Extracto
4-methylthiobutyl isotiocianato (MTBITC), un grupo alifático, compuesto sulfúrico a partir de
Brassica
verduras, posee
in vitro
y
in vivo
actividad antitumoral. Recientemente hemos demostrado el potencial inhibidor del crecimiento potente del agente que daña el ADN MTBITC en células de cáncer de hígado humano. Aquí estamos ahora mostramos que MTBITC regula hacia abajo la telomerasa, que sensibiliza a las células a la inducción de apoptosis. Este es mediada por la activación de MAPK, pero independiente de la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS). Dentro de una hora, MTBITC induce daño en el ADN en las células cancerosas que se correlacionan con un aumento transitorio en la expresión de hTERT mRNA que después se convirtió en la supresión de la telomerasa, evidente en mRNA así como el nivel de actividad de la enzima. Para aclarar el papel de MAPK para la regulación de la telomerasa, las células de cáncer de hígado fueron pre-tratados con inhibidores de MAPK-específica antes de la exposición MTBITC. Esto demostró claramente que la elevación transitoria de la expresión de hTERT mRNA fue predominantemente mediada por el miembro de la familia MAPK JNK. Por el contrario, activado ERK1 /2 y p38, pero no JNK, una señal a la derogación de la telomerasa y la consiguiente inducción de la apoptosis. daño en el ADN por MTBITC también fue fuertemente suprimida por la inhibición de MAPK. El estrés oxidativo, como se analizó por ensayo de fluorescencia DCF, la espectroscopia de resonancia de espín electrónico y la formación de 4-hydroxynonenal fue encontrado como no relevantes para este proceso. Además, la N-acetilcisteína pre-tratamiento no tuvo impacto en la supresión de la telomerasa-MTBITC inducido o despolarización de la potencial de membrana mitocondrial como marcador de la apoptosis. Por tanto, nuestros datos implican que al daño en el ADN por MTBITC, MAPK son esenciales para la regulación de la telomerasa y el consiguiente deterioro del crecimiento en las células tumorales del hígado y este detalle probablemente juega un papel importante en la comprensión de la potencial eficacia quimioterapéutica de ITC
Visto.: Lamy, E, C Herz, Lutz-Bonengel S, Hertrampf a, Márton MR, Mersch-Sundermann V (2013) La vía MAPK señales de modulación de la telomerasa en respuesta al daño del ADN inducido por isotiocianato de células de cáncer de hígado humano. PLoS ONE 8 (1): e53240. doi: 10.1371 /journal.pone.0053240
Editor: P. Srikumar Chellappan, H. Lee Moffitt Centro de Cáncer & amp; Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 2 Julio, 2012; Aceptado: 27 Noviembre 2012; Publicado: 31 Enero 2013
Derechos de Autor © 2013 Lamy et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. E. L. está financiado por una beca académica de la Fond Social Europeo y el Ministerio de Ciencia, Investigación y Arte de Baden-Württemberg, Alemania. M-R.M. fue financiada parcialmente para este proyecto por el Programa Operativo Sectorial "Desarrollo de Recursos Humanos 2007-2013" del Ministerio de Trabajo, Familia y Protección Social de Rumania a través del convenio financiero POSDRU /88 /1,5 /S /60203. El estudio fue apoyado en parte por una subvención de la Fundación Mattern, Alemania. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
telomerasa proporciona un objetivo prometedor para un
selectiva
enfoque terapéutico de tumores malignos en que del 80 al 90% de las células cancerosas de manera estable (re) expresan esta enzima, mientras que se reprime en la mayoría de los tejidos somáticos normales [ ,,,0],1]. hTERT, la subunidad catalítica de la enzima, se sabe que ejercen efectos anti-apoptóticos e interactuar con la vía de respuesta al daño del ADN. En consecuencia, las células cancerosas son más resistentes frente a agentes quimioterapéuticos o radioterapia [2], [3], [4], [5].
