Extracto
vitamina E δ-tocotrienol ha demostrado tener actividad antitumoral, pero el mecanismo molecular preciso por el cual se inhibe la proliferación de células de cáncer sigue siendo poco clara. Aquí, hemos demostrado que δ-tocotrienol ejercida células inhibición significativa del crecimiento celular del cáncer de páncreas ductal (PHVA) sin afectar el crecimiento normal de las células de páncreas humano ductal epitelial. También demostramos que la inhibición del crecimiento inducida por δ-tocotrienol ocurrió concomitantemente con G
1 la detención del ciclo celular y el aumento de p27
acumulación nuclear Kip1. Este hallazgo es significativo si se considera que la pérdida de p27 nuclear
Kip1 expresión es un factor pronóstico adverso bien establecida en PDCA. Por otra parte, δ-tocotrienol de señalización inactivada RAF-MEK-ERK, una vía conocida para suprimir p27
Kip1 expresión. Para determinar si p27
se requiere la inducción Kip1 para la inhibición δ-tocotrienol de la proliferación celular PDCA, que de forma estable silenció el
CDKN1B
gen, que codifica p27
Kip1, en las células MIAPaCa-2 PDCA y demostraron que p27
Kip1 silenciamiento de la detención del ciclo celular inducida por la supresión de δ-tocotrienol. Por otra parte, δ-tocotrienol inducida p27
Kip1 expresión de ARNm pero no su degradación de las proteínas. p27
Kip1 la actividad del promotor del gen fue inducida por la δ-tocotrienol a través del sitio de unión a E2F-1 del promotor, y esta actividad fue atenuada por E2F-1 agotamiento utilizando E2F-1 ARN interferente pequeño. Por último, disminución de la proliferación, mediada por Ki67 y p27
Kip1 expresión de δ-tocotrienol, se confirmó
in vivo
en un modelo de xenoinjerto de cáncer de páncreas desnuda ratón. Nuestros resultados revelan un nuevo mecanismo, dependiente de p27
inducción Kip1, por el cual delta-tocotrienol puede inhibir la proliferación de células PDCA, proporcionando una nueva justificación de p27
Kip1 como un biomarcador para la eficacia δ-tocotrienol en la prevención del cáncer de páncreas y la terapia
Visto:. Hodul PJ, Dong y, K Husain, Pimiento JM, Chen J, Zhang A, et al. (2013) La vitamina E δ-tocotrienol induce p27
detención del ciclo celular dependiente de Kip1 en células de cáncer de páncreas a través de un mecanismo de E2F-1-dependiente. PLoS ONE 8 (2): e52526. doi: 10.1371 /journal.pone.0052526
Editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 23 de julio de 2012; Aceptado: 15 Noviembre 2012; Publicado: 5 Febrero 2013
Derechos de Autor © 2013 Hodul et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado en parte por los Institutos nacionales de Salud (NIH) de subvención K12 Académico clínica en Oncología subvención (PJ Hodul) y por subvenciones de la Fundación Moffitt (Kurtz Pledge 09-33412-06-01, GI investigación de cáncer de 09-33412-07- 01, y la Fundación de la familia de Steinmann 09-33412-08-05). Este trabajo también fue apoyado por subvenciones del NIH 1R01 CA-129227-01A1, 5RO1 CA-098473-05, Davos 69-15099-99-01 (a Malafa MP), y Bankhead-Coley 08BR-02. Los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Este estudio implica la propiedad intelectual en el que M. y S. Malafa Sebti se nombran como inventores. Drs. Malafa y Sebti y el Centro de Cáncer Moffitt tienen derecho a recibir ingresos por licencias de la explotación de dicha propiedad intelectual. Una solicitud de patente de Estados Unidos fue presentada el 26 de junio de 2007, con el título "delta-tocotrienol tratamiento y la prevención del cáncer de páncreas" (OTML expediente número 06A069). La propiedad intelectual incluidos en la solicitud de patente ha sido licenciada a BioGene Ciencias de la Vida, una empresa con sede en Singapur. Esta licencia otorga derechos BioGene ciencias de la vida para el descubrimiento del Dr. Malafa. BioGene Ciencias de la Vida es una subsidiaria de propiedad total de Davos Life Science. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
El cáncer de páncreas es uno de los cánceres más letales en los Estados Unidos, ocupando el cuarto lugar entre las las principales causas de muertes relacionadas con el cáncer [1]. A pesar de la evolución del tratamiento, la tasa de mortalidad para los pacientes con cáncer de páncreas en general se ha mantenido sin cambios durante décadas. Las investigaciones sobre nuevas terapias y agentes quimiopreventivos están claramente justificadas.
