Extracto
Población lateral (SP) y la expresión de transportadores ABC enriquecer las células madre en numerosos tejidos. Exploramos si este fenotipo caracteriza células madre del cáncer de vejiga humano (CSC) y trató de identificar los mecanismos de regulación. Centrándose en no músculo cáncer de vejiga invasivo (CVNMI), se utilizan varias líneas celulares humanas para caracterizar SP y la expresión de transportadores ABC.
in vitro
y
in vivo
se llevaron a cabo evaluaciones fenotípicas y funcionales de la conducta CSC. Expresión de putativo ABCG2 marcador CSC se evaluó en muestras clínicas CVNMI (n = 148), y un papel para la señalización de MAPK, un mecanismo central de la génesis tumoral de vejiga, se investigó. Los resultados mostraron que el transportador ABCG2 se expresa predominantemente y fue hasta reguladas en la fracción SP por 3 veces (ABCG2
hi) en relación con la fracción no-SP (NSP) (ABCG2
bajo). ABCG2
hi células SP muestran enriquecimiento de marcadores de células madre (Nanog, Notch1 y SOX2) y un aumento de tres veces en la eficiencia de formación de colonias (CFE) en comparación con ABCG2
células de baja NSP.
In vivo
, ABCG2
hi células SP enriquecidos para el crecimiento del tumor en comparación con ABCG2
células de baja NSP, en consonancia con los CAC. Perk era constitutivamente activa en ABCG2
hi células SP y la inhibición de MEK también inhibieron la ABCG2
hi fenotipo SP y contención significativa de la CFE. Además, en el examen de muestras clínicas, CVNMI expresión ABCG2 correlacionados con el aumento de la recurrencia y la disminución de la supervivencia libre de progresión. Además, la expresión Perk también correlacionada con una disminución de la supervivencia libre de progresión, mientras que una correlación positiva se demostró de nuevo entre ABCG2 y expresión Perk. En conclusión, confirmamos ABCG2
hi SP enriquece de células madre cancerosas en CVNMI humana y vía MAPK /ERK es una diana terapéutica adecuada
Visto:. Hepburn AC, Veeratterapillay R, Williamson SC, El-Sherif A, Sahay N, Thomas HD, et al. (2012) Población lado humano de no músculo invasivo del cáncer de vejiga es riqueza para el cáncer de células madre que son mantenidos por MAPK señalización. PLoS ONE 7 (11): e50690. doi: 10.1371 /journal.pone.0050690
Editor: G. Dean Tang, la Universidad de Texas M.D Anderson Cancer Center, Estados Unidos de América
Recibido: 27 Julio, 2012; Aceptado: 23 de octubre de 2012; Publicado: noviembre 30, 2012
Derechos de Autor © 2012 Hepburn et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por la Fundación JGW Patterson y NHS Síndicos. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
carcinoma de células transicionales (TCC) de la vejiga urinaria tiene una incidencia anual mundial de más de 350.000 nuevos casos y 145.000 muertes [1]. En los EE.UU., es el quinto cáncer más común que representa más de 70.000 casos nuevos al año y un gasto anual estimado de $ 3.5 millones de dólares en el tratamiento del cáncer [2], [3]. Aunque el 85% de los pacientes presentan no músculo cáncer de vejiga invasivo menos agresivo (CVNMI), que tienen un alto riesgo de recurrencia y aquellos con características desfavorables, tales como la enfermedad multifocal, tumores de alto grado, con o sin el carcinoma concomitante in situ (CIS) , corren especial riesgo de progresión de la enfermedad. Intravesical bacilo de Calmette-Guérin (BCG) puede reducir el riesgo de progresión del 27% en pacientes con alto riesgo CVNMI [4] pero los que no responden normalmente se someten a cirugía mórbida para eliminar la vejiga. Para los pacientes que se presentan con, o de progreso a, músculo cáncer invasivo de vejiga (MIBC), la probabilidad de sobrevivir más de 5 años después del tratamiento es de aproximadamente 50-60% [5], [6]. Este fondo indica que se necesitan con urgencia nuevos enfoques terapéuticos contra CVNMI para erradicar la enfermedad antes de que se desarrolla un fenotipo invasivo [7].