Los isotiocianatos (ITC), de origen natural constituyentes secundarios de las plantas de la familia
Brassicaceae, España son conocidos por su quimiopreventivo y acciones tanto -therapeutic
in vitro
y
in vivo
[6], [7], [8]. Un número de estudios describe el crecimiento, la supresión de la apoptosis y la inducción de la potencia de este grupo en las células cancerosas y investigados vías de señalización subyacentes [9]. ITC se ha demostrado que interfiere con muchos factores que son alterados en células cancerosas tales como la interacción con la familia Bcl-2, sino que también se ha demostrado para disminuir selectivamente la actividad de HDAC [10]. Recientemente, se mostró ITC inhibidores de la telomerasa como potentes durante la inducción de la apoptosis en diferentes células del cáncer [11], [12], [13], [14]. El sulforafano (SFN), e. gramo. suprimido telomerasa durante su inhibición de la proliferación de las células MCF-7, así como MDA-MB-231 células de cáncer de mama [11]. La telomerasa derogación por SFN o feniletilo ITC también se correlaciona con la muerte programada en HeLa cervical, así como las células de cáncer de próstata PC-3 [13], [14]. SFN inhibe además la telomerasa en las células de cáncer de hígado Hep3B humanos que paralelos a la muerte celular programada [12]. a continuación, se sugirió Esta inhibición estar mediada por la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS). Otros estudios han demostrado hasta ahora que el estrés oxidativo y la activación de la (MAPK) vía de señalización activada por mitógenos estaban involucrados en la muerte de las células cancerosas por el CCI [15]. Sin embargo, los datos publicados hasta ahora implican que las ROS dependencia de la muerte celular, así como la participación de MAPK podría ser específico de célula.
En estudios anteriores, ya se ha demostrado el deterioro del crecimiento eficiente de las células del cáncer de hígado por el CCI [16]. por tanto, nos propusimos en el presente estudio para investigar la relevancia de la activación de MAPK y el estrés oxidativo de la muerte celular y la regulación de la telomerasa en las células de cáncer de hígado humano. Por lo tanto utilizamos líneas telomerasa HCC positivo celulares (HepG2, Huh7 y Hep 3B) que difieren en su p53 supresor de tumor de estado (TP53), así como los hepatocitos primarios humanos sanos, desprovistos de la telomerasa. Nuestros resultados confirman la activación de los tres MAPK (JNK, ERK1 /2 y p38) por tratamiento MTBITC independiente del TP53 o el estado de malignidad de las células. Hemos podido demostrar, además, que el deterioro del crecimiento, así como cambios en el nivel de la telomerasa fue señalado por MAPK, pero no están relacionados con la producción de ROS. daño en el ADN provocada por MTBITC fue inhibida en las células cuando MAPK fueron bloqueados específicamente.
Materiales y Métodos
Químicos
N-acetilcisteína (NAC), menadiona, 2 ', 7 'diclorofluoresceno diacetat (DCF-DA), dexametasona, Tween® 20, benzo [a] pireno (B (a) P y yoduro de propidio (PI) fueron adquiridos de Sigma Aldrich (Steinheim, Alemania) DMSO (pureza & gt;. 99% ) era de Applichem (Darmstadt, Alemania). β-mercaptoetanol y valinomicina fue adquirido de Fluka (Buchs, Suiza). Dulbecco Minimal Essential Medium (DMEM), suero de ternera fetal (FCS), tripsina 10 × (25 mg /ml), tripsina-EDTA 10 × (5 mg /ml, respectivamente 2,2 mg /ml), L-glutamina y solución salina tamponada con fosfato (PBS, sin Ca y mg) eran de PAA Laboratories GmbH (en Cölbe, Alemania). penicilina-estreptomicina (P /S) solución, RPMI-1640, 5,5 ', 6,6'-tetracloro-1,1', 3,3'-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine yoduro (JC-1), insulina-transferrina-Selen (ITS) y SYBR oro 10.000 × eran de Invitrogen Life Technologies (Darmstadt, Alemania) ,. 4-hydroxynonenal (HNE) se adquirió de Cayman Europa (Tallin, Estonia). isotiocianato de 4-methylthiobutyl (MTBITC, erucin) se sintetizó por el Inst. de Química Orgánica de la Universidad de Giessen, Alemania, como se describe antes [17].
El p38 inhibidor SB203580, SP600125 inhibidor de JNK y inhibidor de JNK V fueron adquiridos de Santa Cruz, (California, EE.UU.). La ERK1 /2 inhibidor U0126, un inhibidor de p38 SB202190 y ERK1 /2 inhibidor PB98059 se obtuvieron a partir de la célula de señalización (Boston, EE.UU.). Los siguientes anticuerpos primarios fueron utilizados para inmunotransferencia anti-p-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr201, 1:2000), anti-p-JNK (Thr 183 /Tyr185, 1:2000, clon G9), anti-pc-Jun Ser73 y anti-p-p38 (Thr180 /Tyr182, 1:500) de señalización celular, anti-4-hidroxinonenal (1:250; clon 198960) a partir de I + amp; D Systems Europe (Abingdon, Inglaterra) y anti-beta-actina (1:10000, clonar AC-74) a partir de Sigma Aldrich. La peroxidasa de rábano picante (HRP) itrio anticuerpos secundarios anti-ratón y anti-conejo fueron adquiridos de Señalización Celular. agua libre de nucleasa fue de Qiagen (Hilden, Alemania). Caspasa 3/7 reactivo GLO era de Promega (Mannheim, Alemania). inhibidores MTBITC, menadiona y la MAPK se disolvieron en DMSO estéril. HNE se disolvió en etanol.