Los estudios han sugerido que el aumento de la ingesta de frutas, verduras, dieta y granos de cereal puede disminuir el riesgo de cáncer de páncreas [2], [3], [4]. Tocotrienoles, que se encuentran en los granos de cereales, constituyen uno de los grupos más convincentes de compuestos bioactivos antitumorales [5]. Los tocotrienoles son un grupo de cuatro (α-, β-, δ-, γ-) insaturado, compuestos de origen natural de vitamina E que no sólo inhiben la proliferación de una variedad de células de tumores humanos, incluyendo cáncer de mama, colon, pulmón, y hepatocelular [ ,,,0],6], [7], [8], sino también exhibir propiedades quimiopreventivos [9], [10]. Sin embargo, ¿cómo se atenúan tocotrienoles la proliferación del tumor es poco conocida.
previamente demostrado que la δ-tocotrienol exhibe la actividad antitumoral más potente entre las cuatro isoformas de tocotrienol en células de cáncer de páncreas [11], [12]. En una fase continua I de escalada de dosis de ensayos clínicos en pacientes con cáncer de páncreas, los resultados preliminares revelaron que δ-tocotrienol tenía ninguna toxicidad evidente a velocidades de hasta 3200 mg /día, que es 5 veces la dosis clínica biológicamente activo predicho [13]. Estos resultados ponen de relieve la promesa de δ-tocotrienol para la intervención de cáncer de páncreas. Para traducir estos hallazgos en la clínica, es importante identificar biomarcadores relevantes de la actividad δ-tocotrienol para la fase temprana hipótesis impulsada por ensayos clínicos.
Para este fin, se investigó el modo δ-tocotrienoles inhiben el cáncer de páncreas el crecimiento celular e identificó la p27 inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina (CDK)
Kip1 como diana molecular de δ-tocotrienol. funciones p27
Kip1 como un supresor de tumores por su capacidad de bloquear la proliferación celular. p27
Kip1 es un supresor de tumores atípica porque las mutaciones de su gen son extremadamente raros. Sin embargo, las células tumorales se han desarrollado otros mecanismos para inactivar p27
Kip1, incluido el aumento de la degradación proteolítica y la exclusión del núcleo. De hecho, p27
pérdida Kip1 se ha asociado con la progresión del cáncer de páncreas y de mal pronóstico [14], [15], [16], [17]. Aquí, se presenta por primera vez que la p27
Kip1 juega un papel central en G inducida por δ-tocotrienol
1 detención. También se observó que la inducción de p27
Kip1 por δ-tocotrienol se produce a nivel de la transcripción mediada por la participación de E2F-1 promotor de activación y la inducción del ARNm.
Materiales y Métodos
purificada δ-tocotrienol fue suministrado inicialmente por el Dr. Barry Tan (Hadley, MA) (90% δ-tocotrienol y el 10% γ-tocotrienol; IC
50: 15-20 μΜ) y posteriormente por la vida Davos Ciencias (Singapur) (97% δ-tocotrienol; IC
50: 50 μΜ) disuelto en etanol como solución madre y se diluyó hasta la concentración requerida con DMEM
Líneas celulares y Cultura y
MIAPaCa-2, se obtuvieron SW1990, y BxPC-3 células de cáncer pancreático de la American Type Culture Collection (Manassas, VA) y se hicieron crecer a ~ 70% de confluencia en DMEM suplementado con 10% FBS. HPDE6 C7, una línea de conducto pancreático humano de células epiteliales inmortalizadas por transducción con genes E6 /E7 de VPH-16 (generosamente proporcionado por el Dr. Ming-Sound Tsao, Universidad de Toronto, Ontario, Canadá [18]), se cultivó en suero medio de queratinocitos libre como se describe anteriormente [18]. Fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs) que tiene una expresión estable de p27
Kip1 (+ /+) y p27
Kip1 (- /-) fueron proporcionados por el Dr. Pledger (Moffitt Cancer Center) [19], [20] y crecido en DMEM con 10% de FBS.
transfección
y Generación de clones estables
MIAPaCa-2 /p27 shRNA
Kip1 y MIAPaCa-2 /vector fueron generados por transfección de MIAPaCa-2 células con p27
Kip1 shRNA ya clonada en el vector pSuperiorRetroPuro (OligoEngine, Seattle, WA), una especie de regalo del Dr. J. Chen (Moffitt Cancer Center de) [21]. Se seleccionaron clones resistentes a la puromicina estable. Las transfecciones se llevaron a cabo con Metafectene (Biontex Laboratories, Planegg, Alemania), según el protocolo del fabricante.
