Extracto
heterogeneidad celular es una parte integral del desarrollo y progresión del cáncer. La progresión se puede asociar con aparición de células que exhiben alta plasticidad fenotípica (incluyendo "de-diferenciación" a los estados de desarrollo primitivas), y las propiedades de comportamiento agresivos (incluyendo altos potenciales tumorigénicas). Hemos observado que muchos marcadores biológicos que se usan para identificar células madre del cáncer (CSC) puede etiquetar subconjuntos de células en un estadio clínico avanzado de cáncer de pulmón (derrame pleural maligno, o MPE). Por lo tanto, CSC-biomarcadores pueden ser útiles para la clasificación en vivo subconjuntos de células funcionalmente distintas de los tumores individuales, que pueden permitir a los investigadores a afinar en la base molecular para la heterogeneidad funcional. Nosotros demostramos que el CD44
hi subconjuntos de células cancerosas (CD44-alta) muestra mayor potencial clonal, formadora de colonias de CD44
células LO (n = 3) y también son tumorigénicos (n = 2/2) cuando se trasplantan en modelo de xenoinjerto de ratón. Los CD44
subconjuntos hi expresan diferentes niveles de embrional (desdiferenciación) marcadores o reguladores de la cromatina. En los tejidos de cáncer de pulmón archivados, marcadores ALDH co-localizar más con CD44 en el carcinoma de células escamosas (n = 5/7) que Adeno Carcinoma (n = 1/12). MPE células cancerosas y una línea celular de cáncer de pulmón (NCI-H-2122) presentan anomalías cromosómicas y 1p36 eliminación (n = 3/3). Dado que el miR-34a se asigna al sitio 1p36 eliminación, se detectaron bajos de miR-34a niveles de expresión en estas células. La formación de colonias eficiencia de CD44
hi células, propiedad característica de CSC, puede ser inhibida por la sustitución miR-34a en estas muestras. Además, el altamente tumorigénicas CD44
hi células se enriquecen de las células en la fase G2 del ciclo celular
Visto:. Basak SK, Veena MS, Oh S, C Lai, Vangala S, Elashoff D, et Alabama. (2013) El CD44
altos tumorigenos subconjuntos de cáncer de pulmón Bioespecímenes se enriquecen de baja expresión de miR-34a. PLoS ONE 8 (9): e73195. doi: 10.1371 /journal.pone.0073195
Editor: Mauricio Rojas, Universidad de Pittsburgh, Estados Unidos de América
Recibido: 2 de mayo de 2013; Aceptado: July 16, 2013; Publicado: 3 Septiembre, 2013
Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la advocación de dominio público Creative Commons CC0
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de Departamento de Medicina de la UCLA y el Robert W. Green, de cabeza y cuello Programa de Oncología Quirúrgica en la UCLA. Los fondos de donaciones se utilizaron para reactivos y apoyo para los salarios de los investigadores involucrados en el estudio. Los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida de datos y análisis
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
heterogeneidad tumoral puede ser. caracterizado por la expresión diferencial de los marcadores de superficie celular, las diferencias genéticas y epigenéticas, y /o diferencias en las moléculas de señalización clave o efectores de la función de la célula. heterogeneidad celular puede caracterizarse por diferencias en las propiedades funcionales (comportamiento) de células (clonogenicidad, capacidad de formación de colonias en agar blando, la tumorigénesis etc.). Mientras que muchas investigaciones han optado por asociar marcadores de superficie celular en las células tumorales que se encuentran en el sitio del tumor primario con CSC-conductual propiedades, se observó que las fases clínicamente avanzados se enriquecen en particular para los subconjuntos de células que llevan CSC-biomarcadores. Por lo tanto, postulamos que la enfermedad en estadio avanzado no prohíbe (y puede ser ventajoso) para asociar biomarcadores específicos con fenotipos funcionales. De acuerdo con ello, nuestro enfoque de descubrimiento biológico hace hincapié en el diseño de bioensayos funcionales apropiados para caracterizar tanto los fenotipos de células y la iniciación del tumor subyacente biología molecular, así como la progresión tumoral.
