un canal GJ célula-célula, CXS primera oligomerize en el retículo endoplásmico o la red trans-Golgi como un hexámero, llamado conexón, que se acopla con la conexón que aparece en una celda contigua [13], [14]. Múltiples líneas de evidencia ahora dan credibilidad a la idea de que la comunicación celular mediada por Gap canales de unión es un importante mecanismo de control homeostático para regular el crecimiento y la diferenciación celular y para detener la promoción de tumores. Por ejemplo, alteración de la expresión Cx, o pérdida de la función GJ, ha sido implicado en la patogénesis de varios tipos de cánceres y enfermedades [15] - [19]. Además, las mutaciones en varios genes Cx se han detectado en los trastornos genéticos caracterizados por una proliferación aberrante y diferenciación celular [13], [20].
Nuestros estudios anteriores mostraron que la expresión de Cx32, que se expresa por el luminal las células de la próstata, coincidieron con la adquisición del estado diferenciado de las células luminales [21], [22]. Por otra parte, documentamos que la progresión de PCA de un estado dependiente de andrógenos a un estado invasivo, independiente de andrógenos se caracterizó por el tráfico aberrante de Cx32 y /o montaje deteriorado en GJS [22] - [24]. Por otra parte, nuestros estudios mostraron que la expresión forzada de Cx32 en línea sensibles a andrógenos humano PCA celular, LNCaP, el crecimiento celular retardada
in vivo
y
in vitro
[22]. También hemos demostrado que en las células LNCaP que expresan Cx32, la formación y la degradación de GJS estaban regulados por los andrógenos, que controlan el nivel de expresión de Cx32 después de la traducción mediante la prevención de su degradación por la degradación del retículo endoplásmico asociado (ERAD) [25]. Los andrógenos son necesarios para mantener la función secretora de las células epiteliales luminales de la próstata normal como el agotamiento de los andrógenos por medios quirúrgicos o químicos (diferenciación relacionada) desencadena la apoptosis y /o desdiferenciación de estas células [26] - [29]. Nuestros estudios recientes han demostrado que los retinoides, que también regulan la proliferación y diferenciación de las células epiteliales de la próstata [28], [30], también mejoran el montaje de Cx32 en gjs [31]. Estos estudios dan crédito a la noción de que la formación y degradación de GJS pueden estar relacionadas con la proliferación y diferenciación de las células epiteliales de próstata luminal.
Al igual que los andrógenos y los retinoides, la vitamina D
3 es esencial para el normal desarrollo de la próstata y también se ha documentado para modular la progresión PCA [7], [9]. Estudios recientes han demostrado que la vitamina D suprimió neoplasia epiteliales prostáticas en Nkx3.1 /PTEN ratones transgénicos [32]. Epidemiológica, cultivo celular, y los estudios clínicos han implicado efectos antitumorales de 1-25D para PCA y se ha sugerido que es un agente quimiopreventivo potente [3], [4]. Sin embargo, en contraste con el cáncer de colon [1], [33], el potencial de la eficacia de 1-25D en la quimioprevención del PCA ha mantenido controvertido a pesar de numerosos estudios en modelos de ratones transgénicos de PCA y su uso en los ensayos clínicos [1], [2]. Estudios anteriores, incluyendo el nuestro, han demostrado que los efectos inhibidores del crecimiento y de inductores de la diferenciación de los agentes quimiopreventivos podría estar relacionado con su capacidad para mejorar la comunicación en ocasiones presentan diferencias [34] - [38]. Las células luminales de próstata normal expresan Cx32 y forman grandes GJS y progresión de la PCA se acompaña de pérdida de la capacidad para formar GJS [22], [23]. Formación de GJS ha sido implicado en el mantenimiento del estado polarizado y diferenciado de células epiteliales [39]. Estos estudios nos llevó a examinar el efecto de 1-25D en el conjunto de Cx32 en gjs en línea celular humana PCA sensible a los andrógenos LNCaP. Debido 1-25D se ha demostrado que aumenta la expresión de AR en las células LNCaP [40], se razonó que podría modular la formación de andrógenos regulado y la degradación de GJS y afectar el crecimiento de las células de PCA sensibles a andrógenos que expresan Cx32. Mediante el uso de células LNCaP sensibles a andrógenos, que expresan de forma retroviral introducido-Cx32 [25], se muestra que 1-25D realza el conjunto de Cx32 en gjs. Por otra parte, una vez más demuestran que 1-25D evita la degradación regulada por andrógenos de gjs después de la traducción, independiente de AR señalización mediada. Por último, nuestros resultados muestran que la formación de gjs sensibiliza a las células LNCaP a los efectos inhibidores del crecimiento de 1-25D y altera su morfología.
