Extracto
Antecedentes
laminas de tipo A son proteínas de los filamentos intermedios de tipo V codificadas por el gen
LMNA
. Las mutaciones en
LMNA
dar lugar a diversas enfermedades degenerativas relacionadas con el envejecimiento prematuro. Un tipo laminas también influyen en la actividad de la proteína retinoblastoma (pRb) y oncogenes una β-catenina tales. En consecuencia, se ha especulado que la expresión de las laminas de tipo A también puede influir en la progresión tumoral.
Metodología /Principales conclusiones
Un archivo de cáncer colorrectal (CCR) y el tejido normal del colon se proyectó para expresión de las laminas A-tipo. Se utilizó el método proporcional de Cox razón de riesgo (HR) para investigar la supervivencia del paciente. El uso de líneas celulares de CRC se investigaron los efectos de la lamina A la expresión de otros genes por RT-PCR; sobre el crecimiento celular por análisis de FACS; y en la invasividad mediante ensayos de migración celular y siRNA desmontables de determinados genes. Se encontró que la lamina A se expresa en las células madre del colon y que los pacientes con tumores de tipo A Lamin-expresando tienen significativamente peor pronóstico que los pacientes con tumores negativos de tipo A lamina (HR = 1,85,
p = 0,005
) . Para comprender este hallazgo, hemos establecido un sistema modelo basado en la expresión de GFP-lamina A en las células de CRC. Hemos encontrado que la expresión de GFP-lamina A en estas células no afectó a la proliferación celular, pero ha favorecido en gran medida el aumento de la motilidad celular y la invasión. La razón de este aumento de la capacidad de invasión era que la expresión de la lamina A promovió la regulación de la actina agrupación proteína T-Plastin, que conduce a la regulación negativa de la molécula de adhesión celular E-cadherina.
Conclusiones
Expresión de las laminas a de tipo aumenta el riesgo de muerte por CRC debido a que su presencia da lugar a un aumento de la invasividad y potencialmente un vástago fenotipo más similar a células. En este informe se vincula directamente la expresión de tipo A lamina hasta la progresión del tumor y eleva el perfil de
LMNA
de un implicado en múltiples pero raras enfermedades genéticas a un gen implicado en una de las enfermedades más comunes en el mundo occidental.
Visto: ND Willis, Cox TR, Rahman-Casans SF, Smits K, Przyborski SA, van den Brandt P, et al. (2008) Lamin A /C es un biomarcador de riesgo en el cáncer colorrectal. PLoS ONE 3 (8): e2988. doi: 10.1371 /journal.pone.0002988
Editor: Kevin G. Hardwick, Universidad de Edimburgo, Reino Unido
Recibido: 6 mayo de 2008; Aceptado: 17 Julio 2008; Publicado: 20 Agosto 2008
Derechos de Autor © 2008 Willis et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Nacional de Salud servicio de Investigación y los Fondos de Desarrollo, Asociación Internacional para la Investigación del cáncer, Marco de la Unión Europea Programa 6
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Las laminas a y C son proteínas intermedios V de tipo de filamentos que forman parte de una red filamentosa denominado la lámina nuclear que recubre la membrana nuclear interna (INM) [1]. Un tipo laminas son empalmados alternativamente productos de la
LMNA
gen, que ha sido localizado en el cromosoma 1q21.3 [2]. Las mutaciones en este gen son la causa subyacente de doce enfermedades genéticas diferentes que se denominan colectivamente laminopathies [3]. Laminopathies son todas las enfermedades degenerativas que afectan principalmente a los tejidos de origen mesenquimal [3]. Los posibles mecanismos subyacentes laminopathies se han investigado intensamente durante los últimos siete años y esto ha llevado a la conclusión de que las laminas de tipo A contribuyen a la supervivencia celular de dos maneras distintas. En primer lugar, las laminas de tipo A interactúan con proteínas del citoesqueleto enlazador importantes nesprins denominados, a través de proteínas de dominio sol, que conecta el INM a la membrana nuclear externa (ONM) a través del lumen [4], [5]. Los nesprins en elementos a su vez de anclaje del citoesqueleto a la ONM [6] - [9], hardwiring así el citoesqueleto a la lámina nuclear y proporcionando un dispositivo para la transducción de la tensión mecánica de detección de la membrana plasmática al núcleo [10], [11 ]. En segundo lugar, las laminas de tipo A interactúan con una serie de parejas de unión dentro del núcleo, que a su vez interactúan con e influyen en la actividad de importantes reguladores del crecimiento. De las proteínas que de tipo A laminas interactúan con, la mejor caracterizada son las denominadas proteínas LEM de dominio [12], incluidas las proteínas de la membrana