Las líneas celulares de HCC
HepG2 (wt-p53) y Hep3B (null-p53) líneas celulares se obtuvieron de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ) , Braunschweig, Alemania. Huh-7 células (mut-p53) establecidas originalmente por Nakabayashi et al. [18] fueron amablemente proporcionados por H. Blum (Centro Médico de la Universidad de Friburgo, Alemania). Las células se cultivaron en DMEM bajo de glucosa suplementado con 15% (HepG2) o 10% (Huh7, Hep3B) de FCS y 1% P /S en un 5% de CO
2 atmósfera a 37 ° C hasta 70% de confluencia y se posteriormente recolectadas con tripsina. verificación de línea celular se hace comprobando microscópicamente la morfología de las células y la realización de análisis de la curva de crecimiento en una base regular. Sólo las células en el paso número nueve y cincuenta y seis fueron utilizados. El cultivo celular fue, además, resultaron negativos a la contaminación por micoplasma.
Primaria hepatocitos humanos
hepatocitos normales fueron aislados dentro de 2 h de material tomado de los pacientes que habían sido sometidos a hepatectomía parcial y de la que antes tenía el consentimiento por escrito ha obtenido. Esta parte fue aprobado por el comité de ética de la Universidad de Friburgo. Evaluación del parénquima hepático no tumoral fue realizada por un patólogo de alto nivel con experiencia en patología hepática. Los hepatocitos se aislaron utilizando la técnica de dos pasos colagenasa perfusión de acuerdo con un protocolo modificado de Guguen-Guillouzo
et al.
[19] y Strom
et al.
[20]. Después las células se resuspendieron finalmente en medio RPMI-1640 suplementado con 15% de FCS, 2 mM L-glutamina 1% P /S, 1% ITS, 100 nM de dexametasona y se cultivaron en un CO 5%
2 atmósfera a 37 ° C durante 20 h.
Determinación del efecto del fármaco
efecto del fármaco se probó a principios de los pasajes (P4-P10). Para los experimentos, las células fueron sembradas, suplementado con medio de cultivo y se incubaron durante 48 horas a 37 ° C, 5% de CO
2 atmósfera. Después de eso, las células subconfluentes fueron expuestas a MTBITC durante 1 a 48 h y posteriormente se procesaron para los ensayos. En algunos experimentos, las células subconfluentes fueron pre-tratados con el antioxidante N-acetilcisteína (NAC) a concentraciones entre 1,25 a 10 mM durante 1 h. Luego, las células se lavaron a fondo con PBS antes de añadir MTBITC para otro 24 h y la preparación de ensayo subsiguiente. En otros experimentos, las células subconfluentes se trataron previamente durante una hora con inhibidores de MAPK específicos, ya sea 10 M SB203580, 2,5 M o 5 M SP600125 o 40 mM PB98059 o pre-tratamiento por 2 h con 10 M U0126, 20 mM JNK inhibidor V o 20 mu M SB202190. Una combinación de inhibidores también fue probado. Luego, las células se lavaron a fondo con PBS antes de añadir MTBITC o 0,1% de DMSO como disolvente de control y la preparación de ensayo subsiguiente.
Single Cell electroforesis en gel (SCGE) Ensayo
El ensayo SCGE también conocido como cometa ensayo se llevó a cabo como se describe anteriormente [21]. El ADN de la cola% se calculó como indicador de daño en el ADN. Para cada muestra, se evaluaron 102 células examinadas sistemáticamente.
contenido de ADN subG1 y ciclo Cell Distribution
contenido de ADN celular se midió después de la permeabilización de las células de HCC cosechadas por fijación con 70% de hielo de etanol frío para la al menos 24 h y la tinción del ADN con mezcla maestra PI (/yoduro de propidio 40 mg ml, 100 mg /ml de ARNasa (DNasa libre), PBS), lo que permite el análisis de un histograma de frecuencias contenido de ADN. El análisis se realizó por citometría de flujo utilizando un FACSCalibur (BD). El Modfit
© software se utilizó para deconvolute los histogramas para estimar la proporción de células en fases particulares del ciclo celular; la célula de Quest Pro
© se utilizó el software y el software FlowJo (TreeStar Inc, Ashlandd, EE.UU.) para cuantificar el porcentaje de células apoptóticas en el "sub-G1" o pico "hypoploid".
caspasa 3 /7 escisión Ensayo
La caspasa 3/7 de escisión se utiliza como parámetro específico para la inducción de la apoptosis. Esto se determinó en células HepG2 utilizando el ensayo Caspase3 /7-Glo (Promega, Alemania) según las instrucciones del fabricante.