Materiales y Métodos
Cell Cultura y
andrógenos -responsive línea celular humana PCA, LNCaP, se cultivó como se describe [41], [42]. LNCaP-32 células, uno de los varios clones de células LNCaP que expresan rata transducidas con retrovirus-Cx32, y células LNCaP-N, uno de los varios clones de control seleccionadas en G418 después de la infección con el retrovirus de control, se han descrito [25], [ ,,,0],31]. células LNCaP parentales, en lo sucesivo como células LNCaP-P, se cultivaron en RPMI que contenía suero bovino fetal al 5% en una atmósfera de 5% de CO
2/95% de aire, mientras que LNCaP-N y las células LNCaP-32 se mantuvieron en RPMI que contenía 5% de suero bovino fetal que contenía G418 a 200 mg /ml como se describe [25], [31]. Esteroides agotado en suero (tratado con carbón vegetal) y de rojo fenol libre RPMI se obtuvieron de Hyclone Laboratories (Salt Lake City, UT).
Los anticuerpos y Inmunoticción
Las fuentes de tanto monoclonales como se han descrito anticuerpos policlonales contra Cx32 anteriormente [24], [25], [31], [43], [44]. Mouse anti-ocludina (clon 3F10-OC) fue de Zymed laboratorios, Inc. (South San Francisco, CA). Los anticuerpos de conejo contra α- y β-catenina y el ratón anti-β-actina (clon C-15) fueron de Sigma (St. Louis, MO). Los anticuerpos monoclonales contra la E-cadherina (E-cad), α-catenina, β-catenina, generosamente proporcionados por los Dres. Johnson y Wheelock (Eppley Institute), se han descrito [25], [43], [44]. Un anticuerpo anti-receptor de AR policlonal de conejo era de Santa Cruz Biotech (sc-13062, San Diego, CA). Las células (1,5 × 10
5), sembró en seis grupos de pozos que contienen cubreobjetos de vidrio y se dejaron crecer hasta aproximadamente el 50% de confluencia, se immunostained con diversos anticuerpos como se describe [24], [25], [31], [ ,,,0],43] - [45]. Los anticuerpos secundarios (conejo o ratón), conjugado con Alexa 488 y Alexa 594, se utilizaron como apropiado. Imágenes de células inmuno fueron adquiridas con Leica DMRIE microscopio (Leica Microsystems, Wetzler, Alemania) equipado con cámara Hamamatsu ORCA-ER2 CCD (Hamamatsu-City, Japón) y analizados mediante el software de procesamiento de imágenes (Volocity, Versión 6.3; Improvisación, Inc; Perkin Elmer) como se describe [43] - [45].
Soluciones de archivo
andrógeno sintético mibolerona (MB) y un andrógeno natural de dihidrotestosterona (DHT), 1-25D, y Casodex ( La bicalutamida) fueron adquiridos de BIOMOL (ENZO Life Sciences, Inc., Farmingdale, NY). Las soluciones madre de Mo y DHT se prepararon a 1 mM en etanol y se almacenaron a -20 ° C en alícuotas pequeñas protegidas de la luz. solución madre de 1-25D (10 mM) se preparó en etanol y se almacenó en alícuotas a -80 ° C protegido de la luz. solución madre de Casodex (10 mM) se preparó en DMSO y se almacena en alícuotas a -20 ° C. Se diluyeron apropiadamente en el medio en el momento de tratamiento. Todos los experimentos se llevaron a cabo a la luz amarilla como se describe [36], [37].