Los recientes avances en la biología del cáncer han incluido la caracterización de las células madre del cáncer (CSC), una pequeña subpoblación de las células tumorales que están iniciando tumor e impulsan la producción del resto del cáncer. CSC se han descrito en un número creciente de sitios de tumor hematopoyético incluyendo, mama, colon, melanoma y de próstata [8] - [12]. Se está convirtiendo en claro que es esencial para dirigir estas células ya que determinan la respuesta al tratamiento [13]. El (SP) fenotipo por citometría de flujo la categorización y la selección de una población lado [14] enriquece para células madre cancerosas en numerosos tumores [15] - [18]. reciente demostración de SP en el cáncer de vejiga requiere una mayor investigación de su posible papel en células madre cancerosas que caracterizan [19]
.
La patogénesis del cáncer de vejiga aparece estrechamente ligado a las vías moleculares distintas [20], [21]. Más del 70% de NMIBCs albergan mutaciones activadoras de FGFR3 (FGFR3) que conduce a la activación constitutiva de señalización MAPK [22], [23]. Por otra parte, la sobre regulación de EGFR /receptores de la familia ErbB se asocia con el aumento de grado y las etapas del cáncer de vejiga [24], [25]. De relevancia, SP fenotipo está mediada por el casete de unión a ATP (ABC) la familia de las proteínas de transporte [14], y el cáncer de mama resistente a la proteína-1 (BCRP1) /transportador ABCG2 ha demostrado ser el principal mediador de este fenotipo [26]. En particular, ABCG2 a su vez está regulada por MAPK [27] y un papel para la vía de señalización MAPK /ERK en la regulación de SP se ha sugerido (Tsichuda et al 2008).
Como primer paso para la información al el diseño de nuevas terapias para NIMBC, que tuvo como objetivo caracterizar las células madre cancerosas en el cáncer de vejiga humana mediante la selección de SP y explorar la regulación a través de la MAPK /ERK eje de señalización.
células RT112, RT4, J82 y 253JB-V se tiñeron con Hoechst 33342 tinte solo o en presencia de reserpina y se analizaron por citometría de flujo de medición de Hoechst azul vs fluorescencia roja Hoechst. El SP fue cerrada y representa como un porcentaje de la población total de células viables tras la exclusión PI (media ± DE).
expresión de mRNA relativa de ABCA2, ABCG2, MRP1 y P-glicoproteína se determinó en SP y las fracciones de NSP de RT112 (A) y las células RT4 (B) usando PCR en tiempo real. Los datos mostrados son la media de tres experimentos independientes realizados por triplicado cada una (media ± DE). * P & lt; 0,05 (de Student de dos colas
t-test
). Se realizaron estudios de inhibición en RT112 (C) y RT4 células (D) usando-ABCG2 específico inhibidor Fumitremorgina C (FTC) y P-glicoproteína verapamilo inhibidor.
Materiales y Métodos
los reactivos y el cultivo celular
celular de cáncer de vejiga humana RT4, RT112 y J82 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC) y se cultivaron en medio RPMI 1640 (Sigma) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1 % L-glutamina - denominado material completo (FM). El altamente metastásico línea celular humana TCC 253JB-V fue generosamente proporcionado por el profesor Colin Dinney [28] y se cultivan en medios MEMalpha suplementado con FBS al 5%. Todas las células se cultivaron a 37 ° C en presencia de 5% de CO
2. MEK1 /2 inhibidor específico, U0126 (Cell Signalling Technology), y REGF (Sigma) se utilizaron en los estudios de modular la señalización de MAPK. Las células de control para comparación incluyen cultivos en medio basal (BM) que carecen de FBS y FM.
Hoechst tinte eflujo de ensayo
Las células se tiñeron con Hoechst 33342 tinte usando modificación de un protocolo descrito previamente [14] . Brevemente, se añadió colorante Hoechst 33342 (2,5 mg /ml) solo o en presencia de reserpina (50 mM), verapamil (50 M) o Fumitremorgina C (10 mM) y se incubaron las células a 37 ° C durante 90 min y se agita cada 30 min. marcador de superficie celular analiza siguiente Hoechst 33342 tinción de colorante se realizaron con anti-ABCG2-FITC (clon 5D3, Millipore) co-etiquetado en hielo durante 20 min. IgG normal de ratón-FITC se utilizó como control isotipo (Upstate). El yoduro de propidio (PI) (2 mg /ml) cerrada células viables. El análisis y la clasificación se llevaron a cabo en un citómetro de flujo FACSDiVa (Becton Dickinson).