siRNA desmontables de p27
Kip1 en MiaPaCa-2 células
prediseñado, siRNA para inhibidor de CDK 1B (p27
Kip1,#118714) y no específica siRNA (# 4611) se compraron de Ambion (Austin, TX). MIAPaCa-2 células se cultivaron durante la noche en placas de 12 pocillos sin antibiótico. La transfección transitoria de siARN se llevó a cabo utilizando reactivo de Oligofectamine (Invitrogen, Carlsbad, CA), según las instrucciones del fabricante. En breve, p27 5 nM
Kip1 siRNA o control de siRNA se mezcló con medio Opti-MEM (Invitrogen) en un volumen total de 90 l y luego complejado con 2 l de Oligofectamine y 8 l de Opti-MEM (volumen total de complejo fue de 100 l). Antes de la transfección, el medio viejo se desechó, las células se lavaron con fresco Opti-MEM, y 400 l de Opti-MEM fresco se colocaron en cada pocillo antes de añadir el complejo de RNA-Oligofectamine. Después de 8 horas, se añadieron 500 l de DMEM que contiene 30% de FBS y sin antibióticos a cada pocillo, y las células se incubaron adicionalmente durante 40 horas. Después de la transfección de 40 horas, las células fueron tratadas con δ-tocotrienol durante 24 horas adicionales y se recogieron para el análisis de transferencia Western y azul de tripano.
Se lisaron
La extracción de proteínas y Western blot
Las células cultivadas en reactivo de extracción de proteínas de mamíferos (Pierce, Rockford, IL), según el protocolo del fabricante. El anticuerpo para p27
Kip1 fue adquirido de BD Bioscience (San Jose, CA). Las membranas se bloquearon en cualquiera de 5% de leche en PBS (pH 7,4) que contiene 0,1% de Tween 20 o 1% de albúmina de suero bovino (BSA) en TBS (pH 7,5) que contiene 0,1% de Tween 20. fosfato anticuerpos específicos se incubaron en 2% de BSA en TBS (pH 7,5) que contiene 0,1% de Tween 20; todos los otros anticuerpos se diluyeron en 5% de leche en PBS (pH 7,4) que contiene 0,1% de Tween 20 durante la noche a 4 ° C. Rábano picante anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) se diluyeron en 5% de leche en PBS (pH 7,4) que contiene 0,1% de Tween 20 o TBS (pH 7,5) que contiene 0,1% de Tween 20 a una dilución 1:1000 durante 1 hora a temperatura ambiente. Western blots se visualizaron usando quimioluminiscencia potenciada (Pierce). Se utilizó el anticuerpo monoclonal de ratón beta-actina (catálogo#8H10D10) de Señalización Celular para garantizar la igualdad de proteínas de carga y de expresión.
anclaje independiente de ensayos de crecimiento
Para los ensayos de crecimiento de agar blando, se sembraron las células a 1 x 10
3 células /pocillo por triplicado en placas de cultivo de 12 pocillos en 0,35% de agar sobre una capa de agar 0,6%. Varias concentraciones de δ-tocotrienol o vehículo se incluyeron en la capa de agar 0,3% de las células. Los cultivos se alimentaron y se trataron con compuesto o vehículo semanal hasta que las colonias crecieron hasta un tamaño adecuado para la observación (~3-4 semanas). Las colonias fueron fotografiados después de la incubación con 1 mg /ml de MTT durante la noche y se contaron. El crecimiento de colonias tratadas-δ-tocotrienol se comparó con colonias tratadas con vehículo (control). Se realizaron tres experimentos separados.