andrógenos agotamiento y Otros Tratamientos
Las células fueron sembradas en seis grupos de pozos con cubreobjetos de vidrio (1,5 × 10
5 células por pocillo) y en 6-cm (2 × 10
5 células por placa) y platos de 10 cm (3,5 × 10
5 células por placa) en 2, 4 y 10 ml de medio completo , respectivamente. Las células se trataron mediante la reposición con medio fresco que contiene diferentes reactivos a la concentración deseada cuando alcanzaron 50% de confluencia. Los controles se trataron con etanol de tal manera que la concentración final del disolvente no excedió de 0,1%. Cuando las células eran ser cultivadas bajo condiciones de andrógenos empobrecido, medio de cultivo celular normal se sustituye con (RPMI-fenol exento de rojo que contiene 5% de suero tratado con carbón vegetal) medio de cultivo celular andrógeno-agotado. Los controles recibieron medio libre de rojo fenol-fresco que contenía suero normal. Se utilizó medio de fenol-libre de rojo a causa de rojo fenol se ha documentado que tiene efectos androgénica sobre el crecimiento de líneas de células sensibles a hormonas, incluyendo LNCaP [46], [47]
Análisis Western. Blot y detergente solubilidad de Connexin32
las células (5 × 10
5) se sembraron en placas de 10 cm en la replicación en 10 ml de medio completo y se cultivaron hasta la confluencia en presencia y ausencia de diversos reactivos. La lisis celular, el ensayo de detergente solubilidad con 1% de Triton X-100 (TX100) y el nivel de expresión de Cx32 se analizaron mediante análisis de transferencia Western como se describe [25], [43], [44]. En pocas palabras, después de la lisis en SSK tampón (Tris 10 mM, EGTA 1 mM, PMSF 1 mM, NaF 10 mM, NEM 10, Na 10 mM
2VO
4, 10 mM yodoacetamida, 1% TX100, pH 7,4 ), los extractos totales, detergente soluble y -insoluble se separaron mediante ultracentrifugación a 100.000 xg durante 60 min (35.000 rpm en analítica ultracentrífuga Beckman; Modelo 17-65 usando un rotor SW50.1). Las pastillas de detergente insolubles se disolvieron en tampón C (70 mM Tris /HCl, pH 6,8, 8 M urea, 10 mM NEM, 10 mM yodoacetamida, 2,5% SDS, y 0.1 M DTT). Tras la normalización basada en el número de células, las fracciones totales y TX100-soluble y -insoluble se mezclaron con tampón de 4xSDS de carga a una concentración final de 1x y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h antes del análisis SDS-PAGE. Las transferencias se desarrollaron con C-Digit (Li-Cor, Lincoln, NE) usando SuperSignal WestFemto máxima sensibilidad Substrato (Thermo Scientific, Rockford, IL).
Comunicación Ensayos
Gap comunicación en ocasiones se ensayó por microinyección de amarillo Lucifer (MW 443 Da; sal de litio), Alexa Fluor 488 (MW 570 Da; A-10436), y Alexa Fluor 594 (MW 760 Da; A-10438) usando sistemas de microinyección Eppendorf InjectMan y FemtoJet (modelos 5271 y 5242, Brinkmann Instrument, Inc. Westbury, NY) montada en el microscopio Leica DMIRE2. Después de la captura de las imágenes de las células microinyectadas con la ayuda de la cámara CCD (Retiga 2000R, FAST 1394) utilizando QCapture (Columbia Británica, Canadá), la permeabilidad de varios marcadores fluorescentes se cuantificó anotando el número de células fluorescentes en 1 min (Lucifer Yellow ), 3 min (Alexa 488) y 15 min (Alexa 594) después de microinyección en la celda de ensayo como se describe [22], [25], [43], [48].
formación de colonias y el crecimiento celular Ensayos
el crecimiento celular se evaluó tanto por formación de colonias de ensayo o contando el número de células como se describe [22], [48]. Para el ensayo de formación de colonias, 1 × 10
3 células fueron sembradas en 6 cm platos, por triplicado, en medio de cultivo 3 ml. Después de 24 h, un medio que contiene ml 1-25D, se añadió MB o DHT a los platos para dar la concentración final deseada. Las células se cultivaron durante 21 días, con un cambio de medio cada 4 días que contiene la concentración apropiada de los reactivos anteriores, cuando se formaron colonias visibles. Las colonias en placas se fijaron con 3,7% de formaldehído tamponado, se tiñeron con solución de 0,025% de violeta de cristal en PBS, y se fotografiaron. Para medir el crecimiento celular, 5 × 10
4 células fueron sembradas en 6 cm platos en la replicación y se trató con 1-25D descrito anteriormente. Las células se dejaron crecer durante 10 días con un cambio de medio el día 5. Las células se trataron con tripsina y se contaron en un hemocitómetro.