integral emerin [13], [14] y man1 [15], así como la nucleoesqueleto proteína LAP2α [16]. Un complejo de laminas de tipo A y emerin Recientemente se ha informado para regular la acumulación nuclear de activo β-catenina y pérdida de la función emerin conduce a no regulada de señalización β-catenina y el crecimiento auto-estimuladoras en fibroblastos [17]. Del mismo modo, un complejo de man1 y de tipo A laminas se ha demostrado que interactúan con el receptor regulado SMAD (rSMAD) y para antagonizar la señalización de TGF-β mediante la inhibición de rSMAD en el INM [18], [19]. Por último, un complejo de LAP2α y de tipo A se une a las laminas y correas de sujeción formas no fosforiladas del supresor de crecimiento pRb en el núcleo [20]. LAP2α y de tipo A laminas tanto participar en la represión Rb dependiente de E2F [21] y la pérdida de LAP2α o A-tipo laminas en los resultados de los fibroblastos en la entrada en fase S acelerada, a través de la pérdida de actividad pRb [21], [22].
Dada la importancia de las laminas de tipo a y sus parejas de unión a la regulación de las vías de crecimiento, se ha especulado que estas laminas podrían estar vinculados a la progresión del tumor [23]. Estudios previos han informado de la expresión diferencial de las laminas de tipo A en los tejidos tumorales y han relacionado la ausencia de laminas de tipo A a un aumento de la proliferación en el tumor. Sin embargo, no han logrado vincular los cambios en la expresión para el pronóstico del paciente o directamente a la progresión del tumor [24]. Por lo tanto, decidimos investigar cómo la expresión de las laminas de tipo A puede influir tanto en la progresión y los resultados de un tumor común. Para ello hemos examinado un archivo muy grande de tejido CRC vinculado a una amplia base de datos de los pacientes [25]. Inesperadamente, encontramos que la expresión de las laminas de tipo A dentro de un tumor era un indicador de riesgo muy significativo de la mortalidad relacionada con tumor. En investigaciones posteriores, se encontró que la expresión de la lamina A en líneas celulares de CRC promueve la invasión a través de la expresión regulada hasta de la proteína actina agrupación T-Plastin, que a su vez da lugar a la expresión regulada hacia abajo de la molécula de adhesión celular E-cadherina . Llegamos a la conclusión de que la expresión de las laminas de tipo A en CRC promueve la invasión tumoral mediante la reorganización del citoesqueleto de actina.
Resultados
Lamin A es un biomarcador de células madre adultas en las criptas del colon
Antes de investigar si la progresión de tipo a laminas influencia tumor, se evaluó la distribución de las laminas de tipo a en la mucosa colónica normal por tinción de secciones de tejido con un anticuerpo monoclonal específico para estas proteínas. Como era de esperar [26], las laminas de tipo A fueron altamente expresado en las capas epiteliales funcionalmente diferenciados y también se expresa fuertemente en el tejido circundante del estroma y el músculo subyacente. Por el contrario, la expresión de la lamina de tipo A fue muy débil o ausente de la mayoría de las células dentro de las criptas colónicas. Sin embargo, la expresión de la lamina de tipo A fue alta en aproximadamente cinco a diez células en la base de las criptas (Figura 1A, flechas). Las células teñidas positivamente en las criptas fueron muy similares en número y ocupaban una posición correspondiente a la general, se entiende que es el colon epitelial nicho de células madre [27], [28]. Para investigar más a fondo la identidad de estas células positivas de tipo A lamina, secciones seriadas se tiñeron con anticuerpos contra las laminas A & amp; C o el PCNA proliferación de biomarcadores. Las células de las criptas que se tiñeron positivamente para PCNA fueron negativos para laminas de tipo A, mientras que las células que fueron negativos para PCNA fueron positivos para laminas de tipo A (Figura 1B) lo que implica que el pequeño número de A-tipo lamin cripta basal positivo las células de hecho podrían ser postulado para ser células madre. También se encontró que mientras que los anticuerpos que detectan específicamente la lamina A se mancha el nicho de células madre propuesto (pero no las células en la zona de amplificación de tránsito adyacentes), lamin C no se detectó ya sea en el nicho de células madre o el tránsito células amplificar, pero se expresó en las células epiteliales diferenciadas y muscular subyacente (Figura S1). Por lo tanto la expresión de la lamina A en ausencia de lamin C aparece para definir un grupo de células en la región basal de la cripta del colon, lo que corresponde a un área postulado que es el nicho de células madre.