El cáncer de pulmón es la principal causa de mortalidad por cáncer en hombres y mujer; con cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC) que representa el 80-85% de los casos [1]. Para la comprensión de la biología que subyace a esta alta mortalidad, hemos seleccionado un modelo de enfermedad en estadio avanzado (MPE). pacientes con cáncer de pulmón que se presentan con MPE tienen una mortalidad significativamente mayor que aquellos sin error máximo permitido, o aquellos que tienen efusiones citológicamente negativas [2] - [4]. Por lo tanto, la carga MPE-tumoral está impregnada de propiedades biológicas que disminuyen la supervivencia de pacientes con cáncer. Es importante destacar que la población tumor MPE mayor se compone de subpoblaciones heterogéneas [5]. En parte, esta heterogeneidad se puede caracterizar por biomarcadores asociados típicamente con las características de la CSC (CD44, ALDH, CMET, CD166, MDR-1, uPAR, PTEN, OCT-4, IMC-1, hTERT, SUZ12, EZH2).
Uno de los objetivos del presente estudio fue determinar si podemos identificar un subconjunto de células tumorales que muestra un aumento de la competencia para la propagación del tumor y el mantenimiento, y para comenzar a caracterizar las bases moleculares de estas propiedades. En primer lugar, estudiamos CD44 como marcador de selección para las células predice que tienen alto potencial tumorigénico porque se ha identificado previamente CSC en diversos cánceres epiteliales, incluyendo cáncer de mama [6], cabeza y cuello, [7], [8], de páncreas [9], [10], y de próstata tumores malignos [11] - [15]. CD44 se expresa altamente en diferentes subtipos de cáncer de pulmón, [16], y su expresión se relaciona con mal pronóstico en los pacientes [17]. Estudios recientes realizados en líneas celulares de cáncer también caracterizan CD44
hi células como CSC [16].
MPE-culturas primarias contienen una subpoblación de células que expresa CD44 altamente (CD44
hi). Cuando estas células están ordenadas de los cultivos MPE-primarios, presentan un alto potencial tumorigénico, incluyendo el injerto de los tumores en ratones NOD /SCID IL2γR
ratones nulos en diluciones limitantes de trasplantes de células. Estas propiedades son características de CSC. Las fracciones de CD44
células hi se asocian con una expresión elevada de otro CSC-marcador asociado con el metabolismo de xenobióticos, ALDH. El CD44
hi /ALDH
fenotipo hi es evidente tanto en células escamosas (SCC) y adenocarcinoma (AC) del pulmón, lo que sugiere que los perfiles de los marcadores similares pueden etiquetar (altamente tumorigénicas) fracciones celulares de comportamiento agresivo en los distintos " linajes "(subtipos histopatológicos) de los cánceres de pulmón [18].
MPE tumores generalmente muestran anomalías cromosómicas y hiperploidía. análisis FISH detecta una anomalía específica común en 1p36 región, lo que sugiere que esta región puede desempeñar un papel importante en la contribución a las propiedades de comportamiento agresivos. La región 1p36 ha sido identificado previamente para contener el locus que codifica supresor de tumor microARN (miR-34a). La pérdida de expresión de miR-34a está implicada en la progresión del cáncer [15], [19]; este estudio se suma a la evidencia. Altamente tumorigénicas CD44
hi células expresan bajos de miR-34a, y el reemplazo miR-34a inhibe la formación de colonias de CD44
hi células en agar blando. El análisis del ciclo celular de CD44
hi células indicó que estas células altamente oncogénicas residen en la fase G2 del ciclo celular.
Materiales y Métodos
Derrame pleural maligno (MPE) toma, la preparación y el cultivo celular
Todos los sujetos del estudio se sometieron consentimiento informado por escrito mediante un procedimiento aprobado por la junta de revisión institucional (IRB) de los Asuntos de Veteranos-Gran los Angeles Healthcare System (VAGLAHS) y el estudio fue aprobado por el IRB -VAGLAHS. MPE especímenes (M-1, M-2 y M-3) se recogieron de pacientes en Asuntos de Veteranos-Mayor Sistema de Salud de Los Ángeles (VAGLAHS). Las células se cultivan en presencia de 20 a 30% MPE (medio de cultivo primaria o PCM) como se describe anteriormente [5]. (Información de apoyo S1 y S2).