FACS y Ensayo de proliferación celular
crecimiento exponencial células pancreáticas se cultivaron hasta 70% de confluencia en placas de 96 pocillos y se incubaron con concentraciones crecientes de δ-tocotrienol o vehículo para 24-72 horas. Los pocillos se examinaron para el crecimiento celular y la proliferación usando el ensayo colorimétrico MTT. IC
50 se determinaron los resultados para cada línea celular para cada punto de tiempo de 24 horas. Para el análisis del ciclo celular, las células pancreáticas se cultivaron hasta 70% de confluencia en placas de 100 mm y a continuación, privadas de suero durante 48 horas para permitir la sincronización. Después de 48 horas, el medio se aspiró y se añadió medio fresco con δ-tocotrienol (IC
50) o vehículo durante 24 horas. a continuación, se recogió medio tratado, las monocapas se lavaron con PBS frío, las células se tripsinizaron y se recogieron los sedimentos celulares. Los sedimentos celulares se lavaron dos veces con PBS, se fijaron en metanol frío, y vuelven a lavar con PBS para eliminar el metanol. Después de la resuspensión en 300 a 500 l de PBS, las células fueron digeridos con 20 mg /ml de RNasa y ADN celular se tiñó con yoduro de propidio (50 mg /ml) por incubación de 3 horas a temperatura ambiente en la oscuridad. la distribución del ciclo celular se analizó mediante citometría de flujo utilizando una fluorescencia de células activadas por la clasificación del sistema (FACS) (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Las células MiaPaCa-2
confocal Microscopía Análisis
tratadas (50.000) por 250 l de 20% de FBS-PBS se añadieron a cada ranura Cytofunnel y se centrifugó a 570 rpm durante 5 minutos a alta aceleración. Los portaobjetos se retiró y se secó al aire a temperatura ambiente. Las células se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 10 minutos, se lavaron tres veces con 1X PBS con agitación durante 5 minutos /lavado, y luego se permeabilizaron en 0,5% de Triton X-100 durante 5 minutos a temperatura ambiente. Las células fueron bloqueadas con 2% BSA-PBS (100 l) durante 30 minutos, y p27
anticuerpo Kip1 (1 :500) de dilución preparada en 2% de BSA se aplicó directamente. Los portaobjetos se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente en una cámara húmeda cerrada. Las células fueron lavadas tres veces con 1X PBS con agitación durante 5 minutos /lavado. anticuerpo secundario (Alexa Fluor 594) en PBS (1:500) se preparó y se añadió a las células fijadas. Los portaobjetos se incubaron de nuevo durante 1 hora a temperatura ambiente en cámara húmeda cerrada y después se lavaron tres veces con 1X PBS durante 5 minutos /lavado. Se añadió VectaShield (50 l) con DAPI, y se aplicaron cubreobjetos. Después de la incubación a 4 ° C en condiciones de oscuridad, los portaobjetos se examinan bajo un microscopio confocal.
citosólica y la proteína nuclear Extracción
Las proteínas se extrajeron usando NE-PER nuclear y citoplasmática kit de reactivo de extracción (Pierce ). Tratados MIAPaCa-2 células se aislaron como 20 l volumen de células empaquetadas (40 mg) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml por centrifugación de 5 minutos a 500 x g. Sobrenadante se descartó, se secaron los sedimentos celulares, y se añadieron los inhibidores de heladas CER-1 que contienen la proteasa (200 l). Los tubos se agitaron vigorosamente durante 15 segundos y se incubaron en hielo durante 10 minutos. A continuación, se añadió enfriado en hielo CERII (11 l) a los tubos, que se agitaron en vórtex durante 5 segundos y se incubaron en hielo durante 1 minuto, vórtex de nuevo durante 5 segundos, y luego se centrifugó a 14.000 × g durante 5 minutos. El sobrenadante (extracto citosólico) se transfirió a tubos frescos pre-refrigerados y se almacena a -80 ° C. Nos resuspendieron el sedimento insoluble que contiene núcleos en 100 l de TNE enfriado con hielo que contiene inhibidores de la proteasa. Los tubos se agitaron en vórtex durante 15 segundos y se mantuvieron en hielo durante 10 minutos. Este paso se repitió cuatro veces (40 minutos). Los tubos se centrifugaron a 14.000 xg durante 10 minutos, y el sobrenadante (extracto nuclear) se transfirieron a tubos enfriados previamente y se almacenan a -80 ° C.
luciferasa reportero de ensayo
MIAPaCa-2 Las células se sembraron en placas de 6 pocillos a 2 x 10
5 células /pocillo. Cada pocillo se transfectaron al día siguiente con 2 g de p27
plásmido indicador de luciferasa Kip1 (de larga duración p27
Kip1-1609, diferentes mutantes 5 'de deleción de ratón p27
Kip1 promotor indicador de luciferasa, o pGL- 3 ADNc de bases del vector vacío; todos los plásmidos proporcionados por el Dr. Pledger) junto con siRNA E2F-1 o no objetivo siRNA (Santa Cruz). Metafectene se utilizó como reactivo de transfección, según las instrucciones del fabricante. Los lisados se recogieron 24 horas después del tratamiento δ-tocotrienol (IC
50 50 M). La actividad de luciferasa se midió por el kit de sistema de ensayo de luciferasa (Promega). Para la normalización de la eficacia de transfección, 200 ng de Renilla reniformis plásmido de expresión de luciferasa (pRL-TK vector, Promega) se incluyó en la transfección.