secciones finas (A) muestras de formalina fijos, cera incrustado de colon normal se tiñeron siguiendo mediada por el calor de recuperación de antígeno con un anticuerpo monoclonal contra JoL2 laminas A /C. Las secciones fueron ligeramente counterstained con Mayers Haemalum. Las puntas de flecha indican diferencian las células del epitelio, mientras que las flechas indican la ubicación prevista de la nicho de células madre en la base de la cripta. Las barras de escala = 150 micras (panel izquierdo) & amp; 50 micras (paneles de la derecha). (B) Las secciones seriadas de colon normal se tiñeron con anticuerpos para cualquiera de las laminas A /C (JoL2) o PCNA (PC10) y se procesa como se describe anteriormente. Las flechas indican dividiendo lentamente células en la base de las criptas, que se tiñen positivamente con JoL2 pero negativamente con PC10. Las barras de escala = 150 micras.
Expresión de laminas de tipo A es un indicador de riesgo en el CCR
El estudio de cohortes Países Bajos sobre dieta y cáncer [29] es un estudio de cohorte prospectivo. Inicialmente, se solicitó muestras de tejido de 819 pacientes de 54 laboratorios de patología a lo largo de los Países Bajos. Los casos incidentes incluyeron aquellos pacientes que desarrollan cáncer colorrectal entre 1989 y 1993. El tumor material que no estaba disponible para el 5% de los casos y de las 775 muestras de tejidos disponibles restantes, 737 contenían material tumoral suficiente para el análisis inmunohistoquímico. Utilizando los parámetros estándar para poner a prueba a nivel de significación del 5% y con un 90% de energía, la población mínima requerida para detectar con confianza pequeñas proporciones de riesgo sería 516, por lo que era seguro asumir que el tamaño de la muestra fue lo suficientemente grande como para producir la significación estadística .
La tinción inmunohistoquímica para detectar la expresión de las laminas a /C de recuperación después de antígenos se realizó en todas las muestras disponibles. En todas las secciones del tejido del estroma que rodea el cáncer era siempre fuertemente positiva para las laminas A /C que proporciona un control positivo interno. Uso de la tinción de tejido estromal como criterio para el éxito de la recuperación de antígeno, 673 (91%) de las muestras estaban disponibles para la puntuación. Se encontró que mientras que hubo alguna variación en la intensidad de la tinción en general, lamina nuclear expresión A /C en el tumor puede ser fácilmente clasificada como presente (Figura 2E-H) o ausente (Figura 2A-D) desde el núcleo. También se observó que, en un pequeño número de casos, no fue esporádica tinción citoplásmica y estas muestras se puntuaron como negativos cuando tinción nuclear estaba ausente. A raíz de puntuación a ciegas de diapositivas, la recuperación de la supervivencia del paciente y la información de la base de datos llevó el número final de casos únicos para ser reducido a 658 debido a la duplicación de los códigos de administración de pacientes, y otros 2 casos fueron excluidos al ser clasificado como tumores en anillo de sello.
