Extracto
Antecedentes
La desregulación de los
EGFR
señalización es común en no pequeñas de cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) y este descubrimiento condujo al desarrollo de inhibidores de la tirosina quinasa (TKIs) que son altamente eficaces en un subconjunto de NSCLC. Las mutaciones de
EGFR gratis (m
EGFR
) y número de copia ganancias (GCN) de
EGFR gratis (g
EGFR
) y
HER2
(g
HER2
) han sido reportados para predecir la respuesta de TKI. Las mutaciones en
KRAS gratis (m
KRAS
) están asociadas con resistencia primaria a la ITC.
Los resultados Metodología /Principales
Se investigaron la relación entre las mutaciones, GCN y la respuesta a los ITC en un gran panel de líneas celulares de cáncer. Los genes estudiados fueron
EGFR
,
HER2
,
HER3 HER4
,
KRAS
,
BRAF
y
PIK3CA
. Las mutaciones fueron detectadas por secuenciación, mientras GCN se determinaron mediante PCR cuantitativa (qPCR), hibridación in situ fluorescente (FISH) y la matriz de hibridación genómica comparada (aCGH). Los valores de CI50 para el gefitinib TKIs (Iressa) y erlotinib (Tarceva) se determinaron por el ensayo de MTS. Para cualquiera de los siete genes de la prueba, las mutaciones (39/77, 50,6%), el aumento del número de copias (50/77, 64,9%) o bien (65/77, 84,4%) eran frecuentes en las líneas de NSCLC. Las mutaciones de
EGFR gratis (13%) y
KRAS gratis (24,7%) eran frecuentes, mientras que eran menos frecuentes para los otros genes. Las tres técnicas para la determinación de GNC se correlacionan bien, y se utilizaron los datos de qPCR para otros análisis. GCN fueron relativamente frecuente para
EGFR
y
KRAS Hoteles en adenocarcinomas. Mientras que las mutaciones eran en gran parte mutuamente excluyentes, GCN no lo eran.
EGFR
y
KRAS
líneas mutantes demostraron con frecuencia alelo mutante específica desequilibrio es decir, la forma mutante era por lo general en gran exceso en comparación con la forma de tipo salvaje. Sobre una base molar, la sensibilidad a gefitinib y erlotinib fueron altamente correlacionados. Los análisis multivariados dio lugar a los siguientes resultados:
1. m
EGFR Opiniones y g
EGFR Opiniones y g
HER2
eran factores independientes relacionados con la sensibilidad a gefitinib, en orden decreciente de importancia.
2. m
KRAS
se asoció con un aumento en la resistencia in vitro a gefitinib.
Conclusiones /importancia
Nuestra in vitro los estudios confirman y amplían las observaciones clínicas y demuestran la importancia relativa de ambos
EGFR
mutaciones y GCN y
HER2
GCN en la sensibilidad a la ITC
Visto:. Gandhi J, Zhang J, Xie Y, Soh J, Shigematsu H, Zhang W, et al. (2009) Las alteraciones en los genes de la vía de señalización del EGFR y su relación con la tirosina quinasa EGFR inhibidor de sensibilidad en líneas celulares de cáncer de pulmón. PLoS ONE 4 (2): e4576. doi: 10.1371 /journal.pone.0004576
Editor: Alfred Lewin, Universidad de Florida, Estados Unidos de América
Recibido: 16 Septiembre, 2008; Aceptado: 18 de diciembre de 2008; Publicado: 24 Febrero 2009
Derechos de Autor © 2009 Gandhi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La financiación recibimos del Programa Especializado de Excelencia en la Investigación en cáncer de pulmón (P50CA70907) y la Red de Investigación de Detección temprana, Instituto Nacional del cáncer, Bethesda, Maryland (U01CA084971). Los fondos de ambas becas se utilizaron para el apoyo salario y para la realización de ensayos. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses: Dra. Gazdar es un consultor /profesor pagado por AstraZeneca PLC. El Dr. García recieves Financiación de la Investigación & gt; 10.000 de AstraZeneca, Genentech y OSI; Honorario & lt; 10.000 de Roche. El Dr. Minna recibe apoyo para investigación de AstraZeneca PLC.
Introducción
El cáncer de pulmón es la principal causa de las muertes por cáncer en todo el mundo [1]. A pesar de los recientes avances en el diagnóstico y la multimodalidad terapias para el cáncer de pulmón, el pronóstico sigue siendo pobre, con tasas de supervivencia a 5 años de sólo el 16% de todas las etapas [2].
El cáncer de pulmón se caracteriza por la acumulación de múltiples alteraciones genéticas y epigenéticas incluyendo mutaciones somáticas y ganancias de número de copias de genes o ambos que resulta en la activación de oncogenes o la inactivación de genes supresores de tumores [3]. receptor del factor de crecimiento epidérmico (
EGFR
) desregulación se ha observado en varios tipos de tumores, incluyendo no pequeñas de cáncer de pulmón de células (NSCLC) [4]. Hirsch et. Alabama. identificado frecuentes
EGFR
proteínas sobre la expresión (62%) en NSCLC de subtipos de células escamosas y el adenocarcinoma [5].