La extracción de RNA y análisis en tiempo real PCR
ARN total fue extraído utilizando el kit High Pure RNA (Roche) y invertidas transcritas utilizando cebadores aleatorios (Promega) y superíndice III enzima de transcriptasa inversa (Invitrogen). PCR en tiempo real se llevó a cabo con SYBR Green mezcla maestra que contiene Rox ™ y UDG (Invitrogen) usando el sistema ABI Prism 7900HT de detección de secuencias (Applied Biosystems). Para las secuencias de cebadores ver Tabla S1. Los niveles de expresión génica se normalizaron a GAPDH.
(A) FACS Las células clasificadas se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 1 × 10
2 células /pocillo y se contaron las colonias después de 2 semanas . la eficiencia de formación de colonias (CFE) se calculó como se describe en Materiales y Métodos. Los datos mostrados son la media (± DE) de tres experimentos independientes cada uno realizado por triplicado. * P & lt; 0,05 (de Student de dos colas
t-test
). (B) Los perfiles del ciclo celular de RT112 ABCG2
hi SP y ABCG2
células NSP bajas indican un aumento en la fase S en el ABCG2
hi fracción SP. (C) la selección de serie, sub-cultura y fraccionamiento de citometría entre SP y RT112 células NSP. SP células y proteínas no estructurales ordenadas de RT112 se cultivaron durante dos semanas, restained con Hoechst 33342 y reanalizados por citometría de flujo. Este proceso se repitió 4 veces.
(A) 1 × 10
3 ABCG2
hi SP y ABCG2
bajo NSP ordenadas células RT112 se inyectaron por vía subcutánea en ratones desnudos y monitoreados para el crecimiento tumoral. (B) tinción inmunohistoquímica de secciones en serie, de los tumores derivados de ratones inyectados con 1 x 10
3 ABCG2
hi SP y sedimentos de células residuales de los ratones inyectados con 1 x 10
3 ABCG2
bajo NSP células RT112 ordenados, con H & amp; e y ABCG2 y a mayor aumento (20x). Marcado aumento de inmunoreactividad para ABCG2 se ve en la ABCG2
PSSS deriva tumores. (C) mRNA expresión relativa de ABCG2 en los tumores formados después de la inyección de 1 x 10
3 ABCG2
hi SP y ABCG2
bajo NSP ordenadas células RT112 se determinó mediante PCR en tiempo real. (D-F) mRNA expresión relativa de Nanog, Notch1 y Sox2 en los tumores formados después de la inyección de 1 x 10
3 ABCG2
hi SP y ABCG2
bajo NSP ordenadas células RT112 se determinó mediante PCR en tiempo real. (G) La tinción inmunohistoquímica de secciones en serie, de los tumores formados después de la inyección de 1 x 10
3 ABCG2
hi SP y ABCG2
bajo NSP ordenadas células RT112, con Nanog, Sox2 y Notch1.
Formadoras de colonias Ensayo
FACS ordenados células fueron sembradas en placas de seis pocillos a una densidad de 100 células /pocillo. Después de 14 días las colonias se fijaron con fijador de Carnoy y se tiñeron con 0,4% de cristal violeta (w /v) para el recuento de colonias usando ColCounter (Oxford Optronix), omitiendo & lt; 64 colonias de células, ya que representan colonias principios abortivos. la eficiencia de formación de colonias (CFE,%) se calculó como [(no. contaron las colonias /no. células sembradas) × 100].
Ciclo Celular
FACS ordenados células fueron teñidas con DAPI para celular El análisis del ciclo utilizando el kit de ADN 2step CyStain (Partec). El yoduro de propidio (2 mg /ml) cerrada células viables. Para discriminar contra los desechos nucleares y dobletes, las células fueron cerrada en el FSC y SSC. La citometría de flujo de software del ciclo celular (CellQuest Pro, BD Biosciences) se utilizó para calcular el contenido de ADN y calcular estadísticas subG1, G1, S-fase y fase G2M.
En vivo
tumourigenicity
Los experimentos con animales se realizaron y se llevaron a cabo de conformidad con las directrices reguladoras. Veinte tres ratones hembra atímicos desnudos CD1 (Charles River, UK) fueron inyectados con RT112 SP y NSP ordenadas las células en el tejido subcutáneo flanco derecho. El crecimiento tumoral se controló mediante dos mediciones dimensionales con calibradores electrónicos con el volumen del tumor calculados utilizando la fórmula
a
2 ×
b /2
, donde
a
es el la medición más pequeña y
b
la más grande. Los experimentos se terminaron ratones cuando los tumores crecieron hasta un máximo de 750 mm
3. Los tumores se retiraron y se redujeron a la mitad para los estudios de inmunohistoquímica y estudios de PCR en tiempo real.