Evaluación de la membrana mitocondrial potencial (MMP)
Para la detección de cambios en la MMP a nivel de células individuales, se utilizó el catión lipófilo JC-1. Las muestras tratadas se recogieron mediante tripsinización, se lavaron dos veces con PBS y se resuspendieron en 1 ml de medio de cultivo suplementado con la sonda JC-1 a una concentración final de 2,5 mg /ml. Las muestras se resuspendieron y se incubaron en condiciones de cultivo celular durante 30 min. Antes del análisis, las células se lavaron dos veces con PBS frío y después se analizaron directamente por un FACSCalibur (BD, Heidelberg, Alemania).
Detección de la célula senescencia por ß-galactosidasa de tinción
se detectó
Senescencia usando el kit de tinción de ß-galactosidasa de senescencia (Cell Signaling Technology, Boston, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Después del tratamiento de células con MTBITC o controla las imágenes fueron capturados utilizando un microscopio de luz brillante (compacto sistema de microscopio 8100E, Keyence, Osaka, Japón), con un objetivo del Plan Apo 4 × /0,2 y un aumento óptico de 4 × (Nikon, Japón).
Análisis de proteínas por inmunotransferencia
Las proteínas se analizaron por inmunotransferencia después de un protocolo modificado de Burnette [22]. Se determinó la concentración de proteínas como se ha descrito por Bradford [23]. Para inmunotransferencia, 20 g de proteína se mezclaron con tampón de muestra que contienen hecho SDS-Ready, suplementado con 1% de beta-mercaptoetanol. La electroforesis se realizó de acuerdo con el método de Laemmli [24]. A continuación, el gel se transfirió a una membrana de nitrocelulosa mediante transferencia húmeda (0,7 mA /cm
2, 90 min.), se bloquearon con leche baja en grasa al 5% en TBS /Tween al 0,1% y se incubaron con anticuerpo primario durante 1 h a TA o durante la noche a 4 ° C, y posteriormente peroxidasa de rábano picante (HRP) marcada con anticuerpo secundario durante 1 h a TA, cada uno. Después de la incubación de anticuerpos, las proteínas de interés se detectaron mediante la técnica de quimioluminiscencia. Una imagen digital del western blot fue capturado por el sistema de documentación de geles molecular Imager® ChemiDoc ™ XRS Sytem (Bio-Rad, Munich, Alemania). aproximaciones Tamaño fueron tomadas por la comparación de las bandas teñidas a la de un estándar de proteína cargada durante la electroforesis. El proceso se repitió para la proteína estructural beta-actina. La cantidad de proteína diana podría entonces ser indexado a la proteína estructural de controlar entre los grupos.
telomerasa de medición de actividad por
Actividad de la telomerasa TRAP-ensayo se detectó usando el ELISA Kit TeloTAGGG, disponible comercialmente de Roche (Mannheim, Alemania). El ensayo se llevó a cabo después de las instrucciones de los fabricantes con ligeras modificaciones. Para lisados de proteínas enteras se lisaron las células, utilizando reactivo lítico célula a partir de Sigma Aldrich contiene PSMF 10 mM y 5 mM beta-mercaptoetanol durante 30 min a 4 ° C. Se determinó la concentración de proteínas según el método descrito por Bradford [23]. Para la reacción de la telomerasa, un volumen total de reacción de 50 l con cantidades iguales de proteína y 2 × TeloTAGGG mezcla de reacción se incubó a 25 ° C durante 20 min seguido de desnaturalización a 94 ° C, 5 min, 30 ciclos (a 94 ° C para 30 s, a 50 ° C durante 30 s, y a 72 ° C, 90 s). elongación final se realizó a 72 ° C, 10 min. Como controles negativos, un volumen igual de solución de lisis, el agua libre de nucleasa y se inactivó con calor 0,1% de los tratados DMSO muestra (95 ° C durante 5 min) fueron utilizados. 5 l o 2,5 l productos de PCR se utilizaron para el protocolo de ELISA de acuerdo de fabricación. 30 l de los productos de PCR se cargaron con 1 x tampón de carga en un gel de poliacrilamida TBE /12,5%; electroforesis se realizó a 50 V durante 30 min y posterior 180 V durante 5-6 h. El gel se tiñó con solución 1 × SYBR Gold /TBE durante 20 minutos y se detectó bajo luz UV. Para la determinación del peso molecular, se utilizó 1 g de 50 pb escalera de ADN (Fermentas, St. Leon-Rot, Alemania).