Resultados
La vitamina D
3 Mejora Cx32 Expresión Nivel
Se utilizaron células LNCaP-32 que expresan la rata transducidas con retrovirus-Cx32 se describe anteriormente [25], [31]. Anteriormente puso de manifiesto que en las células LNCaP-32 andrógenos regula la formación de GJS, después de la traducción, mediante el control del nivel de expresión de Cx32 inhibiendo su ERAD mediada por la degradación [25]. Nuestros estudios posteriores mostraron que la degradación regulada por andrógenos de Cx32 fue abrogada por el ácido todo-trans-retinoico (ATRA) y ácido 9-cis retinoico (9-CRA) [31]. Hemos racionalizado tanto que 1-25D podría actuar similar a ATRA y 9-CRA. Con base en los estudios anteriores que muestran el efecto de la vitamina D sobre el crecimiento celular LNCaP [10], [49] - [52], se trataron LNCaP-32 células con varias concentraciones de 1-25D para examinar su efecto en el nivel de expresión de Cx32 . Se encontró que 1-25D aumentó el nivel de expresión Cx32 en una forma dependiente de la dosis (Figura 1A). Se observó una mejora significativa incluso en concentración tan baja como 1 nM (Figura 1B, gráfico de la izquierda). Las concentraciones más altas de 10 nM eran tóxicas para estas células tal como se evaluó mediante el ensayo de formación de colonias (datos no publicados). Para los estudios posteriores elegimos 10 nM 1-25D. estudios de evolución en el tiempo demostraron que un aumento significativo en el nivel de expresión de Cx32 se produjo a los 12 h post-tratamiento con 1-25D y alcanzó una meseta a las 72 h (Figura 1CD, gráfico de la derecha). El efecto de 1-25D en el nivel de expresión de Cx32 fue tan potente como de andrógeno sintético, MB, y 9-CRA. Además, el tratamiento combinado con 1-25D y MB fue más eficaz en el aumento de nivel de expresión Cx32 (Figura 2AB). La vitamina D
3 había sido previamente demostrado que afectan a la expresión del nivel de E-cad, una proteína constituyente de las uniones adherentes, en células de cáncer de colon [33]. Para determinar si 1-25D también afectó el nivel de expresión de proteínas asociadas de unión adherente, que mide el nivel de expresión de E-cad y sus proteínas asociadas alfa y beta catenina 72 h después del tratamiento con 1-25D. Los resultados mostraron que 1-25D no tuvo ningún efecto sobre el nivel de expresión de E-cad y alfa y beta catenina (Figura 2C). Según lo medido por el análisis semi-cuantitativo de RT-PCR, 1-25D ni indujo la expresión endógena de Cx32 en las células LNCaP-P o N-LNCaP (datos no mostrados), ni altera el nivel de expresión del ARNm transcrito Cx32-retroviral en LNCaP-32 como está documentado anteriormente [25].
A. mejora dependiente de la dosis del nivel de expresión Cx32 en 1-25D tratamiento durante 48 h. B. Análisis cuantitativo del nivel de expresión de los datos mostrados en A. Cada barra representa la media y el error estándar de la media de 4-17 experimentos. Tenga en cuenta que la mejora significativa se observó incluso a 1 nM. Los asteriscos (**) indican los valores de p ≤0.0001. Se utilizó una de dos
t de Student
de cola para calcular el valor P suponiendo una varianza desigual. C. Cinética de la mejora del nivel de expresión Cx32 tras el tratamiento con 1-25D (10 nM) durante los tiempos indicados. Tenga en cuenta que la mejora se observó a las 12 h y mesetas a las 72 h. D. Análisis cuantitativo del nivel de expresión de los datos mostrados en C. Cada barra representa la media y el error estándar de la media de 3-11 experimentos. El asterisco (*) indica los valores de p ≤0.0016 y asteriscos (**) indican los valores de p ≤0.0001. A dos de cola de Student
t
prueba se utilizó para calcular el valor P suponiendo una varianza desigual.
Cx32-expresión de las células LNCaP-32 fueron tratadas con el 1-25D, 9-CRA, DHT y MB como se indica. El tratamiento combinado con A. 1-25D con MB o 9-CRA es más eficaz en el aumento de nivel de expresión de Cx32 tratamiento con el agente individual solo. B. Análisis cuantitativo del nivel de expresión de los datos mostrados en A. Cada barra representa la media y el error estándar de la media de 4-13 experimentos. Los asteriscos (**) indican los valores de p ≤0.0001. Se utilizó una de dos
t de Student
de cola para calcular el valor P suponiendo una varianza desigual. C. Efecto de 1-25D en proteínas asociadas de unión adherente. La expresión de las proteínas de unión adherente E-cadherina (E-cad), α-catenina (α-gato), y β-catenina (β-cat) fue analizada por Western blot de lisado celular total (10 g). Tenga en cuenta que no hay ningún efecto.