Control establecido líneas celulares
Dos líneas celulares establecidas GM 05399 (fibroblastos normales) y H2122 (cáncer de pulmón) se utilizaron en el estudio. La línea celular de fibroblastos GM 05.399 se obtuvo del Instituto Coriell de Investigación Médica (Camden, Nueva Jersey). La línea celular se deriva de un 1 años de edad, varón de raza blanca. La línea celular se mantiene en nuestro laboratorio en Dulbecco medio de Eagle modificado (DMEM) en presencia de 10% de suero bovino fetal (FBS) [20]. La línea celular de adenocarcinoma de pulmón H2122 se generó por Adi Gazdar de un derrame pleural maligno, y adquirió de Ilona Linnoila y Herb Oie del NCI. Se depositó posteriormente en ATCC (NCI-H2122 [H2122] ATCC® CRL-5985 ™) [21]. La línea celular se mantiene en nuestro laboratorio en medio RPMI-1640 en presencia de 10% de FBS [22], [23]. Tanto las líneas celulares están disponibles al público
Los anticuerpos
Los siguientes anticuerpos fueron utilizados para citometría de flujo FACS /ordenar:. Antihumano de ratón IgG2b CD44-FITC, (BD Biosciences#555478); FITC de ratón IgG2b isotipo de control κ, BD Biosciences#555742); ratón CD44 anti-humano marcado con PE, (BD Pharmingen#555479); PE Ratón Ratón IgG2b isotipo de control κ, BD Biosciences 555743. anti-CD166-FITC (monoclonal de ratón; IgG1 Setrotech#MCA 1926F, primario no marcado anti-CMET (IgG2a de ratón, Abcam#49210), anti-uPAR (IgG de ratón, Santa Cruz Biotech#13522), el anticuerpo secundario utilizado para el estudio utilizados fueron: cabra (Fab ') 2 anti-ratón IgG (H + L) -PE-Cy.5.5 (Caltag laboratorios#M35018)
la inmunohistoquímica (. IHC)
tejido de cáncer de pulmón humano primario (carcinoma de células escamosas: SCC y adenocarcinoma:. AC) o tejido de control de pulmón humano (alveolar humana normal y los tejidos bronquiolar) se obtuvieron de la facilidad de la base Departamento de Patología de UCLA tumores de xenoinjertos derivado de CD44
hi células inyectadas en ratones NOD /SCID (IL2rγ
null) los ratones fueron extirpados quirúrgicamente, cortado en trozos de 0,3-0,5 mm y se fijaron en etanol (Fisher Scientific) o Z-fix (Anatech, MI). para IHC, secciones 3-5 μ secciones fueron cortadas y deparaffinized y se procesaron para la recuperación de antígenos [5] y se tiñeron para la expresión del marcador. Inicialmente secciones de tejido fueron teñidas con la tinción de anticuerpos único marcador (CD44 o ALDH). Una vez que las condiciones se optimizaron para la tinción del antígeno solo entonces la tinción del antígeno dual (CD44 y ALDH) de secciones de tejido se logró. cortes de tejido incluidos en parafina fueron desparafinados y rehidratados. Después de la recuperación de antígeno (tampón de citrato de sodio 10 mM, pH 6.0 por vapor 25 minutos) y el bloqueo, se inactivaron peroxidasas endógenas (3% H
2O
2 en 1% de azida de sodio con PBS, 30 minutos en la temperatura ambiente) . Los portaobjetos se incubaron con anticuerpo policlonal de conejo primario al ALDH1A1 (Abcom Inc. Cat#ab51028), durante la noche a 4 ° C. Los portaobjetos se lavaron con PBS y se incubaron con EnVision + System-HRP Labelled polímero anti-conejo (Dako Cat#K4003) durante 30 minutos. Los portaobjetos se incubaron en DAB (Vector Kit sustrato de peroxidasa#SK-4100 con níquel Sol) durante 10-20 minutos y luego se lavaron los portaobjetos 5 minutos 3 veces con PBS. Para la doble tinción con CD44 (R & amp; D Systems, ratón monoclonal IgG, Cat#BBA 10), los portaobjetos se incubaron también en el antisuero primario a temperatura ambiente durante 1 hora, seguido por el anticuerpo secundario, biotinilado anti-ratón IgG ( gato vectorial#9200) y, a continuación, kit ABC (vector Cat#AK-5000) y el kit rojo del vector de la fosfatasa alcalina sustrato I (vectorial Cat#SK-5100), desarrollaron durante 20 minutos. Las secciones fueron contra el teñidas con hematoxilina de Harris, se deshidrataron en alcohol clasificado, limpiado en xileno y se montaron en portaobjetos de vidrio con hoja de la cubierta. Las secciones teñidas se examinan bajo un microscopio (Leica-Leitz DMRBE o Olympus 1 × 71) y las zonas de antígeno que expresan positivos o dobles determinados por los patólogos de la UCLA.
Citología y citometría de flujo (FACS)
las fotomicrografías se tomaron usando el microscopio Leitz Leica- DMRBE montado con una cámara CCD y el análisis FACS se realizó utilizando el Becton Dickinson FACSCalibur Analytic citómetro de flujo [5]. Clasificación de células se ha realizado mediante el Becton Dickinson FACSVantage SE Clasificación citómetro de flujo en la facilidad de la base de citometría de flujo UCLA-CMCA.