Cuantitativo PCR en tiempo real de cuerpo entero hTERT transcripción
El ARN total se aisló con el kit RNeasy mini Aislamiento de Qiagen (Hilden, Alemania), seguido por una etapa de purificación utilizando el kit de RNasa libre de DNasa de Qiagen. La transcripción inversa de 1 mg de ARN total de cada muestra se realizó en 20 l usando el kit de síntesis de ADNc de primera cadena de Fermentas. Un fragmento de 168 pb de hTERT cDNA se amplificó usando los siguientes oligonucleótidos a la concentración final indicada: Sense 5'GACACCATCCCCCAGGAĆ3 (50 nM) y 5'TCGTGGAATGTTACGAGCAG3 antisentido (50 nM). tiempo real cuantitativa (QRT -) - reacción de PCR se realizó en un volumen total de 25 l, que contiene Maxima SYBR Green qPCR Master Mix 2 × (Fermentas), indica la concentración de avance y retroceso del cebador y 2,5 l de cDNA utilizando 96 pocillos de 0,2 ml placas de pared delgada PCR en tiempo real y MyIQ PCR System (Bio-Rad, München, Alemania). Las condiciones de QRT-PCR fueron: 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 10 s, 54 ° C durante 60 s. Los datos fueron recogidos durante la etapa de elongación. Posteriormente una curva de fusión se llevó a cabo para verificar la especificidad de los pares de cebadores. Para normalizar las cantidades, se utilizó el PBDG gen de referencia con los siguientes oligonucleótidos: 5'AGGATGGGCAACTGTACCTG3 sentido (150 nM) y 5'TCGTGGAATGTTACGAGCAG3 antisentido (150 nM). Un fragmento de 116 pb fue producido. El método comparativo Ct se utilizó para calcular las cantidades relativas de mRNA de hTERT [25]. Cada reacción de QRT-PCR se realizó por triplicado.
La detección de ROS Producción por DCF-DA y Spin Electrónico Espectroscopia de Resonancia
Para la detección de ROS mediante DCF-DA, se recogieron las células expuestas-MTBITC, se resuspendieron en medio de cultivo fresco y se incubaron inmediatamente con DCF-DA a una concentración de 5 nM para 15 min. a 37 ° C en la oscuridad. A continuación, la fluorescencia DCF se midió con un FACSCalibur.
Para la detección de ROS utilizando resonancia de spin electrónico (ESR) Espectroscopia de la sonda de giro permeable celular alta 1-hidroxi-3-metoxi-carbonil-2,2,5,5 y se utilizó la resonancia de spin electrónico (ESR) espectroscopio e-Scan equipado con regulador de temperatura y gas BioIII (Noxygen); clorhidrato -tetramethylpyrolidine (Diagnostics GmbH, Elzach, Alemania CMH, Noxygen Ciencia Transfer & amp). Se incubaron las células en crecimiento adherido durante 1-6 h con MTBITC, 100 mM menadiona o 0,1% de DMSO en medio de cultivo. Después, las células se lavaron una vez con tampón de Krebs-HEPES suplementado con 25 mM de deferoxamina (DFO) y 5 M diethyldithiocarbonate (DETC, Noxygen) y se incubaron con 100 mM sonda de giro CMH en tampón Krebs-HEPES durante 15 min a 37 ° C. Los sobrenadantes se transfirieron a nuevos tubos de reacción y se mantienen en hielo. Los espectros de ESR se midieron en 50 capilares de vidrio mu l. Se utilizaron siguiente configuración de instrumentos: microondas 9.772GHZ frecuencia y potencia 21.120 mW, la ganancia del receptor 1,00E + 003, fase 0.20 deg, armónico y modificado amplitud 2,32 g, conversión de la señal de canal 10.240 ms, tiempo constantes 40.960 ms y tiempo de barrido de 5,24 s. El número de exploraciones fue de 5 a 20.
citometría de flujo y deposición de células individuales
Las células individuales (HepG2) fueron depositados en pocillos individuales de placas de 96 pocillos (Thermo Scientific, Bonn, Alemania ) usando un clasificador de células MoFlo (Dako, Glostrup, Dinamarca). Las células fueron ordenados utilizando adelante (el ángulo bajo, FSC) frente a dispersión lateral (90 ° -scatter, SSC) señales para distinguir entre células y restos vivos y muertos, y el área de dispersión hacia adelante frente ancho de pulso para distinguir entre las células individuales y las células unidas el uno al otro. No se colocaron las células en la fila 12, y estos puntos se utilizaron para 4 controles negativos de PCR positivos y 4, respectivamente.