se sembraron RT-PCR Análisis
células
MiaPaCa-2 en placas de 6 pocillos y se trataron con δ-tocotrienol (IC
50 50 M) o vehículo (como control) durante 24 horas. Las células se recogieron a continuación en tampón de lisis 1X, y el ARN se aisló utilizando el kit /proteína RNA Allprep según las instrucciones del fabricante (Qiagen, Valencia, CA). La transcripción inversa de ARN total se realizó utilizando el kit Superscript III (Invitrogen). Los siguientes cebadores directos e inversos, respectivamente, se utilizaron para la reacción de PCR: para p27
Kip1, 5'-TAACCCGGGACTTGGAGAAG y 5'-GCTTCTTGGGCGTCTGCTC para amplificar un producto de 450 pb; para actina, 5'-GCTCGTCGTCGACAACGGCT y 5'-CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC para amplificar un producto 353-bp. Para evitar la sobreamplificación, p27
los niveles de expresión de ARNm Kip1 se determinaron por RT-PCR en diferentes ciclos de amplificación (20, 25, 30, y 40 ciclos de PCR) y se analizaron por electroforesis en gel de agarosa. Los resultados representativos en el ciclo 40 se muestran.
Bloques de síntesis de proteínas cicloheximida
Después del tratamiento δ-tocotrienol de 12 horas (IC
50 50 M), δ-tocotrienol se eliminó mediante lavado MIAPaCa -2 células tres veces con PBS; A continuación se utilizó ciclohexamida (40 mg /ml) para bloquear la síntesis de proteínas. p27
índice de rotación Kip1 fue examinado por Western blot.
Declaración de Ética
Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de la Institutos Nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por la Universidad de Florida del Sur Institucional Cuidado de Animales y el empleo (Solicitud de 2805). Actividad
Anti-tumor en ratón desnudo modelo de xenoinjerto
Se utilizó hembra desnudos atímicos (nu /nu), 5-6 semanas de edad (Charles River, Wilmington, MA), para nuestros estudios con animales. Los animales se mantuvieron en jaulas limpias limitado a 4 ratones por jaula. Los ratones fueron atendidos con mucha comida y agua y se examinan diariamente. Si los tumores interfirieron con la deambulación, signos de pérdida de peso & gt causado; 10%, causado dificultad respiratoria, o creció a & gt;. 2 cm de tamaño, los ratones fueron humanamente sacrificados por la exposición a concentraciones crecientes de dióxido de carbono
se recogieron y se resuspendieron en PBS MIAPaCa-2 células (1 × 10
6 células /50 l) y un volumen igual de Matrigel (BD Biosciences). Las muestras celulares (100 mu l) se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho. Una vez que los tumores alcanzaron entre 250 y 300 mm
3, los ratones fueron asignados al azar en grupos de 10 y se dosifican por sonda oral con 0,1 ml de vehículo (aceite de oliva purificado) o δ-tocotrienol (100 mg /kg) al día durante 3 semanas. Los volúmenes tumorales se determinaron dos veces por semana mediante la medición de longitud (
l
) y anchura (
w
) y calculando el volumen: V = (
l
+
w
) /2 x (
l
×
w
) x 0,5236. La significación estadística entre el control y los animales tratados se determinó utilizando
t-test
.