4 micras, fijado en formol, se tomaron secciones en parafina procedentes de 656 adenocarcinomas colorrectales humanos independientes de los pacientes participantes en el estudio de cohortes Países Bajos sobre dieta y cáncer. Las secciones de tejido fueron sometidas a inmunohistoquímica utilizando el anticuerpo monoclonal de ratón JoL2 anticuerpo anti-humano lamina A /C antes de la visualización cromógeno y tinción de contraste de luz con Mayers Haemalum para diferenciar los núcleos. A-D muestran la tinción positiva (S) que rodea el tejido estromal negativamente a la tinción de tejido tumoral (T). (A) Moderadamente bien diferenciado adenocarcinoma en estadio I; (B) Moderadamente bien diferenciado adenocarcinoma en estadio II; (C) Moderadamente bien diferenciado en estadio III adenocarcinoma; (D) Moderadamente bien diferenciado adenocarcinoma en estadio IV. E-H muestran la tinción positiva (S) del estroma que rodea el tejido manchado positivamente tejido tumoral (T). (E) Moderadamente bien diferenciado adenocarcinoma en estadio I; (F) Moderadamente bien diferenciado adenocarcinoma en estadio II; (G) Moderadamente bien diferenciado en estadio III adenocarcinoma; (H) adenocarcinoma moderadamente bien diferenciado en estadio IV. Las barras de escala = 30 micras.
Durante el periodo de seguimiento, 246 pacientes murieron, con 163 de estos pacientes mueren como resultado de la CRC. De las 656 muestras disponibles evaluados por inmunohistoquímica, se encontró que la expresión de lámina nuclear A /C a ser positivo en 463 (70%) pacientes y negativo en 193 (30%) pacientes. Dentro del grupo de muestra de los pacientes que murieron de causas relacionadas con el CRC dentro del período de estudio (diez años), 127 obtuvieron positivo para las laminas A /C, mientras que el 36 proporcionen un resultado negativo. Utilizando cálculos de riesgo proporcional de Cox [30], se encontró que los pacientes que expresan las laminas A /C dentro del tumor eran casi dos veces más propensos a morir (hazard ratio [HR] 1,85; intervalo de confianza del 95% [IC]: 1,16 a 2,97) de la Convención relacionada causas en comparación con los pacientes clinicopathogically idénticos que fueron negativos para las laminas a /C (
p
= 0,005) (Figura 3). Por lo tanto la expresión de la lamina A /C en un tumor se correlaciona fuertemente con la muerte relacionada con el CRC.
análisis de impacto acumulado total para la presencia de la expresión de la lamina A /C y la mortalidad relacionada con el cáncer colorrectal para pacientes en estadio I-III en los Países Bajos estudio de cohortes sobre dieta y cáncer. razón de riesgo relativo (HR) = 1,85 (95% CI = 1,16-2,97),
p = 0,005
(ajustada por sexo y edad al momento del diagnóstico).
Expresión de la lamina A en líneas celulares de CRC promueve el aumento de la invasividad
El hallazgo de que la expresión de lamin a /C en los tumores de los pacientes se correlaciona estrechamente con la mortalidad relacionada con CRC fue inesperado y en cierta medida contra intuitivo. Por lo tanto, para entender por qué la expresión de las laminas A /C aumenta el riesgo de muerte en el CCR, obtuvimos una serie de líneas celulares de CRC e inicialmente los evaluaron el estado de la lamina A /C por inmunotransferencia. En una línea de células pre-metastásico, SW480, lamina A fue casi indetectable (Figura S2A, B) mientras que los niveles de expresión de lamininas B
1, B
2 y C fueron similares a otras líneas celulares de CRC (por ejemplo HT29 ). Por lo tanto, SW480 fue seleccionado para su investigación. Para determinar la expresión de la lamina A podría afectar SW480, los cultivos fueron transfectadas establemente con GFP o una GFP-lamina A constructo. Después de la transfección estable con GFP-lamina A cantidades moderadas de ambos lamin endógeno A, así como la proteína de fusión se detectaron, mientras que en cultivos de GFP transfectadas, lamina A permaneció ausente (Figura S2C, D). La morfología de las células en GFP y GFP-lamina cultivos transfectados A también era diferente. La morfología de las células en cultivos de GFP transfectadas (SW480 /CNTL) fue indistinguible a partir de cultivos no transfectados (SW480), con muchas células que fueron muy aplanados o en crecimiento en la parte superior de la otra. En contraste, en cultivos transfectados GFP-lamina A (SW480 /Lama), las células tenían una mayor husillo como aspecto y crecieron como una monocapa a baja densidad celular (Figura 4A).