El tratamiento de las células con irradiación UV
Los descubiertas placas de 96 pocillos que contienen células individuales se sometieron a irradiación UV durante 10 min. el uso de una cámara de descontaminación UV. La fuente de UV fue una lámpara germicida Osram de 30 vatios (UVC potencia radiada 200-280 nm 13,4 W). La eficacia de la irradiación UV para destruir ADN de doble hebra se sometió a ensayo mediante la amplificación de fragmentos de ADN de cuatro tamaños de 143 pb a 1337 pb.
ADNmt de amplificación
amplificación de ADNmt a partir de células tratadas y no tratadas se llevó a cabo en placas de 96 pocillos tal como se recibió de la técnica de deposición de células individuales. A cada pocillo 5 l de PCR Master Mix contiene 1 × Advantage 2 PCR buffer (Clontech, BD Biosciences, CA, EE.UU.), 0,1 l de Advantage 2 mezcla de la polimerasa (Clontech), 200 mM de cada dNTP (Bioline, Luckenwalde, Alemania) y se añadieron 0,4 M de cada cebador (F14816 /R16152, F16197 /R00293, F00314 /R00639 y F08294 /R08436, véase la Tabla 1) (Biomers, Ulm, Alemania). La amplificación por PCR se realizó en un termociclador PTC 200 (MJ Research, Waltham, MA, EE.UU.) con las siguientes condiciones de ciclo térmico: 95 ° C durante 2 min, 38 ciclos de 95 ° C durante 15 s, 56 ° C durante 30 s , 72 ° C durante 90 s, seguida de una fase de extensión final a 72 ° C durante 10 min. Toda la reacción se visualizó bajo condiciones estandarizadas en un gel de agarosa al 2% (50 ml de agarosa con 4 l SybrSafe (Invitrogen Carlsbad, CA), la electroforesis durante 25 min a 60 V, seguido de exposición a la luz UV durante 160 mseg).
Análisis de datos
Los resultados fueron analizados utilizando GraphPad Prism software 5 (GraphPad software Inc., La Jolla, EE.UU.). La significación estadística (p = 0.05, p≤0.01) de tratamiento MTBITC de los parámetros investigados en células de HCC se calculó en contra del control de disolvente, DMSO al 0,1%. Para determinar la importancia de la inhibición específica MAPK en los puntos finales investigados, muestras tratadas con MTBITC se calcularon en contra de la respectiva contraparte tratados con inhibidor de usar el ANOVA de una vía seguido por corrección de Bonferroni.
Resultados
nDNA es dañado por MTBITC que desencadena Expresión transitoria hTERT mRNA
primer lugar, investigó el daño de nDNA en las células HepG2 después de la exposición MTBITC 25 mM. Después de 1 h, nDNA de las células tratadas con MTBITC fue dañado de manera significativa, como se determinó por el ensayo de cometa (figura 1a). Esto se correlacionó con una respuesta rápida de las células en términos de expresión de ARNm de hTERT transitoria tal como se detecta dentro de 1 h (Figura 1b). hTERT expresión mRNA fue de nuevo a los niveles de control después de 6 h de exposición a MTBITC (figura 1b) y la exposición de células a la CCI por más de 6 horas resultó en una supresión sustancial de hTERT transcripción del mRNA, que también se pudo observar en la baja a largo plazo dosis de exposición (figure1b).
a) las células se expusieron a 25 mM MTBITC o el control de disolvente (DMSO al 0,1%) durante 1 h y posteriormente se analizaron por su daño en el ADN utilizando el ensayo de cometa. Se utilizó el ADN de la cola% para la cuantificación de los daños. Bares son la media ± SD, n = 3. Las células expuestas a 100 mM benzo (a) pireno (B (a) P) por 1 h se utilizaron como control positivo. b) Expresión de ARNm de longitud completa hTERT después de la exposición a MTBITC o control disolvente para 1 h a 96 h se analizó por RT-PCR. PBDG se utilizó en todos los experimentos como gen de referencia. la expresión de ARNm se calculó en relación al control de disolvente; bares son la media ± SD (n = 3).