La inmunohistoquímica de Student
y deslice cuantificación
Los tumores a partir de experimentos de xenoinjertos se fijaron en paraformaldehído al 4%, pH 7,2 . Después de la fijación, las muestras de tejido se procesaron en bloques de parafina. Los anticuerpos primarios utilizados en este estudio fueron monoclonal de ratón (p27, p-MAPK, y Ki-67) anticuerpos producidos contra los correspondientes antígenos de origen humano en secciones embebidas en parafina. La tinción inmunohistoquímica se realizó en un punto de referencia XT Ventana (Tucson, AZ) automatizado de tinción de portaobjetos, utilizando secciones de parafina de espesor de 4 micras de cada uno de los bloques tumorales representativas seleccionadas. Las secciones se desparafinaron, se rehidrataron, y se incubaron con 3% de H
2O
2 para bloquear la peroxidasa endógena. Después de antígeno desenmascarar el uso de solución CC1 patentada durante 60 minutos en línea (estándar) a 100 ° C, las secciones fueron incubadas con anticuerpos frente a p27 (Kip 1, cloneSX53G8) (dilución propietaria, Cell Marque, Rocklin, CA) y Ki-67 (propietaria dilución, Ventana, Tucson, AZ). Los tiempos de incubación fueron 32 minutos para p27 y Ki-67, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. /Anticuerpo monoclonal de conejo 42 MAPK fosfo-p44 (ERK1 /2) (Thr202 /Tyr204) (nº de catálogo 4376, la señalización celular, Danvers, MA.) Se utilizó a una concentración de 1: 200 en diluyentes PSS (Ventana) y se incubaron durante 32 minutos. El anti-anticuerpo secundario de conejo Ventana se utilizó durante 20 minutos. Las secciones se sometieron entonces al bloque de biotina usando un kit de biotina endógena Ventana (Ventana). Las secciones se incubaron con anticuerpo secundario marcado con biotina y estreptavidina-peroxidasa durante 30 minutos cada uno (Dako Diagnostics). Una solución de 3,3'-diaminobencideno tetrahidrocloruro (Sigma, St. Louis, MO) se utilizó como cromógeno seguido de azida de sodio y 20 l de H
20
2 en 100 ml de Tris-HCl (50 M, pH 7,6). Después de contraste de luz con hematoxilina de Harris, las secciones se examinan bajo el microscopio óptico.
Evaluación de las manchas
La expresión inmunohistoquímica de p27, se determinaron p-MAPK, y Ki-67 como proteínas el producto de la intensidad de inmunotinción y el porcentaje de células teñidas. Estos se califica en una escala de 0-3, siendo 3 el máximo. La intensidad de la inmunotinción se anotó sin manchas siendo 0, ligeras manchas como 1, tinción moderada como 2, y la tinción pesado como 3. El porcentaje de células teñidas se midió con ninguna tinción detectable como 0, 1-33% como 1, 34- 66% como 2, y 67-100% como 3. el resultado IHC fue el producto del porcentaje de células teñidas calificar multiplicado por la puntuación de intensidad, lo que permite obtener una puntuación máxima de 9 y una puntuación mínima de 0.
análisis
estadística
Los datos, expresados como medias ± SEM, se analizaron estadísticamente mediante prueba t no pareada o análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) en su caso. Utilizamos GraphPad Prism versión 5.04 para nuestro análisis. La significación estadística se fijó en
P
. & lt; 0,05
Resultados
δ-tocotrienol Inhibe el crecimiento dependiente de anclaje e independientes del celular e induce G
1 Detención en células de cáncer pancreático
Los efectos de la δ-tocotrienol (1A) sobre el crecimiento celular en células de cáncer de páncreas humano MIAPaCa-2, BxPC-3, y SW1990 se examinaron por 3- (4,5-dimetiltiazol-2- il) ensayo de bromuro (MTT) la proliferación de células -2,5-difeniltetrazolio. Las células se trataron con 0 a 50 M δ-tocotrienol por 24, 48, y 72 horas. Los efectos de la δ-tocotrienol también se evaluaron en la línea no transformada humana de páncreas ductal células epiteliales HPDE6 C7 para descartar posibles efectos citotóxicos de δ-tocotrienol en células no neoplásicas. tratamiento δ-tocotrienol inhibe la proliferación celular dependiente de anclaje de manera tanto tiempo y dependiente de la concentración en las células de cáncer de páncreas humanos (Figura 1B); Sin embargo, no significativa efectos inhibidores del crecimiento se observaron en las células HPDE6 C7. δ-tocotrienol tratamiento también inhibe la formación de colonias significativamente en MIAPaCa-2 células cultivadas en agar blando de 2,5 M (
P
= 0,02) (Figura 1C).
A, estructuras químicas de los tocotrienoles. B, δ-tocotrienol inhibe selectivamente la proliferación de células de cáncer de páncreas. HPDE6 C7 y líneas celulares de cáncer pancreático humano MIAPaCa2, BxPC3, y SW1990 se trataron con concentraciones crecientes de δ-tocotrienol o vehículo y se analizaron mediante MTT a las 24, 48, y 72 horas. Los resultados demuestran la inhibición selectiva de las células de cáncer de páncreas de una manera tiempo y dependiente de la dosis. C, δ-tocotrienol inhibe el crecimiento independiente de anclaje de células de cáncer pancreático MIAPaCa-2 transformadas. Número de colonias se normalizó y en comparación con vehículo. * Concentración a la que comienza la significación estadística. D, efectos de δ-tocotrienol en la progresión del ciclo celular. células de cáncer pancreático y células HPDE6 C7 se incubaron en presencia de δ-tocotrienol (IC
50) (gris) o vehículo (negro) como control durante 24 horas. Las células se recogieron para la determinación de la distribución del ciclo celular mediante análisis FACS después de tinción de las células con yoduro de propidio. Cada análisis representa la media ± SD de 3 experimentos independientes. δ-tocotrienol inhibe G
1-a-S progresión del ciclo celular de manera selectiva en líneas celulares de cáncer de páncreas transformadas.