(A) La morfología de untransfected SW480, SW480 /cntl y SW480 /Lama se comparó mediante microscopía de contraste de fase. SW480 /cntl y las células no transfectadas muestran una morfología aplanada y el crecimiento de varias capas. Por el contrario, la expresión ectópica de GFP-lamin A (SW480 /Lama) parece inducir cambios morfológicos, como la aparición de una forma de huso similar y el crecimiento como una monocapa. Barra de escala = 10 micras. (B) de Scratch heridas fueron hechas en 100% de cultivos confluentes de SW480 /o cntl células /Lama SW480. imágenes de contraste de fase fueron tomadas cada dos horas durante un período de 12 horas a partir de regiones idénticas. Barra de escala = 200 micras. (C) El tamaño de la herida con respecto al tamaño de la herida de partida se midió después de 12 horas en tres experimentos independientes y se expresó como un porcentaje de reducción en tamaño de la herida +/- desviación estándar (S.D.). La migración celular se ~seven veces más rápido en SW480 /Lama comparación con los cultivos /CNTL SW480, P & lt; 0,005. (D) las características del ciclo celular se investigaron mediante citometría de flujo. La proporción de células en cada fase del ciclo celular se da como media ± S.D.. de tres repeticiones. No se detectaron diferencias apreciables en las células de la dinámica del ciclo entre las dos líneas celulares.
El comportamiento migratorio /metastásico en células de cáncer se asocia típicamente con los cambios fenotípicos [31]. Para investigar si la alteración de la morfología celular correlacionado con el comportamiento migratorio alterada hemos realizado ensayos de la motilidad celular en los cultivos. Después de la herida cero, cierre de la herida era siete veces más rápido en cultivos transfectados con GFP-lamina A en comparación con cultivos transfectados con GFP (Figura 4B & amp; C) o células no transfectadas (no se muestra), lo que demuestra que las células transfectadas con GFP-lamina A eran de hecho más móviles que cualquiera de las células transfectadas con GFP o las células no transfectadas. Se investigaron otras características de su comportamiento celular que puede alterar como resultado de expresión de lamin A, incluyendo el crecimiento y la división celular. El uso de citometría de flujo no se encontraron diferencias apreciables en la dinámica del ciclo celular en GFP-lamina A frente a las células GFP transfectadas (Figura 4D). Por lo tanto de las características que investigó solamente la morfología celular y la motilidad fueron alterados en las células que expresan la lamina A.
En un estudio reciente [32], la expresión de la proteína actina agrupación, L-Plastin en las células SW480 llevó a la regulación por disminución de la e-cadherina y una mayor capacidad de invasión. Plastins son una familia de proteínas de actina-agrupación que están involucrados en la organización del citoesqueleto de actina y se expresan en una amplia gama de tejidos [33], [34]. La expresión potenciada de otro miembro de la familia Plastin, T-plastina se ha asociado con las células resistentes tanto de drogas y la radiación. De particular interés es el aumento significativamente la expresión de T-Plastin reportado en los cánceres humanos resistentes al cisplatino [34]. De ello se desprende que los tumores resistentes a los fármacos es probable que sea más agresivo. Nuestra conclusión de que la tasa de mortalidad en pacientes con tumores que expresan la lamina A /C es el doble que la de los pacientes con A /C tumores negativos lamina A sugiere que la expresión lamina A /C también se asocia con el comportamiento del tumor más agresivo. Además, se cree que la lamina A /C para influir en la organización del citoesqueleto de actina a través de interacciones con proteínas de engarce tal como nesprins [4]. Por otra parte, la actividad de T-plastina se ha informado en las células de carcinoma de colon HT29 [33], que se sabe que están lamina A positivo (este trabajo). Por lo tanto, nos preguntamos si la expresión de GFP-lamina A en las células SW480 causó cambios posteriores en la expresión de T-Plastin y si T-Plastin podrían estar implicados en el aumento de la capacidad de invasión observado aquí.