Tratamiento MTBITC provoca la activación de la vía MAPK
La transducción de señales vía MAPK se activa preferentemente en respuesta a las tensiones ambientales y genotóxicos y ocupa un papel fundamental en la proliferación celular y la supervivencia [26]. El deterioro del crecimiento por el CCI se ha atribuido a la activación de la vía MAPK en diferentes modelos celulares antes [27]. Por lo tanto, el próximo investigó la respuesta de MAPK en células de cáncer de hígado a MTBTIC. Se observó que en todas las líneas de células de tres tratamiento MTBITC resultó en la activación sustancial de ERK1 /2 en Thr202 /Tyr204, JNK en Tyr183 /Tyr185 y P38 en Thr180 /Tyr182 por la fosforilación en un tiempo (figura 2a), pero también de manera dependiente de la concentración ( la figura 2b). Curiosamente, en hepatocitos humanos sanos desprovistos de la telomerasa, esta vía fue también activa (figura 2c). Para entonces determinar si esta activación se refleja en el deterioro celular, se Seguidamente se dirigió a la viabilidad de los hepatocitos humanos primarios normales. Como se muestra en la Figura 2D, incluso después de 72 h de exposición a MTBITC, ningún efecto adverso podría ser detectado, como se determina por observación microscópica de la morfología celular.
Las células se lisaron y el lisado total de sometidos a inmunotransferencia. a) células de HCC fueron tratados con 25 mM MTBITC o el control de disolvente (DMSO al 0,1%) para los puntos de tiempo indicados. células HepG2 (B) o hepatocitos humanos (c) se trataron con MTBITC durante 3 horas a las concentraciones indicadas. se muestran transferencias representativas. Cada mancha se volvió a sondear con anticuerpo anti-β-actina para garantizar la igualdad de la carga de proteínas. d) los hepatocitos humanos normales primarios no se vieron afectados negativamente por MTBITC, como es evidente en las imágenes representativas, capturado por microscopía de luz. SC: control de disolvente = 0,1% de DMSO. +, Control positivo = 0,01% de Triton X-100. Bar = 100 micras. Todos los paneles tienen el mismo aumento.
El papel de MAPK en MTBITC mediada por telomerasa Reglamento
Para determinar la relevancia de la activación de MAPK observada en la modulación de la telomerasa, así como la proliferación celular, células HepG2 tratadas previamente con inhibidor de JNK (SP600125 o inhibidor de JNK V), inhibidor de P38 (SB203580 o SB202190), ERK1 /2 inhibidor (U0126 o PB98059) o una combinación, seguido de tratamiento con MTBITC. La activación de la MAPK a través de MTBITC fue casi completamente abolida por la pre-incubación con los inhibidores, como se representa en la figura 3a. Pre-tratamiento de las células HepG2 con cualquiera de los inhibidores de - a excepción de inhibidor de JNK V - no afectó significativamente la expresión de hTERT mRNA-desencadenó MTBITC observado después de 1 h (Figura 3B). Curiosamente, una combinación de los tres inhibidores de MAPK (SP600125, SB203580, U0126 o SB202190, un inhibidor de JNK V y U0126) redujo disparado por MTBITC elevación expresión hTERT mRNA (figura 3b). Esto puede muy bien ser debido a la inhibición de la activación de JNK, ya sea como pre-tratamiento con SP600125 o JNK inhibidor V solo abolido mejora nivel hTERT mRNA (figura 3b). Por último, se determinó la pertinencia de MAPK para la supresión de la actividad de la enzima telomerasa inducida por MTBITC. A downregulation dependiente de la concentración de la actividad enzimática ya era evidente después de 3 h de exposición a MTBITC, según la evaluación de TRAP-ELISA (figura 3c). Esto podría ser claramente abolida por MAPK bloqueo. Por otra parte, al bloquear selectivamente MAPK, pudimos demostrar que p38, así como ERK1 /2, pero no estábamos JNK, al menos en parte responsable de la inhibición de la enzima telomerasa por MTBITC como se evaluó después de 24 h de exposición (Figura 3d).