EGFR
más de expresión se asocia a menudo con un pronóstico adverso [6]. El receptor tirosina quinasa (RTK) super-familia de receptores de superficie celular sirve como mediadores de la señalización celular por factores de crecimiento extracelulares. Los miembros de la familia erbB de las RTK incluyendo
EGFR (HER1 /ERBB1)
,
HER2 (ErbB2 /EGFR2)
,
HER3 (ERBB3 /EGFR3)
y
HER4 (ERBB4 /EGFR4)
han recibido mucha atención debido a su fuerte asociación con la proliferación maligna.
El RAS /MAPK y las vías /AKT PI3K son importantes las redes de señalización de enlace
EGFR
la activación de la proliferación celular y la supervivencia [7]. Como veremos más adelante,
EGFR
señalización vía de los genes se han notificado a ser mutado en el CPNM. Dependiendo de la ubicación geográfica,
EGFR
y
KRAS
se han identificado mutaciones en ~ 10% -30% de NSCLC [3], [8].
EGFR
mutaciones se asocian de forma independiente con histología de adenocarcinoma, el origen étnico de Asia oriental, no el consumo de tabaco y el sexo femenino. Las mutaciones de
KRAS
también se dirigen a la histología de adenocarcinoma, pero por lo demás se diferencian de
EGFR mutaciones
porque son relativamente raros en los asiáticos orientales y se producen con mayor frecuencia en los hombres y los fumadores [9]. Con menos frecuencia, las mutaciones somáticas también se han encontrado en otro
genes EGFR vía
incluyendo
HER2 gratis (~ 2%) [10],
HER4 gratis (~ 2%) [ ,,,0],11],
BRAF
(~ 2%) [12], y
PIK3CA gratis (~ 4%) [13], [14].
copias de genes ganancias numéricas (GCN) debido a la amplificación focal o polysomy cromosómica, es uno de los otros mecanismos principales de activación de oncogenes [15]. Lockwood et al. identificados varios componentes de la
vía de señalización del EGFR
se amplificó con frecuencia y sobre-expresado en el CPNM. Curiosamente, también encontraron que
EGFR
amplificación de genes vía fue más frecuente en el subtipo de adenocarcinoma de NSCLC.
Debido a la desregulación frecuente de
EGFR
genes de la vía en el CPNM, EGFR se convirtió en una de las primeras moléculas seleccionadas de forma racional para la terapia dirigida. inhibidores de pequeñas mientras que los enfoques dirigidos iniciales utilizaron anticuerpos monoclonales que bloquean la interacción ligando-receptor, los enfoques más recientes han utilizado moléculas reversibles tirosina quinasa (TKIs). Se requiere que la actividad de la tirosina quinasa de
EGFR
para las respuestas bioquímicas inducidas por este receptor [7], [16], [17]. Dos ITC, gefitinib (Iressa, AstraZeneca) y erlotinib (Tarceva, Genentech) han sido ampliamente utilizados en el tratamiento del NSCLC avanzado o recurrente. Las respuestas se observaron en los subgrupos, el origen étnico de Asia Oriental en particular, el género femenino, no el consumo de tabaco y el adenocarcinoma histología [18], [19], [20]. Posteriormente,
EGFR
se identificaron mutaciones en el dominio tirosina quinasa, y predijo una respuesta al TKI en el mismo subgrupo de pacientes [21], [22], [23]. De acuerdo con un meta-análisis de 1170 pacientes, más del 70% de NSCLC con
EGFR mutaciones
respondió a los ITC, mientras que el 10% de los tumores sin
EGFR
respondió mutación [24]. Sin embargo, otros estudios indican que factores distintos a
EGFR
mutaciones pueden desempeñar un papel en la determinación de la respuesta y la supervivencia después de la terapia de TKI.
EGFR
aumento de número de copias de genes se asoció con una mejora significativamente la sensibilidad de TKI y la supervivencia en un gran estudio no seleccionado con controles apropiados [25]. Además, otros miembros de la
EGFR
familia es decir,
HER2
[26] y
EGFR3
[27] pueden ser factores importantes que intervienen en la sensibilidad de TKI. Una complejidad adicional es la observación clínica de que las mutaciones somáticas de
KRAS
confieren resistencia intrínseca a los ITC [28].
Para comprender mejor la relación entre la sensibilidad y la desregulación de TKI
EGFR
genes de la vía, se analizó la mutación y copian el estado número de siete de estos genes (
EGFR
,
HER2
,
HER3
,
HER4
,
KRAS
,
BRAF
, y
PIK3CA
) en un gran panel de líneas celulares de cáncer de pulmón y se correlacionó con los datos de la sensibilidad in vitro a la ITC.