Los cambios en T-Plastin y E- los niveles de expresión de cadherina fueron investigados por RT-PCR. Se encontró que el T-Plastin no se expresó en células transfectadas con GFP pero estuvo presente en altos niveles en las células que expresan GFP-lamina A. En contraste, E-cadherina se expresa en altos niveles en células que expresan GFP sola, pero estaba ausente de las células que expresan GFP-lamina A (Figura 5A). Así, el aumento de la motilidad de las células que expresan GFP-lamina A probablemente se debe a que estas células son menos adherentes como resultado de la pérdida de expresión de E-cadherina y exhiben la dinámica de actina mejoradas. Para determinar si la lamina A dependiente de la expresión regulada hasta de T-Plastin observado, efectivamente, causa baja regulación de la E-cadherina y el aumento de la motilidad celular, se realizó siRNA desmontables de T-Plastin en GFP-lamina A SW480 células que expresan. En las células tratadas con siRNA, T-Plastin era indetectable y E-cadherina fue hasta reguladas (Figura 5B). Es importante destacar que, después de la herida cero, cierre de la herida fue también significativamente más lenta en los cultivos tratados con siRNA T-Plastin específica en comparación con cultivos tratados con siRNA revueltos (Figura 5C, D). Por lo tanto la expresión de T-Plastin hasta reguladas, que surge de la expresión de la lamina A afecta a la expresión de E-cadherina y directamente se traduce en las propiedades más invasivos de la lamina A transfectadas línea celular CRC
.
(A) La expresión de transcripciones T-Plastin y e-cadherina en SW480 /cntl y células SW480 /Lama se investigó el uso de semi-cuantitativos de RT-PCR. La igualdad de carga de material de partida se determinó mediante la amplificación de β-actina. No se encontraron células SW480 /Lama para expresar niveles significativamente más altos de T-Plastin ARNm en comparación con SW480 /cntl, pero los niveles significativamente más bajos de ARNm de E-cadherina en comparación con las células control (
p Hotel & lt; 0,005). (B) los cultivos SW480 /Lama fueron tratados con siRNA codificado o siRNA a T-Plastin. 108h después de ARN de tratamiento se extrajo y se amplificó por RT-PCR utilizando cebadores específicos a T-Plastin y E-cadherina. El cien por ciento desmontables de T-Plastin fue acompañado por la re-expresión de los transcritos de E-cadherina. (C, D) Alternativamente, heridas cero se realizó en cultivos confluentes 108H después del tratamiento siRNA y se midió el cierre de heridas tal como se describe en la Figura 4B, C. La migración celular fue & gt; 2 veces más rápido en cultivos tratados con siRNA revueltos en comparación con cultivos tratados con Sit-Plastin (
p Hotel & lt; 0,05). Barra de escala = 200 micras.
Discusión
En el presente trabajo se presentan dos nuevos e inesperados resultados. En primer lugar, la lamina A pero no lamin C es un biomarcador potencial del nicho de células madre en la cripta del colon y en segundo lugar, la expresión de lamin A /C en los tejidos de CRC está fuertemente correlacionada con la mortalidad relacionada con CRC y por lo tanto la lamina A /C representa un nuevo y biomarcador pronóstico importante en el CCR.
la ubicación del nicho de células madre en el colon se ha extrapolado a partir de células cinética y los estudios de radiomarcado. Por radiomarcaje células de las criptas en fase S con timidina tritiada, la velocidad media de migración de las células en relación con su posición de la célula se ha medido. Con este enfoque, el origen de la migración y, por extrapolación, el nicho de células madre se ha predicho que residen en la base de la cripta [35]. El número de células madre que ocupan este nicho se aproxima a cinco a diez células [36]. Más recientemente, la expresión del elemento de respuesta Wnt LGR5 se ha demostrado para definir las células madre del colon y se ha utilizado para confirmar que las células madre ocupan un nicho en la base de las criptas [27]. Las células de un número equivalente de ocupación y precisamente ese nicho se tiñen fácilmente con anticuerpos de detección de las laminas A /C o lamina A pero no se tiñeron con anticuerpos de detección específicamente lamin C. Por el contrario, en las células que ocupa la zona de amplificación de tránsito, la expresión de ambos lamina A y lamin C está ausente. Como era de esperar [26], [37], [38], los dos laminas se detectan fácilmente en el epitelio diferenciado funcional en la mucosa del colon. En consonancia con la idea de que la lamina A es un biomarcador potencial de las células madre del colon, las células en la base de la cripta, que son positivos para lamina A, son generalmente negativos para el PCNA proteína de replicación del ADN, como sería de esperar en las células que son en su mayoría quiescente [39]. Que lamina A es un biomarcador potencial de las células madre adultas tiene consecuencias generales importantes para la enfermedad. Laminas A /C se mutó en una amplia gama de enfermedades degenerativas que están vinculados al envejecimiento prematuro [3] y se ha sugerido que una causa de la degeneración en estas enfermedades es la pérdida de función de las células madre de adultos [40]. Esa expresión lamina A se observa en el nicho de células madre adultas del colon, se presta apoyo directo a esta hipótesis. El hallazgo de que la lamina A puede ser un biomarcador de células madre putativa tiene implicaciones adicionales para el descubrimiento de que la expresión de lamin A /C en el CCR está estrechamente relacionada con un mayor riesgo de mortalidad relacionada con el CRC, ya que podría ser considerado factible que las células cancerosas que expresan lamina a puede tener un vástago más fenotipo de células y por lo tanto como sea inherentemente más peligrosos [41].