Para se han usado la inhibición específica de la activación de p38, SB203580 10 M o 20 M SB202190, de la activación de JNK, SP600125 5 M o 20 mM JNK inhibidor de V, respectivamente. 10 M U0126 o 40 mM PB98059 se utilizaron para la inhibición de ERK1 /2. Las células se pre-trataron con los inhibidores y posteriormente expuestos a MTBITC o el control de disolvente (0,1% DMSO). a) El análisis por inmunotransferencia muestra la inhibición eficaz de las proteínas diana. β-actina se utilizó como control de carga b) se analizaron las células pre-tratadas por longitud completa expresión hTERT mRNA después de 1 h de exposición a 25 mM MTBITC. PBDG se utilizó como gen de referencia. la expresión de ARNm se calculó en relación al control de disolvente correspondiente (n = 3). c + d) Pre-células tratadas se ensayaron para la actividad de la enzima telomerasa después de 3 h (D) o 24 h (e) MTBITC de exposición utilizando el ensayo TRAP-ELISA. Actividad de la telomerasa se calculó en relación con el disolvente de control correspondiente; bares son la media ± SEM (n = 3). Inhibidores de 3 x:. Combinación de SB203580, SP600125 y U0126
El papel de MAPK en mediada por MTBITC atenuación del crecimiento
En un siguiente paso, hemos tratado de determinar si MAPK también podría ser responsable para la detención del ciclo celular MTBITC inducida en células HepG2. Sin embargo, todos los inhibidores como componente único o en combinación no protegieron a las células de G2 mediada por MTBITC /M alto (figura 4a). Esta observación fue confirmada mediante el uso de una combinación de la segunda serie inhibidor (datos no mostrados). Cuando se estudia la apoptosis mediante análisis de contenido de ADN subG1, no relevancia de MAPK para la muerte celular activada por MTBITC podría ser visto (figura 4b). Sin embargo, la cuantificación de la apoptosis en términos de la más específica de la caspasa 3/7 escisión reveló que el bloqueo de los tres MAPK abrogada significativamente MTBITC-desencadenó la muerte celular. Esto podría atribuirse a la señalización de ERK1 /2, como la inhibición de la activación de ERK1 /2 suprimido fuertemente la apoptosis (figura 4b). Para establecer aún más la asociación de la apoptosis y daño en el DNA con la señalización de MAPK, que cuantifica el efecto de los inhibidores de MAPK inducida por el MTBITC roturas de la cadena de ADN. Como ambos, células de HCC, así como los hepatocitos sanos fueron activados en su señalización MAPK por MTBITC, pero sólo las células cancerosas fueron sometidas a la apoptosis, hemos planteado la cuestión de si podría haber una diferencia en la cantidad de daño en el ADN entre lo normal y maligno Células. Como se representa en la figura 4c, roturas de la cadena de ADN eran de hecho mucho más baja en hepatocitos sanos, en comparación con las células HepG2. Cuando las células fueron pre-tratados con una combinación de los tres inhibidores, el daño se redujo a controlar el nivel (figura 4c).
células HepG2 pretratadas fueron expuestas a 25 mM MTBITC o DMSO al 0,1% durante 24 h y después se preparó un contenido de ADN) y b) análisis de contenido de ADN subG1 (marcador de apoptosis) mediante citometría de flujo y tinción PI de ADN Las imágenes representan histogramas de contenido de ADN representativos de las células HepG2. c) Caspasa 3/7 de escisión se utiliza como parámetro específico para la inducción de apoptosis. Caspasa 3/7 actividad se calculó con relación al control de disolvente correspondiente; bares son la media ± SD (n = 3). d) el daño del ADN en las células HepG2 o hepatocitos humanos primarios se evaluó después de 24 h de exposición a MTBITC utilizando el ensayo de cometa. Para comparar entre los dos tipos de células, el daño del ADN se calculó en relación al control de disolvente (SC, 0,1% de DMSO). Bares son la media ± SD, n = 2. Inhibidores de 3 x:. Combinación de SB203580, SP600125 y U0126
ROS no participan en la modulación de la telomerasa mediada por MTBITC o Crecimiento Deterioro
Algunos otros compuestos naturales se han propuesto recientemente para mediar la supresión de la telomerasa en las células cancerosas a través de la producción de ROS [28], [29]. Además, un número de estudios que investigan ITC en el contexto de la supresión del crecimiento de células de cáncer propuso la producción de ROS como un evento de aguas arriba para la activación de MAPK y la muerte celular y /o la detención del crecimiento [15]. En el contexto de nuestro estudio, por lo tanto, tratamos de averiguar si ROS estaban involucrados en la modulación de la telomerasa por MTBITC o podría actuar como efectores de muerte celular. ROS intracelular en las células tratadas con Control- y MTBITC se evaluó por primera vez por citometría de flujo después de la tinción de crecimiento adherente células HepG2 con H
2DCFDA. Dentro de una hora de MTBITC-exposición, se pudo detectar ningún cambio en el nivel de ROS (datos no mostrados).