Invertir Transcriptase- PCR (RT-PCR) Análisis de la Expresión Génica
La Las muestras primarias se clasifican primero en CD44
hI y CD44
Lo poblaciones. Las células se recogieron y el ARN se extrajo usando Trizol y Track 2.0 kit de aislamiento de mRNA Fast (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA) y se transcribieron inversamente utilizando RT kit [5]. Las muestras se utilizaron para la PCR para la amplificación de Bmi1, hTERT, SUZ12, EZH2, y genes Oct4. Se utilizaron los siguientes cebadores:
Bmi1
Delantero - 5 'AATCTAAGGAGGAGGTGA 3', 'CAAACAAGAAGAGGTGGA 3' reverse-5,
hTERT
Delantero -5 'GGAATTCTGGAGCTGCTTGGGAACCA 3', y la inversa 5 'CGTCTAGAGCCGGACACTCAGCCT -TCA 3 ',
SUZ12
Delantero -5' GATAAAAACAGGCGCTTA-CAGCTT 3 ', y Reverse-5' AGGTCCCT-GAGAAAATGTTTCGA 3 ',
EZH2
orientadas hacia el 5' TTGTTGGCGGAAGCGTGTAAAATC 3 'y Retroceso -5 'TCCCTAGTCCCGCGC-AATGAGC -3', y 'CAACTCCGATGGGGCCCT 3' Oct4 orientadas hacia el 5 y -5 Reverse 'CTTCAGGAGCTTGGCAAATTG 3'. Las condiciones para las amplificaciones de genes diferentes se han descrito anteriormente [5]. Los productos de PCR fueron separados por 8% en geles de TBE (Tris, 50 mM de borato de pH 8,0, EDTA 1 mM) seguido por la tinción de bromuro de etidio. Los geles fueron analizados utilizando el software Kodak 1D.
Formación de Colonias Eficiencia Ensayo
in vitro
ensayos de colonias de formación in se realizaron como se describe [12]. Ordenada CD44
HI y CD44
Lo células se sembraron a una densidad clonal (100-500 células /pocillo) en placas de cultivo tisular de seis pocillos en triplicado. Holoclones con & gt; 20 células se contaron al cabo de 10 días de cultivo. Los resultados se expresan como porcentaje de la eficiencia de clonación.
Formación del esferoide en el Ensayo de agar blando
Ordenada CD44
Lo Hi células CD44 y se sembraron a 1000 células /pocillo por triplicado en placas de cultivo de seis pocillos que contenían agar superior al 0,35% en capas sobre la base de agar al 0,5% (Grado ADN) que contiene PCM. Se contaron las colonias a las 3 semanas después de la galvanoplastia, los resultados representan la media de tres experimentos independientes.
tumorogénesis en ratones NOD /SCID (IL2rγ
null) Ratones
Todos los ratones funcionan protocolo correspondiente para el estudio fue aprobado por el Comité de Cuidado y uso de Animales institucional de la UCLA /VAGLAHS. CD44
HI y CD44
células del lo fueron ordenados por FACS y se inyectan en diferentes dosis de células (300 /ratón, 3000 /ratón y 30000 /ratón) en el derecho y el flanco izquierdo, respectivamente, en ratones NOD /SCID (IL2γ
null) ratones en 100 l de solución salina. Los ratones fueron monitorizados para el crecimiento del tumor en ambos de los flancos. Los resultados se representan como promedios de los grupos de volumen del tumor, como se describe [24].
miR-34a estudios de transfección
Para analizar los efectos que el miR-34a tiene sobre la eficiencia de formación de colonias en agar blando ensayo las CD44
células hi fueron transfectadas transitoriamente con cualquiera de miR-34a (AM17100, Applied Biosystem /Ambion) o el control negativo (codificado) oligonucleótido. Del mismo modo CD44
Lo células fueron transfectadas transitoriamente con cualquiera inhibidor anti-miR-34a (# AM17000, Applied Biosystems /Ambion) o un control negativo anti-MIR oligonucleótido (# AM17010, Applied Biosystems /Ambion). La transfección se realizó con CD44
hi o CD44
Lo células utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen) en placas de 6 pocillos con 50.000 células /pocillo con 100 pmol de MIR, anti-MIR y control mezclado /oligonucleótidos. Después de 2 días de la transfección se recogieron y se ensayaron para blanda eficacia de formación de colonias en agar como se describe anteriormente las células.