Nuestra conclusión de que la expresión de un tipo laminas en el tejido CRC se correlaciona con un aumento de dos veces en la mortalidad relacionada con el CRC , en comparación con ausencia de laminas de tipo a, por primera vez vincula directamente estas proteínas para la progresión de una enfermedad común. Estudios previos han descrito alteraciones en la expresión de las laminas de tipo A en una variedad de cánceres, incluyendo cánceres de la piel, los pulmones, los vasos linfáticos y los tejidos blandos [24], [37], [42] - [44]. Sin embargo, ninguno de estos estudios fue capaz de enlazar o bien la ausencia o presencia de las laminas de tipo A a la progresión del tumor, aunque por lo menos un estudio [24] sugiere que la pérdida de expresión de las laminas A /C se correlacionó con las tasas de proliferación mejoradas en los tumores. El otro problema con estos estudios previos es que un número limitado de muestras disponibles para el análisis y por consiguiente estudiar tamaños cayeron por debajo del umbral para el análisis estadístico fiable. Por el contrario, nuestro hallazgo actual se basa en una gran cohorte suficientemente suficiente para ofrecer plena confianza en los niveles de significación reportados.
Nuestro hallazgo es hasta cierto punto contrario a la intuición, en la que la expresión de las laminas de tipo A en diversas células generalmente disminuye la proliferación de las células mientras que la ausencia de a-tipo laminas se puede correlacionar con un fallo para someterse a la detención del crecimiento en la confluencia [22] [21]. Por lo tanto, la hipótesis nula se utiliza al principio del estudio fue que la ausencia de las laminas de tipo A se correlaciona con un mayor riesgo de muerte por cáncer. Utilizando el modelo de CRC líneas de células no pudimos detectar cambios apreciables en la tasa de proliferación celular en células que expresan la lamina A en comparación con células de un fondo genético idéntico que carecían de expresión de la lamina. Sin embargo, sí hemos detectado un aumento significativo de las propiedades invasivas cuando comparamos la lamina A las células que expresan a las células en las que la expresión de la lamina A está ausente. Las propiedades invasivas de estas células surgen por causa de la presencia de la lamina A causa una corriente abajo sobre regulación de T-Plastin, que a su vez conduce a la regulación por disminución de la E-cadherina. Plastins son una familia descrita recientemente de proteínas de actina-agrupación que se han implicado en la invasión /metástasis [34]. En la misma línea celular tal como se utiliza en este estudio, la expresión de L-Plastin se ha notificado a llevar a la expresión regulada hacia abajo de la E-cadherina y una mayor capacidad de invasión y ha estado estrechamente correlacionado con metástasis [32]. Nuestros hallazgos actuales son totalmente coherentes con el estudio previo, pero sugieren, en primer lugar que la lamina A controla esta vía y en segundo lugar, que la invasividad puede ser inducida por la expresión de T-Plastin a través del mismo mecanismo. Curiosamente, también se observó que lamin A endógeno se detectó en las células SW480 sobre la expresión estable de GFP-lamin A, mientras que en presencia de GFP solo lamina A se mantuvo ausente. Es bien conocido que una de tipo laminas son susceptibles a la escisión en el enlazador 2 región no helicoidal [3]. Lamin A existe en las células, ya sea como reguladores de luz paralelos o tetrámeros anti-paralelos en los que el dominio de cabeza N-terminal se solapa con la región de engarce 2 [45]. Dado que el resto de GFP se encuentra en el extremo N-terminal, tal vez esta proteína grande protege enlazador 2 de la degradación proteolítica y por lo tanto estabiliza tanto GFP-lamina A y lamin endógeno A. El corolario de esta hipótesis es que la ausencia de la lamina A en las líneas celulares SW480 es debido a la modificación post-traduccional de la proteína.