Immunohistochemitry
se accedió a la parafina fijadas en formalina y embebidos material de archivo de los pacientes sometidos a resección endoscópica de tumor de vejiga o cistectomía radical para estudios inmunohistoquímicos con el consentimiento informado correspondiente y la aprobación regulatoria ético. En total, 148 casos CVNMI fueron teñidas con anti-ABCG2 (1:250; BXP-21, Millipore clon) y anti-p-ERK (1:100, E-4, Santa Cruz Biotechnology) antes de la incubación con el anticuerpo secundario anti biotina de cabra -mouse anticuerpo IgG (DAKO). La inmunorreactividad se visualizó usando Vectastain Avidina Biotina Complex Kit (Vector Laboratories) y 3'3'-diaminobenzidetetrahydrochloride. La puntuación se evaluó inicialmente por porcentaje y la intensidad de manchas. Sin embargo, la gran mayoría de los núcleos expresó tinción epitelial uniforme con una sola intensidad, con tinción heterogénea presente sólo en algunos casos. En estos núcleos, la intensidad con & gt; 50% área de la tinción se tomó como la puntuación. La inmunotinción fue revisado y anotó de forma independiente por tres asesores que fueron cegados a los datos clínicos para dar puntuaciones medias de intensidad de la tinción de ausente (0), débil (1), moderada (2) o fuerte (3). Xenoinjertos también fueron teñidas con anti-Nanog (1:5000, Señalización Celular), anti-Notch 1 (1:500, C-20, Santa Cruz Biotechnology) y anti-Sox2 (1:500, Millipore).
Western Blotting
Las células se lisaron en tampón de SDS de muestra (0,125 M Tris pH 6,8, 2% SDS, 10% de glicerol, 10% β-mercaptoetanol y 0,01% de azul de bromofenol) y se analizaron por SDS-PAGE en 12% geles de poliacrilamida, seguido por transferencia a nitrocelulosa membrana Hybond ™ (Fisher Scientific). Los anticuerpos se utilizaron a las siguientes diluciones: anti-ERK 1:500 (K-23, Santa Cruz Biotechnology) y anti-fosfo-ERK 1:500 (E-4, Santa Cruz Biotechnology). Rábano picante anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa (Dako) se utilizaron a 1:500 y detectado usando el kit de detección de quimioluminiscencia (Fisher Scientific).
Análisis estadístico
Para los estudios de PCR en tiempo real, los dos -tailed emparejado
t-test
se utilizó para determinar la significación estadística a un nivel de P & lt; 0,05. Por inmunohistoquímica, las diferencias en la frecuencia y la expresión de ABCG2 se examinaron utilizando Mann-Whitney
T
pruebas para evaluar las correlaciones con el cáncer de grado patológico y el escenario. supervivencia de los pacientes se analizó mediante el método de Kaplan-Meier con la prueba de log-rank, y el análisis multivariante se realizó mediante el modelo de riesgos proporcionales de Cox. correlación de Pearson se utilizó para correlacionar ABCG2 y expresión Perk. Todas las pruebas se llevaron a cabo utilizando el programa SPSS versión 11.0 software (SPSS, Inc.). Todas las pruebas fueron de dos caras y un
P
valor de. & Lt; 0,05 fue tomada para indicar la significación estadística
(A) Western blot se realizó con fosfato ERK1 /2 y ERK1 /2 anticuerpos. Se colocaron (B) células RT112 en FM solo o en presencia de U0126 (10 mM) durante 30 min antes de la tinción con Hoechst 33342. El efecto de U0126 en la "cola" y "superior" compartimientos extremos de ABCG2
se investigó PSSS
+. (C) de la CFE ABCG2
hi células SP con concentraciones crecientes de UO126 y diferentes colonias de tamaño (≥1 mm, ≥2 mm y ≥ 3 mm de diámetro).