La hibridación fluorescente in situ (FISH) Análisis de Muestras MPE
FISH estudios se realizaron según protocolo establecido [25]. LSI 1p36 sonda se marcó con naranja espectro y LSI 1q25 sonda se marcó con espectro verde y se hibridó a la metafase para untar como se describió anteriormente [25], [26]. En pocas palabras, metafase para untar se prepararon mediante procedimientos citogenéticos estándar. Las sondas marcadas se hibridaron y lavados se realizaron en idénticas condiciones de rigurosidad. Los portaobjetos se hibridó a 37 ° C durante la noche con 1 a 4 ng de la sonda, 50% de formamida, 10% de dextrano, 2 x SSC, y 50 ng de ADN Cot 1 para suprimir secuencias repetitivas. Los cromosomas en metafase se contratiñeron con 4,6-diamidino-2 fenilindol (DAPI) en solución de Vectashield (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA). El cariotipo de los cromosomas se realizaron de acuerdo con los protocolos establecidos.
Invertir Transcriptase- PCR cuantitativa (RT-qPCR) Detección de miR-34a en MPE muestras
El ARN total fue aislado de las muestras utilizando Trizol. miR-34a se midió por el Paso Uno Plus sistema de PCR en tiempo real (Applied Bio, CA) mediante el uso de Taq-Man MicroARN ensayos (Applied Biosystems, Foster City, CA) y normalizado por niveles RNU48. 3 ul de 20 ng /ul de RNA total se utilizó para realizar la transcriptasa inversa de la reacción (RT) (30 min a 16 °, 30 min a 42 °, 5 min a 85 grados) utilizando dNTPs 10 mM, enzima MultiscribeRT, 10 × RT buffer, inhibidor de RNasa, el cebador Taqman RT y el agua en el volumen de reacción total de 15 ul. Para qPCR, 10 ul de 2 × PCR TaqMan Universal Master Mix (n AmpErase UNG de ABI), 7 l de agua, se usó 1 ul de Taqman imprimación (miR-34a y RNU48) y 2 ul de cDNA para cada reacción, siguiendo protocolo de amplificación (10 min a 95 °, 15 seg para 95 grados, 60 segundos a 60 grados durante 40 ciclos) usando la Etapa Uno Plus sistema de PCR en tiempo real (Applied Biosystems, CA).
Surface marcador etiquetado y la célula análisis del ciclo de
Las células se tiñeron con CD44-FITC y PI (yoduro de propidio) para el análisis del ciclo celular (modificado de /citometría de flujo protocolo facilidad de la base UCLA). En pocas palabras, 1 × 10
6 única suspensión celular se lavó con PBS /2% PCM, se sedimentaron, y se marcaron con anticuerpo anti-CD44 humano IgG2b-FITC de ratón (BD Biosciences#555478) durante 45 min. a temperatura ambiente en la oscuridad, anticuerpo de control se utilizó como control negativo. Las muestras se resuspendieron en 1 ml de tampón que contenía 10 microgramos /ml de PI y 11,25 unidades de Kunitz de RNasa e incubar durante al menos 30 min a 4 ° C en la oscuridad y se analizaron en el citómetro de flujo dentro de 30 min de la tinción PI .
análisis estadístico
Los datos se representan como media ± desviación estándar y se analizaron con dos caras
t
se utilizó la prueba de EXCEL y análisis de medidas repetidas de la varianza (ANOVA) para la comparación entre los grupos por SAS 9.3. Un
P
valor & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
Expresión CD44 Perfil de MPE Derivado células tumorales
células MPE-tumorales pueden ser aislados. y ampliado en cultivos primarios de corto plazo en presencia de MPE células no tumorales autólogas y fluidos [5]. poblaciones heterogéneas, incluyendo al candidato CSC, están presentes en la población tumoral MPE-, como se refleja en la expresión variable de CSC-biomarcadores: c-MET, uPAR, MDR1, CD166, CD44, y ALDH. Por lo tanto, además de
intra
heterogeneidad morfológica tumoral, existen diferencias en las intensidades de etiquetado CD44 de superficie, y estas diferencias pueden ser explotadas para segregar los subconjuntos de células [5].
Los cultivos primarios de tres diferentes MPE-muestras (M-1, M-2 y M-3), contienen variantes morfológicas (plana, ovalada y formas redondeadas) por microscopía de luz (Figura 1A, B). Por el 4
ª semana de cultivo, las células tumorales adherentes muestran un patrón morfología más homogénea en cultivo (Figura 1C). Las células cultivadas de manera uniforme CD44 expresa en las tres muestras tumorales (Figura 1D), pero la intensidad de marcado es muy variable entre y dentro de la misma muestra. Por lo tanto, en comparación con células marcadas con el anticuerpo secundario solo, las muestras son 96%, 99% y 98% positivas para CD44; Sin embargo, las intensidades medias de fluorescencia (IMF) de etiquetado CD44 son 10861, 5295 y 2120, respectivamente. Por lo tanto, la intensidad de marcaje de la superficie de la expresión de CD44 puede variar de 2 a 5 veces entre las muestras tumorales, y no es típicamente una gran variación en el etiquetado promedio CD44 de superficie
dentro
muestras individuales.