La vitamina D
3 mejora la Asamblea y Junction brecha ocasiones Comunicación
A continuación examinó el efecto de 1-25D en el conjunto de Cx32 en gjs. Hemos encontrado que, concomitante con un aumento en el nivel de expresión de Cx32, 1-25D también aumentó montaje GJ tal como se evaluó mediante análisis inmunocitoquímico (Figura 3A) y bioquímicamente mediante análisis de transferencia Western del total, TX100-soluble y extractos -insoluble en 48 h después del tratamiento (Figura 3BC). Este método bioquímico se basa en el principio de que CXS, que se incorporan en GJS, se convierten en insolubles en TX100 mientras que CXS que no se incorpora en GJS permanecen solubles [53]. Este ensayo se ha demostrado de forma reproducible para medir la asamblea de CxS en gjs según lo documentado por estudios anteriores [24], [25], [53]. Además, encontramos que la mejora de reunión GJ fue acompañado por un aumento paralelo de 2-3 veces en la comunicación de la unión según lo determinado por la transferencia de la unión de tres marcadores fluorescentes permeable GJ, Lucifer Yellow (MW 443), Alexa 488 (MW 570), y Alexa 594 (MW 760). Por ejemplo, 1-25D aumentó la transferencia de la unión de Alexa 594 por 2-3 pliegues comparación con los controles (Tabla 1). El efecto de 1-25D en la comunicación de la unión era tan potente como la de andrógeno sintético, MB y el andrógeno DHT natural (Tabla 1). Para determinar si 1-25D afectó el montaje de otros complejos de unión, que también examinó el detergente-solubilidad de adherentes y la unión de proteínas asociadas apretados. La razón de ser de estos estudios fue que E-cad se ha demostrado que facilita el montaje de CxS en gjs [43], [44], [54], y la expresión Cx se ha demostrado que facilita el montaje de las uniones estrechas y sus proteínas constituyentes [39]. Se encontró que 1-25D no tuvo efecto sobre la solubilidad de E-cad y sus proteínas asociadas, α- y β-catenina, y unión de proteínas asociadas ajustados, ZO-1 y ocludina, en TX-100 lo que sugiere que su montaje no era mejorado aún más en las respectivas uniones de las células (Figura 3B). Tomados en conjunto, estos datos sugieren que 1-25D, como los andrógenos y los retinoides, mejora el nivel de expresión de Cx32, y su posterior montaje en GJS, sin alterar visiblemente el nivel de expresión de otras proteínas asociadas de unión celular.
LNCaP -32 células, cultivadas ya sea en seis grupos de pozos o platos de 10 cm, se trataron con 1-25D (10 nM), MB (5 nM) y 1-25D más MB para 48 h. A. Asamblea de Cx32 (verde) en gjs se evaluó immunocytochemically. E-cad se muestra en rojo y los núcleos están en azul. Bar = 20 mM. Tenga en cuenta que la formación GJ se mejoró tras el tratamiento con 1-25D y MB. ensayo de solubilidad B. TX100- se utilizó para medir el montaje de Cx32 en gjs, de la unión de la proteína asociada apretado, ocludina (OCCL) y ZO-1, y la proteína de unión adherente, E-cadherina (E-cad) y α-catenina (α-gato). T = fracción total de; S = fracción soluble y I = fracción insoluble. C. Análisis cuantitativo del nivel de expresión de Cx32 se muestra en B. Cada barra representa la media y el error estándar de la media de 4-17 experimentos. Tenga en cuenta que tanto el nivel total y la fracción insoluble en detergente de Cx32 se incrementaron significativamente. Cada barra representa la media y el error estándar de la media de 3-11 experimentos. El asterisco (*) indica los valores de p ≤0.0016 y asteriscos (**) indican los valores de p ≤0.0001. Se utilizó una de dos
t de Student
de cola para calcular el valor P suponiendo una varianza desigual. Nótese la ausencia de efecto sobre las proteínas asociadas de unión adherente, E-cad, y la proteína de unión asociada apretado, ocludina (OCCL).