(A) ABCG2 expresión en epitelio urinario normales, de bajo grado (LG) y alto grado (HG) CVNMI es típicamente no específica y se puede ver nuclear y citoplasmática. (B) Correlación de ABCG2 inmunotinción intensidad con grado y estadio en CVNMI. curvas (C) de Kaplan-Meier que ilustra los resultados de intensidad ABCG2 (0, 1, 2 y 3) con la recurrencia y la supervivencia libre de progresión (p & lt; 0,001, análisis de rangos logarítmicos). curvas (D) de Kaplan-Meier que ilustra los resultados de intensidad Perk (0, 1, 2 y 3) con la supervivencia libre de progresión (p & lt; 0,001, análisis de rangos logarítmicos). (E) Correlación de ABCG2 y expresión Perk (p = 0,005, r de Pearson = 0,99).
Resultados
Las células SP y la expresión del transportador ABC puede ser identificado en las células del cáncer de vejiga humana
Se investigó la presencia de SP en dos líneas celulares (CVNMI RT112 y RT4) y dos líneas celulares MIBC (J82 y 253JB-V). Después de la tinción con Hoechst 33342, un SP fue identificado en las cuatro líneas celulares como una cola distinta que se extiende desde la principal población con el perfil fluorescente bajo característico en el análisis de doble longitud de onda (Figura 1). La estrategia gating emprendido fue seguido como se describe por Golebiewska et. Alabama. [29] (Figura S1). la discriminación adecuada de células viables individuales y es crucial para la caracterización adecuada SP. La proporción media (± SE) de cada población celular total representó por el SP fue 12,8% (± 1,2%) en RT112, 15,3% (± 1,1%) en RT4, 2,7% (± 0,9%) en J82, y 1.0 % (± 0,5%) en 253JB-V. La reserpina inhibidor del transportador de pan-ABC verificó fenotipo SP mediante el bloqueo de Hoechst flujo de salida y la inhibición de baja fenotipo tinción con rojo /azul que caracteriza a las células SP.
Se evaluó la expresión del transportador ABC patrones de líneas celulares de cáncer de vejiga mediante PCR en tiempo real. expresiones heterogéneas de múltiples genes resistentes a múltiples fármacos se demostraron en la MIBC líneas de células J82 y 253JB-V. Sin embargo, en las líneas celulares CVNMI se observaron RT4 y RT112 más altas expresiones de ABCG2 (Figura S2).
ABCG2 es considerablemente enriquecido dentro de las células CVNMI SP y mantiene este fenotipo
Nos centramos en el próximo CVNMI enfermedad y se examinó la expresión de mRNA relativa de cuatro transportadores ABC (ABCA2, ABCG2, MRP1 y P-glicoproteína) en fracciones RT112 y RT4 SP y NSP utilizando PCR en tiempo real (Figura 2A y 2B) .Los resultados demostraron que, además de ABCG2 siendo el principal transportador ABC en CVNMI, su expresión fue mayor en células SP en comparación con las células de NSP. El papel clave de ABCG2 en la generación del fenotipo SP fue confirmada por la pérdida completa de la población SP después del tratamiento con el Fumitremorgina inhibidor-ABCG2 específico C (FTC) en comparación con la falta de efecto del tratamiento con el verapamil inhibidor de P-glicoproteína (Figura 2C y 2D). En contraste, la P-glicoproteína fue el transportador ABC diferencialmente expresados y funcionalmente relevante en la línea celular J82 MIBC (Figura S3). Por otra parte, se confirmó que en las células CVNMI la fracción SP se asoció con sólo niveles más altos de ABCG2 (ABCG2
hi) expresión (Figura S4).
Las células SP Enriquece para la función de células madre
in vitro
a continuación comparó el potencial clonogénico de RT112 ABCG2
hi SP y ABCG2
células de baja NSP. ABCG2
hi células SP muestra un aumento de tres veces en la media (± DE) de colonias de enriquecimiento de la formación al 56,7% (± 1,6%) del 18,2% (± 0,2%) en ABCG2
células de baja NSP (Figura 3A) . aumento similar en ABCG2
hi clonogenicidad SP en comparación con ABCG2
células de baja NSP se demostró en la línea celular CVNMI adicional RT4 (Figura S5). Después de la compuerta de células no viables utilizando yoduro de propidio, el análisis del ciclo celular reveló que una mayor proporción de ABCG2
hi células SP estaban en fase S en comparación con ABCG2
células de baja NSP, con media (± SE) valores de 19% (± 5%) frente a 5,5% (± 1) para la fase S y el 68% (± 8%) frente a 94% (± 1%) para G1-fase, respectivamente (Figura 3B).