El tumor células de M-1, M-2 y M-3. (A) 100 x (2-3 semanas). (B) × 400 (2-3 semanas). (C) Las etapas posteriores de cultivo de 100 × (6-10 semanas). (D) CD44- FACS patrón de expresión y la IMF. (E) Clasificación de CD44
CD44
células LO (5-10%) y alta. Las células clasificadas CD44
HI y CD44
lo se lavaron y se sembraron en PCM durante 2-3 días para evaluar sus diferencias morfológicas. (F) Morfología de CD44 ordenados
hi células y células LO (G) CD44
ordenados fueron similares (100 ×). La pureza de los CD44
Lo Hi células CD44 y
eran ≥98%, según lo revelado por análisis post especie (datos no mostrados).
ausencia de diferencias morfológicas entre CD44
hI y CD44
Las células del lo
MPE-culturas primarias adquieren un patrón morfológico más homogénea de crecimiento en el tiempo. Para determinar si las diferencias sutiles en la morfología de la cultura podían distinguir el CD44
HI desde CD44
culturas LO, el M-1, M-2 y M-3 muestras se marcaron con anticuerpo anti-CD44 y ordenados por FACS, con puertas fijó en el 5% de las células en el marcador CD44 de alta y baja expresión de los marcadores CD44 (Fig. 1E). La pureza de los CD44
Lo Hi células CD44 y
eran ≥98%, según lo revelado por análisis post especie (datos no mostrados). Las células clasificadas CD44
hi (Figura 1F) y CD44
lo (Figura 1G) se lavaron y se sembraron en PCM durante 2-3 días para evaluar sus diferencias morfológicas. Estos estudios sugieren que no hay diferencias en la morfología distintiva cultura asociada con la expresión de CD44 de superficie.
CD44
Las células hola muestran alta Formadoras de Colonias Capacidad
Para investigar si la CD44
hi las células son funcionalmente diferentes de las células CD44 Lo
en la eficiencia de formación de colonias, nos lo solucionaron y se cultivaron estos subconjuntos de las tres muestras (M-1, M-2 y M-3). 100-500 células de CD44
o CD44
Lo Hi células se sembraron en pocillos individuales de placas de 12 pocillos. A pesar de que no somos capaces de detectar diferencias significativas en la eficiencia inicial de chapado, pero sí observamos que CD44
hi células son más competentes en la formación de holoclones que las células CD44 Lo
(
t
prueba y ANOVA: P & lt; 0,05) (Figura 2A). Por lo tanto, una diferencia biológica intrínseca entre CD44
HI y células CD44 Lo
parece una competencia diferencial inherente a holoclones forman.
Las células clasificadas CD44
HI y CD44
lo de MPE muestras fueron analizadas por triplicado por su eficiencia clonal (a) (muestra M-1: colonias CD44
hi = 35,8 (SD = 5,04) vs CD44
Lo = 21,7 (SD = 6,2) (p = 0,03) ; la muestra M-2 colonias CD44
hi = 59,8 (SD = 3,2) vs CD44
Lo = 40,6 (SD = 4,1) (p = 0,003); la muestra M-3 colonias CD44
hi = 53,4 ( SD = 5,3) vs CD44
Lo = 33,9 (SD = 3,6) (p = 0,006)); El efecto medio de CD44
hi contra CD44
lo es (IC del 95%: 8.31, 26.89: p = 0,015) 17.6. (B) de colonias en agar blando capacidad de conformación. (Muestra M-1: colonias CD44
hi = 16,6 (SD = 1,1) vs CD44
Lo = 8 (SD = 1,1) (P = 0,0006); la muestra M-2: colonias CD44
hi = 27 (SD = 7) vs CD44
Lo = 12 (SD = 3) (p = 0,02); la muestra M-3: colonias CD44
hi = 24,3 (SD = 6,1) vs CD44
Lo = 12,6 (SD = 2,5) (P = 0,03)). El efecto medio de CD44
hi contra CD44
lo es (IC del 95%: 3,41, 20,14; p = 0,026) 11.8. Columnas, con una media de tres experimentos independientes; SD, *,
P Hotel & lt; 0,001, en comparación con los grupos de Lo CD44
, (
t
prueba de Student). (C) colonias en agar blando derivados de CD44
hi células (100 ×) y las células LO (D) CD44
(100 ×). (E) Expresión perfil de IMC-1, hTERT, SUZ12, EZH2 y OCT-4 en ordenados CD44
hi células CD44 LO y
se analizaron mediante la transcriptasa inversa-PCR cuantitativa. En la muestra M-3 sólo IMC-1 se expresa a alto nivel en CD44
hi población que el CD44
población de células Mín. En la muestra M-2 ligera más alta expresión de hTERT en CD44
hi células CD44 que
Lo células. El CD44
hi población de la muestra M-1 expresado alto nivel de IMC-1, hTERT, SUZ12, EZH2 y OCT-4, que CD44
Población Mín.