La vitamina D
3 Formación Modula regulada por andrógenos y la degradación de las Uniones Comunicantes
los primeros estudios con células LNCaP-32 había demostrado que el agotamiento de andrógenos causado por la degradación de Cx32 ERAD, y que los andrógenos formación GJ mejorada por la re-enrutamiento de la piscina ERAD-dirigida de Cx32 a la superficie celular , por lo que es susceptible para el montaje GJ [25]. En estudios posteriores, se demostró que la formación regulada por andrógenos y la degradación de gjs fue impedido por 9-CRA y atras [31]. Hemos racionalizado que 1-25D podría aumentar el montaje GJ mediante el rescate de la piscina ERAD-dirigida de Cx32 como 9-CRA y ATRA. Por lo tanto, hemos examinado el nivel de expresión de Cx32 y su ensamblaje en gjs en el agotamiento de andrógenos en presencia y ausencia de 1-25D en LNCaP-32 células. Para estos estudios, hemos utilizado medio de cultivo celular (carbón-despojado) y fenol-libre de rojo de andrógenos empobrecido hacer crecer células porque de rojo fenol tiene un débil efecto steroidogenic [46]. Como se ha observado en nuestros estudios anteriores [25], se encontró que los andrógenos agotamiento disminuyó el nivel de expresión de Cx32 plazo de 12 h, que no sólo fue impedido tras la adición de MB sino también por 1-25D (Figura 4AB). Además, el tratamiento combinado con MB y 1-25D parecía ser más eficaz en la mejora del nivel de expresión de Cx32 (Figura 4A, transferencia superior). También se encontró que la depleción de andrógenos disminuyó el nivel de expresión de AR, que también fue impedido por tratamiento con andrógenos no sólo, sino también con 1-25D (Figura 4A, transferencia de la parte inferior). Para corroborar los datos anteriores, se evaluó además la formación de gjs immunocytochemically (Figura 5A) y funcionalmente midiendo la transferencia de la unión de Lucifer amarillo, Alexa 488, y Alexa 594 (Tabla 2). Los resultados mostraron que GJS apenas se observan en las células cultivadas en medio de andrógenos empobrecido como se evaluó por la falta de inmunotinción Cx32-específica en áreas de contacto célula-célula, mientras que se observaron fácilmente cuando el medio de andrógenos empobrecido se complementó con 1-25D y MB (Figura 5A). Los ensayos funcionales demostraron que la transferencia de la unión de Lucifer Yellow, Alexa 488 y Alexa 594 disminuyó significativamente en el agotamiento de andrógenos, lo que fue impedido en la reposición de medio de andrógenos empobrecido con MB y 1-25D (Tabla 2), para sostener así los datos inmunocitoquímicos.
LNCaP-32 células, se siembran en placas de 10 cm, se cambiaron a medio tratado con carbón vegetal (andrógeno-agotado) (ST). El nivel de expresión de Cx32 y AR se determinó por análisis de transferencia Western (A) en presencia y ausencia de 1-25D (10 nM) y MB (5 nM). Tenga en cuenta que Cx32 y AR se degradan en el agotamiento y la degradación de andrógenos se bloquea al 1-25D tratamiento. ANTES DE CRISTO. Los análisis cuantitativos del nivel de expresión de Cx32 (B) y AR (C) de los datos mostrados en A. Cada barra representa la media y el error estándar de la media de 5-11 experimentos. Los asteriscos (**) indican los valores de p ≤0.0001. A dos de cola de Student
t
prueba se utilizó para calcular el valor P suponiendo una varianza desigual.
LNCaP-32 células, se siembran en seis grupos de pozos o platos de 10 cm, fueron cambiados al carbón de leña medio -stripped, andrógeno-empobrecido (ST). montaje GJ y el nivel de expresión de Cx32 se determinaron mediante inmunocitoquímica (A) y Western blot (B) análisis por ensayo de TX100 solubilidad en presencia y ausencia de 1-25D (10 nM) y MB (2,5 nM). En (A), Cx32 está en verde y E-cad es rojo y los núcleos (azul) se tiñen con DAPI. La barra de escala en A = 20 mM. En (B), T = fracción total de; S = fracción soluble y I = fracción insoluble. fracciones TX100-solubles e insolubles, así como ensayo inmunocitoquímico se realizaron 24 h después de la extracción como se describe en Materiales y Métodos. Tenga en cuenta que gjs se degradan en el agotamiento y la degradación de andrógenos se bloquea al 1-25D tratamiento (A). Tenga en cuenta también que la fracción soluble de TX100-E-cad (E-cad), β-catenina (β-gato) y ZO-1 no se ve afectada. Tenga en cuenta también que el agotamiento de andrógenos aumenta la fracción soluble de ocludina (B) sin afectar los niveles totales de ocludina como se cuantifica en D. El asterisco (*) indica los valores de p ≤0.0016 y asteriscos (**) indican los valores de p ≤0.0001. A dos de cola de Student
t
prueba se utilizó para calcular el valor P suponiendo una varianza desigual.