para tener en cuenta la capacidad de ABCG2
hi células SP para repoblar el espectro fenotípico original de la línea celular RT112 padres, hemos realizado las culturas y las selecciones de SP de serie y las fracciones de NSP antes de volver a la tinción con Hoechst 33342 y volver a analizar por el flujo citometría (Figura 3C). Los resultados mostraron que después de la primera ronda de selección, la cultura y la citometría de flujo, cultivos derivados de ambas células SP y NSP cada uno dio lugar nuevamente a una distribución similar de células SP y NSP. Si este proceso se continuó con los ciclos repetidos de selección, la cultura separada y clasificación de citometría de flujo, la proporción de células de SP subcultivos que se encontraban en la fracción SP aumentó con cada ronda, mientras que hubo una disminución marcada en la fracción SP de células derivadas de NSP sub-culturas.
Se evaluó la expresión de marcadores de células madre en RT112 ABCG2
hi SP y ABCG2
bajos células NSP por PCR en tiempo real (Figura S6A). ABCG2
hi células SP mostraron una mayor expresión de Nanog, Sox2 y Notch1 en comparación con ABCG2
células de baja NSP. Además, la expresión de marcadores de células basales de la vejiga, incluyendo CK14, CD44, CD49f (α6 integrina) y CD104 (β4 integrina) también asociados con el enriquecimiento de células madre cancerosas, se investigó (Figura S6B). Todos los marcadores de células basales se expresaron en ABCG2
hi SP células pero niveles similares de expresión también fueron vistos en ABCG2
células de baja NSP.
Las células SP Enriquece para el Gran Iniciador tumor Capacidad
in vivo
para investigar la capacidad comparativa de ABCG2
hi SP y ABCG2
células de baja NSP para formar tumores viables
in vivo, España células clasificadas de cada sub-población estaban inyectada por separado por vía subcutánea en ratones desnudos CD1 y los sitios de implante monitorizados para el crecimiento. rápido crecimiento del tumor se observó en 5 de 5, 5 de 5, y 3 de 3 animales después de la implantación de 10
3, 10
4, y 10
5 ABCG2
hi células SP, respectivamente. Sin embargo, el crecimiento del tumor ABCG2
lowNSP estaba agotado por la dilución de los números de siembra a 10
3 células, mientras que 5 de 5 ratones injertados con 10
3 ABCCG2
hi células SP crecieron los tumores (Tabla 1). Examinando el volumen medio del tumor con el tiempo reveló un crecimiento exponencial en el ABCG2
hi SP grupo inóculo celular en contraste con aquellos que recibieron ABCG2
bajo NSP células (Figura 4A).
El análisis inmunohistoquímico de la expresión ABCG2 en los tumores , formada después de la inyección de 1 x 10
3 ABCG2
hi SP células en comparación con los gránulos de las células residuales (que no estaban asociadas con el crecimiento activo) recogidos de ratones inyectados con ABCG2
bajo NSP ordenadas RT112 células, mostraron una mayor expresión en ABCG2
PSSS en comparación con ABCG2
lowNSP tumores derivados (Figura 4B).
posteriormente demostrado una mayor expresión de ABCG2 (Figura 4C) y reconocidas marcadores embrionarias pluripotentes de células madre /Nanog, Notch1 y SOX2 (Figura 4D-F), que se han asociado con la tumorigénesis [30], utilizando PCR en tiempo real en los tumores formados después de la inyección de ABCG2
hi células SP en comparación con los sedimentos celulares residuales recogidas de ratones inyectados con ABCG2
células de baja NSP. Estos
in vivo
resultados fueron consistentes con los obtenidos con el padre
in vitro
células cultivadas (Figura S6A) con alta expresión de marcadores de células madre mantenido en tumores procedentes de ABCG2
hi SP Las células que contrastan con baja expresión en ABCG2 residual
bajo NSP. Es de destacar que la selección de las células iniciadoras de tumores por esta
in vivo
ensayo dio como resultado el enriquecimiento de estos marcadores de células madre, sobre los niveles de referencia
in vitro
, donde las diferencias eran de 11 veces, 80- doblar, 44 veces y 140 veces para ABCG2, Nanog, Notch1 y la expresión de Sox2, respectivamente (p & lt; 0,05). Por otra parte, el aumento de Nanog, Sox2 Notch 1 y la expresión de los ABCG2
hi SP xenoinjertos de ratón también se observó mediante análisis inmunohistoquímico (Figura 4G).