cómo la presencia de lamina a influye en la expresión de una proteína actina agrupación es el objeto de estudios aguas abajo. Sin embargo, se pueden prever dos mecanismos distintos. Recientemente se ha demostrado que una de tipo laminas influyen directamente en la organización del citoesqueleto, la resistencia a la tracción de las células [46] y su capacidad para responder a estrés [10]. Esto se consigue a través del complejo LINC, que media las asociaciones entre la lámina nuclear y el citoesqueleto a través de las nesprins [4]. Por lo tanto, una posibilidad es que la presencia o ausencia de lamin A en una célula de cáncer pueden conducir directamente a la reorganización del citoesqueleto a través de un bucle de realimentación, que detecta la resistencia a la tracción de la célula. Alternativamente, la lamina A se ha demostrado que interactúan directamente con un rango de factores de transcripción [17] y su presencia puede influir directamente en la expresión de T-Plastin. De cualquier manera, el resultado fenotípico de esta reorganización se incrementa la invasividad y, presumiblemente, aumentó el potencial metastásico.
En conclusión, proponemos que el alto riesgo de mortalidad por causas relacionadas con el CCR en pacientes que exhiben expresión lamina de tipo A dentro de su tumor surge porque la lamina a es un regulador aguas arriba de una vía de la vinculación dinámica de la actina a la pérdida de la adhesión celular, lo que conduce a un aumento de la motilidad celular y en consecuencia aumenta el potencial invasivo del tumor. Este fenotipo puede a su vez ser el reflejo de una mayor propiedad tallo en forma de celdas de los cánceres. Mientras que las mutaciones en las laminas A /C se han implicado en una amplia gama de enfermedades genéticas raras [3], nuestros resultados actuales para la primera expresión de enlace tiempo de estas proteínas con la progresión de una de las causas más comunes de muerte por cáncer en el oeste . World
Materiales y Métodos
La inmunohistoquímica
secciones de parafina (4 m) de la mucosa colónica normal y adenocarcinoma colorrectal se des-paraffinised y rehidrata en xileno y etanol. Para la recuperación de antígenos, las secciones se sumergieron en 3% H
2O
2 para apagar la actividad de la peroxidasa endógena antes de ser incubado en tampón de citrato 0,01 M (pH 6,0) durante 20 min a 90 ° C. Las secciones fueron bloqueadas con 5% de suero normal de cabra seguido de incubación con cualquiera JoL2, anti-lamin A /C mAb de ratón [47] [1:10], PC10, anti-PCNA de ratón mAb [1:100], RALC, anti -lamin C anticuerpo policlonal de conejo [24] [1:100] o 133A2, anti-lamina a mAb de ratón [48] [1:100] durante la noche a 4 ° C. Las secciones fueron incubadas con biotina de cabra anti-IgG de ratón diluido a 1:400 durante 45 min a temperatura ambiente. A continuación, el proceso de ABC estándar se realizó de acuerdo a las instrucciones de Dako (DakoCytomation, Glostrup, Dinamarca). Diaminobencidina se utilizó como cromógeno seguido de tinción de contraste de luz con Mayers Haemalum.
Cultivo de células
Las líneas celulares de adenocarcinoma de colon metastásico pre-HT29 humanas y SW480 se obtuvieron de la Colección Europea de Cultivos Celulares, REINO UNIDO. HT29 se cultivaron en medio 5A de McCoy (Sigma, Reino Unido) suplementado con 10% FBS, 2 mM L-glutamina, 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina y se mantuvieron en un ambiente humidificado a 37 ° C con 5% de CO
2. SW480 células y derivados transfectadas se cultivaron en medio Leibovitz-15 (L-15) (Invitrogen, Reino Unido) suplementado con 10% FBS, 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina y se mantuvieron en un ambiente humidificado a 37 ° C sin CO
2.
la transfección estable de GFP-reporteros en células de adenocarcinoma de colon SW480
SW480 células fueron transfectadas con construcciones de ADN que codifican una proteína de fusión de EGFP-lamina a de longitud completa (regalo del Dr. M. Izumi, Instituto de Investigación física y química, Saitama, Japón) y EGFP.