Los datos inmunocitoquímicos y de transferencia de la unión fueron corroborados además por el ensayo de solubilidad TX100 ( Figura 5BC). También se examinó el efecto de los andrógenos sobre el agotamiento del detergente-solubilidad de E-cad y β-catenina y proteínas apretado nudo-asociado, ZO-1 y ocludina. De acuerdo con nuestros estudios anteriores [25], los resultados mostraron que la depleción de andrógenos incrementa el detergente solubilidad de ocludina pero no de ZO-1 y E-cad y β-catenina (Figura 5BD). También se examinó el efecto de Mo y 1-25D ya sea solos o en combinación en la formación de los padres en gjs LNCaP-P y las células LNCaP-N resistentes a G418 y se encontró que no tenían ningún efecto (datos no mostrados). En conjunto, estos datos sugieren que 1-25D evita la degradación regulada por andrógenos de Cx32 y aumenta la formación de GJ en las células LNCaP-32. Dado que el tratamiento combinado con andrógenos y 1-25D no aumentar aún más el montaje GJ, es probable que el conjunto se ve reforzada por el rescate de la misma agrupación de Cx32 que fue blanco de ERAD en el agotamiento de andrógenos. Por otra parte, como se observó en nuestros estudios anteriores, el montaje y detergente solubilidad de Cx32 y ocludina en uniones celulares, o viceversa, parece estar regulada coordinadamente [25].
1-25D Mejora Gap Junction Formación independiente de la función del receptor de andrógenos
Nuestros datos muestran que 1-25D impedido la degradación de AR en el agotamiento de andrógenos (Figura 4A, mancha inferior). También el tratamiento de células LNCaP con 1-25D se ha demostrado para mejorar el nivel de expresión de AR [40]. Por lo tanto, hemos considerado la posibilidad de que el efecto de 1-25D en la mejora de reunión GJ dependía de la función de AR solos - y no en el efecto independiente de 1-25D. Para probar esta idea, se trataron las células LNCaP-32 con el anti-andrógenos, Casodex (bicalutamida), para bloquear la acción de los andrógenos [55], [56]. Tanto el agotamiento de andrógeno y el tratamiento con Casodex causados degradación de AR (Figura 6A, mancha superior, la figura 6B) y suprimieron el efecto de MB y DHT en el nivel de expresión de Cx32 (Figura 6A, mancha inferior; Figura 6B), como se observó en nuestros estudios anteriores [25], [31]. Sin embargo, hemos encontrado que Casodex no tuvo efecto en la mejora del nivel de expresión de Cx32 resultante del tratamiento con andrógenos 1-25D en un medio empobrecido (Figura 6AB). Para corroborar estos datos, el próximo examinado la formación de gjs immunocytochemically en las células tratadas con Casodex en presencia y ausencia de MB o 1-25D. Se encontró que GJS no se formaron cuando las células fueron tratadas con Casodex en el suero normal o en medio de andrógenos empobrecido que contiene MB como se observó en nuestros estudios anteriores (Figura 7) [25], [31]. Por otra parte, se encontró que se formaron GJS abundantemente cuando las células fueron tratadas con Casodex y 1-25D (Figura 7). En conjunto, estos datos sugieren que el mecanismo por el cual 1-25D evita la degradación de Cx32 y aumenta la formación de GJ en el agotamiento de andrógenos es independiente de la AR.
células LNCaP-32, se siembran en placas de 6 cm, se hicieron crecer a 70% de confluencia. Las células fueron cultivadas durante 24 h adicionales en medio normal (NS), media de andrógenos empobrecido solo (ST), suero normal suplementado con Casodex (CDX; NS + CDX), medio de andrógenos empobrecido suplementado con MB (ST + MB), MB y Casodex (ST + MB + CDX), 1-25D (ST + 1-25D), 1-25D y Casodex (ST + + 1-25D CDX) y en el suero normal con 1-25D (NS + 1-25D ).