La inhibición de ERK señalización Atenúa el cáncer SP función de las células Stem
Hemos investigado el papel potencial de las MAPK en la regulación del fenotipo en las células SP CVNMI RT112. La expresión de ERK, JNK y p38, así como la vía PI3K /Akt y STAT vías de señalización se determinó por PCR en tiempo real (Figura S7A). EGFR, ERK1 y expresión ERK2 por tanto ABCG2
hi SP y ABCG2
células de baja NSP se documentó en niveles mucho más altos que los otros componentes de señalización, lo que sugiere que estas enzimas eran propensos a jugar un papel importante en la señalización MAPK en células RT112. activación enzimática fue explorado posteriormente y pERK se confirmó que se expresa constitutivamente en un nivel superior en ABCG2
hi células SP (Figura 5A). Además, la expresión elevada Perk también se observó en los ABCG2
hi xenoinjertos SP (Figura S7B). A fin de probar la relevancia de la vía /ERK MAPK como un objetivo potencial en RT112 ABCG2
hi SP, los efectos funcionales de U0126, un inhibidor específico para MEK1 y MEK2, fueron evaluados. Las células pre-tratadas con U0126 para 30, 60 ó 120 minutos no tenían expresión ERK fosforilada detectable, confirmando de este modo la inhibición de la activación de ERK, incluso en presencia de estimulación de EGF (Figura S7C). Además, no hubo ningún cambio significativo en las células PI positivas con el tratamiento de U0126 (p = 0,38) después de la tinción con Hoechst 33342 (Figura S7D). Hemos dividido la fracción ABCG2
PSSS en las células situadas en la parte superior de la cola y las células situadas en el extremo de la cola (Figura 5B), como se ha informado de que las células en la punta de la cola SP, que tienen la más alto Hoechst 33342 la capacidad del flujo (Hoechst
bajo), altamente enriquecido la población de células madre [31]. El tratamiento con el inhibidor de MEK tenía un marcado efecto inhibitorio sobre las células situadas en el extremo de la cola de la ABCG2
PSSS, la reducción de la ABCG2
PSSS en 2,5 veces (5,8% a 2,3%). Por el contrario, el inhibidor sólo redujo la ABCG2
PSSS en el extremo no cola por 1,5 veces (2,8% a 1,9%). Estos datos muestran que U0126 también está ejerciendo su efecto en ABCG2
hi Hoechst
células bajas. El tratamiento con U0126 también causó una inhibición dependiente de la dosis de CFE en RT112 ABCG2
hi SP y ABCG2
células de baja NSP (Figura S7E). Como hemos demostrado que ABCG2
células hi SP pueden dar lugar a dos células de NSP (Figura S7F) y ABCG2
células de baja NSP tienen niveles muy bajos de Perk, la supresión de ABCG2
bajo de células NSP SP y CFE parece ser indirecta a través de los efectos de la ABCG2 U0126 en
hi células SP. De nota, la inhibición preferencial de las colonias más grandes, más indicativo de crecimiento CSC, fue visto como la presencia de colonias ≥3mm fue inhibida por completo en 10
-6 M (Figura 5C). Estos datos muestran que la ABCG2
hi fracción SP es, al menos en parte, mantenida por la vía MAPK /ERK, que a su vez hemos demostrado mantener los ABCG2
células de baja NSP.