CD44
Las células hola muestran alta capacidad de formación de esferoides en agar blando culturas
Otra medida sustituta utilizada para caracterizar CSC es una competencia diferencial a la formación de colonias de anclaje "independientes" en agar blando [12]. CD44
Lo Hi células CD44 y
a partir de muestras (M-A-1, M-10-26 y M-8-15) se evaluaron mediante siembra de las células clasificadas en agarosa suplementadas con PCM. Los CD44
hi células de las tres muestras exhiben de manera uniforme una mayor eficiencia de la formación de esferoides de los CD44
células LO (
t
prueba y ANOVA: P & lt; 0,05) (Figura 2B). Los más robustos CD44
hi colonias también son cualitativamente distinguible de colonias formadas por vestigiales CD44
células LO (Figura 2C frente 2D). De este modo, CD44
hi células poseen una mayor competencia en la formación de colonias en agar blando de las células CD44 Lo
derivados de la misma biospecimen cáncer de pulmón.
CD44
Las células hi variablemente Características de la pantalla moleculares que caracterizar CSC
los marcadores que caracterizan
candidato
CSC (hTERT, SUZ12, OCT-4 expresión, etc.) son evidentes en sedimentos de células aisladas a partir de muestras de los márgenes de error [5]; Por lo tanto, CSC son un componente probable de la mezcla de MPE-tumor. Tales marcadores CSC se componen de forma variable componentes proteicos embrionario o Polycomb y su expresión pueden predecir el etiquetado de los subconjuntos de células que poseen un alto potencial cancerígenas o formadoras de colonias [27]. Para determinar si estas
candidato
marcadores CSC se limita a CD44 específico ordenados subconjuntos, que exhibió la CD44
HI y CD44
lo subconjuntos de células para la expresión diferencial de mRNA; amplificación por RT-PCR de BMI-1, hTERT, SUZ-12, se llevó a cabo EZH2 y OCT4. Indexado a mRNA de beta-tubulina, hay una marcada variabilidad en la expresión de estos marcadores dentro de los subconjuntos de células CD44-ordenados (Figura 2E). Por ejemplo, el IMC-1 y ARNm de hTERT es más altamente expresado en CD44
hi células que las células CD44 Lo
en la muestra M-3 y M-2, respectivamente. Sólo en la muestra M-1, las distribuciones esperadas de marcadores CSC (IMC alto, hTERT, SUZ12, EZH2 y OCT-4) son evidentes en CD44
hi células que las células CD44 Lo
.
estos resultados indican que 1) los marcadores moleculares que codifican para modificadores de la estructura de la cromatina o genes embrionarios pueden estar presentes en ambos subconjuntos altamente tumorigénicas y no tumorigénicas de las poblaciones celulares de cáncer de pulmón individual, y 2) que hay una marcada variabilidad en la expresión diferencial de estos candidatos "CSC-biomarcadores en muestras biológicas" cáncer de pulmón.
CD44
las células hi formar tumores en ratones NOD /SCID (IL2rγ
nula) Ratones
Como marcadores moleculares específicos pueden no fiable diferenciamos tumorigénico de subconjuntos de células no tumorigénicas, podemos distinguir estos subconjuntos sobre la base de los fenotipos de comportamiento? El CD44
HI y CD44
subconjuntos de células lo de las poblaciones de células tumorales individuales muestran consistentemente diferencias en holoclone adherente y la formación de colonias en agar blando. A medida experimental clave de "CSC", sin embargo, es por la demostración de mayor potencial tumorigénico en modelos de ratón. Se ha demostrado que los ratones NOD /SCID (IL2rγ
ratones nulos son sensibles modelo para evaluar fenotipos conductuales CSC-altamente tumorigénicas [16], [28]. Para corroborar las diferencias observadas en formadoras de colonias y la formación de esferoides habilidades de CD44
hola vs CD44
Lo con células
in vivo
tumorigénesis, se investigó su capacidad para formar tumores en ratones NOD /SCID (IL2rγ
null) ratones.