δ-tocotrienol tratamiento también tenía un efecto selectivo significativo en la progresión del ciclo celular, como se demostrado por un aumento en el porcentaje de células de cáncer de páncreas pero no las células HPDE6 C7 en el G
1 fase (
P
& lt; 0,001 vs.
P
= 0,92) (Figura 1D ). Se encontró que las células de cáncer pancreático acumulados en el G
1 fase a expensas de una disminución en la población S-fase.
δ-tocotrienol induce p27
Expresión Kip1 e inhibe RAS-MEK -ERK Signaling
regulación de las vías de señalización intracelular es central para la capacidad de los oncogenes para promover la progresión del ciclo celular. Dos vías principales íntimamente involucrados en el G
1-a-S de recorrido son las vías RAF-MEK-ERK y PI3-AKT-RAS activadas. Estas vías de influir en la expresión, la actividad, o la localización subcelular de los componentes clave de la maquinaria del ciclo celular, tales como ciclinas, CDK, y los inhibidores de CDK, que conduce a la activación apropiada de los factores E2F-1 de transcripción. Varios agentes se han descrito que regulan el G
1 de desplazamiento y la transición a la fase S en células de cáncer de páncreas, y p27
Kip1 se ha informado de que se aumentó en estos agentes [22], [23], [ ,,,0],24], [25], [26]. Por lo tanto, se determinó la cinética de p27
Kip1 niveles y actividad de la vía RAF-MEK-ERK en células de cáncer de páncreas y en las células expuestas a HPDE6 C7 δ-tocotrienol. Se encontró que δ-tocotrienol aumentó significativamente
niveles de p27 Kip1 por 6 horas en las células de cáncer de páncreas (Figura 2A). Este aumento de nivel se mantuvo y aumentó en todas las líneas celulares por 48 horas y se asocia con correspondiente inhibición de la actividad de la vía de señalización RAF-MEK-ERK activado, tal como se mide por la disminución de los niveles de MEK y ERK fosforiladas en las células de cáncer de páncreas (Figura 2A ). En contraste, la vía de la PI3-AKT se indujo inicialmente a las 12 horas, seguido de la inhibición de la posterior a las 24 horas, medida por los niveles de AKT fosforilada (Figura 2A y 2B). Consistente con el efecto sobre la proliferación, δ-tocotrienol suprimida p27
niveles Kip1 en la línea de no transformado pancreática humana célula ductal, HPDE6 C7, y no tuvo efecto en MEK, ERK, o AKT. También puso de manifiesto que los efectos de δ-tocotrienol eran específicos de las células malignas, como δ-tocotrienol no indujo p27
niveles Kip1 o alterar MEK, ERK, o la expresión de AKT en las células epiteliales ductales pancreáticas no transformadas. Los mecanismos de esta necesitan más investigaciones.
A, cáncer de páncreas y células HPDE6 C7 fueron tratados con δ-tocotrienol en IC predeterminada
50 para cada línea celular. Proteína lisados de 0-48 horas se recogieron y analizaron por Western blot para la señalización de Ras oncogénico objetivos, MEK y ERK y p27
Kip1. Los resultados son representativos de 3 experimentos independientes. δ-tocotrienol inhibe selectivamente la señalización MAP quinasa p27 y aumenta
Kip1 expresión en células de cáncer de páncreas transformadas. B, MIAPaCa-2 células fueron tratados con δ-tocotrienol en IC predeterminado
50. Proteína lisados de 0-24 horas se recogieron y se analizaron por Western blot para AKT y un objetivo corriente abajo GSK-3β. C, MIAPaCa-2 células se trataron con vehículo o δ-tocotrienol en FBS durante 12 horas, y se aislaron las fracciones nucleares y citosólicas puros. Las transferencias Western muestran niveles de p27
Kip1 se incrementaron en las células tratadas δ-tocotrienol con altas concentraciones en el núcleo. D, al mismo tiempo, las células enteras se tiñeron con inmunofluorescencia p27
anticuerpo Kip1 y analizadas por microscopía de fluorescencia para p27
Kip1 localización. δ-tocotrienol localizada p27
Kip1 al núcleo similar al estado de hambre, mientras que las células tratadas con suero mostraron niveles iguales de p27
Kip1 en el núcleo y el citoplasma. E, δ-tocotrienol (DT3) suprime el crecimiento de células tumorales de MIAPaCa-2 células en presencia de mevalonato añadido, un metabolito de la reductasa de HMG-CoA. MIAPaCa-2 células (en placas de 96 pocillos) fueron tratados durante 24 horas con δ-tocotrienol o lovastatina en ausencia o presencia de concentraciones crecientes de mevalonato. Los resultados demuestran que el MTT mevalonato rescata a los efectos inhibidores del crecimiento de la lovastatina, pero no el de δ-tocotrienol. En E, líneas 1 y 7 no tenían δ-tocotrienol (DT3) o lovastatina.