Expresión de ABCG2 en clínica del cáncer de vejiga se correlaciona con el grado, estadio, recurrencia y la supervivencia libre de progresión y expresión perk
Para determinar la importancia clínica de nuestro
in vitro
y
in vivo
hallazgos de líneas celulares, se determinó la expresión de ABCG2 en las secciones de cáncer de vejiga humana. Las secciones de tejido de un panel de 148 CVNMI (Tabla S2- ilustra características clínicas) se procesaron para inmunoreactividad para ABCG2 (Figura 6A). positividad ABCG2 se detectó en 143 (97%) casos, y para la comparación se incluye una sección de urotelio normal, lo que demuestra una mayor intensidad de la expresión ABCG2 basal, que está de acuerdo con la evidencia emergente para una célula madre basal [32]. Se muestran la intensidad media de la inmunotinción anota para ABCG2 estar asociados con las primeras etapas invasiva, pta (n = 87) versus pT1 (n = 61), y aumentando el grado del tumor, grado bajo (n = 93) versus alto grado (n = 55) (p & lt; 0,05) (Figura 6B). El seguimiento medio fue de 59 meses (rango intercuartil = 48.3-96.3 meses), y 31 casos (21%) presentaron recurrencia de la enfermedad y 23 casos (16%) presentaron progresión de la enfermedad. Las correlaciones con el tiempo hasta la recurrencia y la supervivencia libre de progresión (PFS) revelaron peores resultados asociados con el aumento de la expresión ABCG2 como se ilustra con las curvas de Kaplan-Meier y Log-Rank análisis (p & lt; 0,001) (Figura 6C). Estas correlaciones se mantuvo estadísticamente significativa cuando se estratificó por grado, estadio y la presencia de CIS (p & lt; 0,001). Utilizando el análisis multivariante de Cox, que incluyó las variables de grado, estadio y la intensidad de la inmunotinción ABCG2, reveló que ABCG2 expresión siguió siendo un predictor independiente de progresión de la enfermedad (p & lt; 0,001; RR = 5,1; IC del 95% = 2.6 a 9.9). Además, el aumento de la expresión Perk también se asoció con peores resultados (log-rank p = 0,001) (Figura 6D). Por otra parte, existe una correlación positiva entre lo demuestra ABCG2 y expresión Perk (p = 0,005, r de Pearson = 0,99) (Figura 6E).
Discusión
Los recientes avances en el aislamiento y caracterización de células madre cancerosas putativas han proporcionado aspectos interesantes de la base de la carcinogénesis y llevado a una creciente optimismo para el desarrollo de la terapia del cáncer de manera más eficaz dirigida. Los estudios han presentado datos convincentes que demuestran que un número de cánceres humanos siguen el modelo CSC, en el que una pequeña subpoblación de células dentro de un tumor es capaz de la iniciación del tumor y responsable para el crecimiento tumoral y la recurrencia [8], [9]. La existencia de células con potencial de aumento de tumor iniciar Recientemente se ha descrito en el cáncer de vejiga humana [33] - [35] y SP se ha demostrado en las muestras de pacientes con cáncer de vejiga [19]. En este estudio, hemos caracterizado células madre cancerosas de la vejiga utilizando SP y exploramos su modulación por la vía de señalización MAPK /ERK.
En busca de una jerarquía de CSC en el cáncer de vejiga humana, nuestros
in vitro
estudios mostraron ABCG2
hi células SP muestran un aumento de tres veces en la eficiencia de formación de colonias. Estos datos fueron apoyados además por nuestros
in vivo
estudios mediante el cual ABCG2
hi células SP fueron tumoral en comparación con el inicio ABCG2
células de baja NSP que presentaban pérdida de crecimiento del tumor en el 1 × 10
dilución de 3 celdas. Estas observaciones ponen de manifiesto el enriquecimiento de células madre cancerosas dentro de los ABCG2
selecciones hi SP. trasplantes de serie posteriores apoyarían aún más una relación jerárquica CSC en estos tumores. Sin embargo, hemos adoptado un enfoque análogo al realizar selecciones de serie y
in vitro
culturas de ABCG2
hi SP y ABCG2
cultivos de baja NSP demostraron la capacidad de ABCG2
hi células SP para repoblar el espectro fenotípico original de la línea celular RT112 padres. selecciones de serie de ABCG2
células de baja NSP mostraron un debilitamiento en el potencial para regenerar ambas poblaciones que indican la dilución de la capacidad de seleccionar o generar células madre cancerosas.
ABCG2 ha demostrado ser el factor determinante molecular principal del fenotipo SP [26]. De hecho, hemos encontrado el SP de CVNMI RT112 y células RT4 tenían una mayor expresión del ARNm ABCG2, fue completamente abrogada por el inhibidor específico ABCG2-FTC y contenía el 5% superior de ABCG2
hi células que expresan. La correlación con los resultados clínicos ha mostrado CVNMI ABCG2
hi inmunotinción de estar asociado con peores resultados clínicos de recurrencia y progresión del cáncer, lo que indica un papel para los CAC en el desarrollo del cáncer de vejiga. Curiosamente, el SP de la línea celular J82 MIBC tenía una mayor expresión de la glicoproteína P y fue inhibida por verapamilo, un inhibidor de la P-glicoproteína específica. Se han encontrado niveles de ARNm de P-glicoproteína a ser elevados en los tumores de vejiga de alto grado [36]. Además, la patología molecular de CVNMI es distinta de MIBC [20].