diluciones limitantes (30.000 ; 3000; 300) de ordenados CD44
células lo hi y CD44
de M-1 y M-2 errores máximos permitidos se inyectaron en el derecho y en los flancos, respectivamente, de los ratones NOD /SCID (IL2rγ
nula) a la izquierda. CD44
células tumorales hi de la muestra M-1 forman tumores en 3/3 ratones en ambos 30000 y 3000 inyectaron dosis de células, y en uno de los 3 ratones inyectados con 300 células tumorales (Figura 3 a, B, C). el período de latencia de tumores fue de 50-90 días, 90-150 días y 150 días, por 30 000; 3.000 y 300 CD44
células hi respectivamente (Figura 3E) por lo tanto, la cinética de la formación de tumores por la muy tumorigénico CD44
células hI fue dependiente de la dosis. El CD44
células tumorales hi de la muestra M-2 tumores generados en 2 de 3 ratones a 30.000 células tumorales con un período de latencia de 90-100 días, un período de latencia mayor que la observada en CD44
células hi de la muestra M -1 (Figura 3E). Por lo tanto, aunque CD44
células hi muestran consistentemente potenciales más altos tumorigénicas de CD44
células Lo de la misma muestra, las muestras de tumor individuales pueden mostrar diferentes cinética de crecimiento en la evaluación de las propiedades de CSC en bioensayos de comportamiento.
(a) tumorigenicidad y período de latencia de CD44
células hi (M-1) inyectado con al 30000; 3.000 y 300 células. Los ratones inyectados con CD44
hi (flanco derecho) formaron tumores y células CD44 Lo
No se formó el tumor (flanco izquierdo). Los números (1/3, 2/3 o 3/3) representan el número de animales con tumor /grupo en particular, el punto de medición del tiempo. Periodo de tiempo de días después de la implantación del tumor se expresa a lo largo del eje X y el volumen de crecimiento del tumor se expresa como mm
3 a lo largo del eje Y. tumores primarios parentales Sin Clasificar implantados con 500.000 células /ratones no mostraron ningún crecimiento del tumor incluso después de 3 meses de implantación de células tumorales (datos no mostrados) (B) Los ratones con tumores en el flanco derecho inyectado con CD44
células HI y no tumor se detectó en el flanco izquierdo inyectado con CD44
células lO (C) tumores resecados formados por CD44
hi células en ratones. (D) FACS análisis de las células individuales obtenidas de tumores de ratón derivadas de CD44
hi células de M-1 MPE muestra. Las células tumorales muestran la expresión de los marcadores CD44, cMet, uPAR y CD166. (E)
hi ratones y CD44
Lo células de muestras M-1 y M-2 en ratones NOD /SCID (IL2rγ
NULL) Tumorigenicidad y período de latencia de CD44.
Cabe destacar que el CD44
lo células de cultivo primario o bien lo hicieron
no
forman tumores en los flancos izquierdo de los ratones durante todo el intervalo de monitorización (Fig. 3 B y e). Por otra parte, también hicimos
No
observar la formación de tumores con la inyección de 5 × 10
5
células no clasificadas, a pesar de que esta población presumiblemente contenía ~5-10% (o 25,000- 50,000) CD44
células hi. Esta interesante observación sugiere que CD44
hi células pueden estar expuestos a las influencias inhibidoras hacia el crecimiento del tumor por células que tienen una expresión de CD44 de superficie menor intensidad en la misma población tumoral
.
Para probar si CD44 implantado
hi células contribuyeron a tumores heterogéneos (sugestivos de diferenciación multipotentes), tumores injertados generados a partir de CD44
hI desde se extirparon células M-1, digeridos, y el análisis de marcadores de superficie celular se realizó mediante FACS en suspensiones de células individuales. Las células tumorales se mantuvieron altamente positiva para el marcador CD44, con 98,2% de células con tinción positiva, aunque la CD44-MFI era incluso más alta que las células implantadas originalmente. La heterogeneidad entre las células se evidencia por la expresión variable de otros biomarcadores CSC comúnmente asociados (Figura 3D), [cMet (40,4%), uPAR (47,6%) y CD166 (27,4%)]. Las células que llevan estos marcadores también se detectaron previamente en las primarias MPE muestras biológicas muestras, en fracciones diferentes [5].