Además de la modulación de sus niveles de expresión, localización subcelular es también importante en el gobierno de p27
función Kip1. Para actuar como un inhibidor del ciclo celular, p27
Kip1 deben estar ubicados en el núcleo, mientras que su mislocalization citoplasmática favorece la progresión del ciclo celular y puede contribuir a la transformación celular [27], [28]. La Figura 2C muestra que p27
niveles Kip1 se incrementan tanto en el citosol y los compartimentos nucleares de células MIAPaCa-2 tratados con δ-tocotrienol en comparación con vehículo. En la Figura 2D, se observó p27
Kip1 acumulación citoplasmática en MIAPaCa-2 células tratadas con vehículo frente al aumento del p27
niveles Kip1 en el compartimento nuclear de MiaPaCa-2 células en reposo privadas de suero y MIAPaCa- tratado con δ-tocotrienol 2 células. Algunos autores han sugerido que los tocotrienoles modulan la actividad de la reductasa HMG-CoA a través de las acciones post-transcripcional, lo cual inhibe la farnesilación de los objetivos de señalización oncogénicas aguas abajo, similar a los efectos de la lovastatina [29], [30], [31]. Para determinar si δ-tocotrienol inhibe la proliferación a través de la inhibición de la vía del mevalonato, se trataron MIAPaCa-2 células con δ-tocotrienol o lovastatina y con concentraciones crecientes de mevalonato, un producto aguas abajo de la reductasa de HMG-CoA. La adición de mevalonato a delta-tocotrienol células tratadas resultó en no rescate significativa de los efectos inhibidores del crecimiento de δ-tocotrienol en MIAPaCa-2 células (Figura 2e); Sin embargo, la capacidad de lovastatina para inhibir la proliferación fue rescatado por mevalonato.
p27
Kip1 se requiere para la δ-tocotrienol inducida por G
1 Detención
Para determinar el papel de p27
inducción Kip1 en la inhibición del crecimiento de células de cáncer de páncreas δ-tocotrienol, que reduce transitoriamente p27
Kip1 expresión en MIAPaCa-2 células utilizando p27
Kip1 pequeños ARN de interferencia (siRNA, confirmado por Western blot). A las 24 horas, la ausencia de p27
Kip1 expresión abrogada significativamente la inhibición del crecimiento celular inducida por δ-tocotrienol (Figura 3A). Para confirmar estos hallazgos, las líneas celulares estables que expresan p27
Kip1 corto horquilla RNA (shRNA) o vector fueron creados usando MIAPaCa-2 células. p27 reducida
Kip1 expresión se confirmó mediante análisis de Western blot. La Figura 3B muestra que el agotamiento de p27
Kip1 dio lugar a la resistencia al tratamiento δ-tocotrienol. Para investigar si estas observaciones se podrían generalizar más allá de MIAPaCa-2 células, se analizaron los MEF estables [19], [20] que exhibe p27
Kip1 ronda o células de tipo salvaje después del tratamiento δ-tocotrienol. Se encontró que la falta de p27
Kip1 rindió MEFs parcialmente resistentes a los efectos antiproliferativos de δ-tocotrienol en esta línea celular (Figura 3C). En conjunto, estos estudios subrayan la importancia de p27
Kip1 en inducida por δ-tocotrienol G
1 detención y muestran que la contribución de este inhibidor de CDK no es la línea celular específica.
A, p27
Kip1 siRNA atenúa la supresión del crecimiento δ-tocotrienol mediado en células de cáncer de páncreas MIAPaCa-2 humanos.