Materiales y Métodos
líneas de células tumorales
Se estudiaron un total de 112 líneas celulares que constan de 77 y 32 CPNM cáncer de pulmón de células pequeñas (SCLC) y tres líneas de cánceres de células pequeñas en sitios pulmonares (pequeños cánceres de células extrapulmonares, ExPuSC) [29]. Todos excepto tres de estas líneas celulares fueron establecidos por los autores [30] en uno de dos lugares. Las líneas celulares iniciadas en el NCI tiene el prefijo NCI-H mientras que las líneas establecidas en UT Southwestern tienen el prefijo de HCC. NCI-H3255 se obtuvo del Dr. Bruce Johnson (Centro de Oncología Torácica Lowe, Instituto de Cáncer Dana-Farber, en Boston, MA) [22]. Se obtuvo PC-9 (originalmente de la Universidad Médica de Tokio, Tokio, Japón) del Dr. Bert Vogelstein (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD). Calu-3 se adquirió de American Type Culture Center (Manassas, VA). También se investigó ocho líneas inmortalizadas de células epiteliales bronquiales humanas (HBECs, HBEC1KT, HBEC3KT, HBEC4KT, HBEC5KT, HBEC17KT, HBEC30KT, HBEC31KT y HBEC34KT), que se iniciaron por nosotros [31].
La mayoría de las células tumorales líneas se mantuvieron en RPMI1640 suplementado con suero de 5 a 10% de bovino fetal (FBS). Unas pocas líneas celulares se cultivaron en ACL4 (para líneas de NSCLC) y Hites (para las líneas SCLC) suplementado con 5% de FBS. Todas las líneas celulares se mantuvieron en HBEC de queratinocitos-SFM (Invitrogen, Carlsbad, CA) con extracto de pituitaria bovina (BPE) y el factor epidérmico recombinante del crecimiento (EGF) [31]. Todas las líneas celulares se incubaron a 37 ° C en una atmósfera húmeda con 5% de CO
2.
Se obtuvo la huella genética de cada línea celular (Powerplex 1.2 Sistema, Promega, Madison, WI) y cada línea celular tenía un perfil genético único que era idéntico a los perfiles obtenidos a partir de la American Type Culture Collection.
ADN y ARN extracción
ADN genómico se obtiene a partir de gránulos de la línea celular de fenol-cloroformo estándar (01:01) extracción seguido de precipitación con etanol [32] o utilizando DNeasy Tissue Kit (QIAGEN, Valencia, CA). El ARN total se obtuvo a partir de líneas celulares utilizando RNeasy Mini Kit Plus (QIAGEN). El ADNc se preparó como se describe anteriormente [14].
Gene Secuenciación
secuenciación de ADN y análisis mutacional de
EGFR gratis (exones 18-21),
HER2
(exones 19 y 20),
KRAS
(codones 12, 13 y 61),
BRAF
(exones 11 y 15) y
PIK3CA gratis (los exones 9 y 20) se realizaron como se informó por nosotros previamente [10], [14], [32].
HER3
(exones 18-21) y
HER4 gratis (exons18-23) estado de la mutación se analizaron mediante amplificación por PCR de ADN genómico o ADNc y secuenciación directa de los productos de PCR [10]. Las mutaciones en estos genes se determinaron utilizando los cebadores de PCR como se indica (Tabla S6). Todos los PCRs se realizaron en volúmenes de 25 l que contenía 100 ng de ADN utilizando ADN polimerasa HotStarTaq (Qiagen Inc., Valencia, CA). ADN se amplificó durante 32 a 34 ciclos a 95 ° C durante 30 segundos, 62 ° C a 68 ° C durante 30 segundos, y 72 ° C durante 30 segundos, seguido por extensión de 7 minutos a 72 ° C. Todos los productos de PCR se incubaron con exonucleasa I y fosfatasa alcalina de camarón (Amersham Biosciences Co., Piscataway, NJ) y se secuenciaron directamente usando Applied Biosystems PRISM Dye Terminator método de secuenciación de ciclo (Perkin-Elmer Co., Foster City, CA). Todas las mutaciones fueron confirmadas por secuenciación independiente en ambas direcciones.
copia de evaluación número
Copiar ganancias número puede ser evaluada por una serie de metodologías. Para las muestras clínicas, hibridación in situ fluorescente (FISH) se utiliza con frecuencia ya que puede discriminar entre las células no malignas del tumor y. Los estudios de laboratorio de líneas de células tumorales (que están libres de las células no malignas) a menudo utilizan PCR cuantitativa (qPCR). Un método alternativo es la gama de hibridación genómica comparada (aCGH). Debido a que rara vez se han reportado las comparaciones directas de estos métodos [33], hemos utilizado los tres métodos.
En tiempo real qPCR
número de copias de genes se determinaron mediante PCR en tiempo real cuantitativa empleando el Chromo4 Sistema de PCR (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Para determinar el número de copias de un gen diana, se utilizó genes de control situados en el mismo cromosoma que el gen diana (Tabla S6). Las proporciones resultantes se compararon con proporciones similares de células diploides (los valores medios de las ocho líneas de células HBEC. Se utilizó la metodología TaqMan excepto
PIK3CA
[14]. Los cebadores y sondas fueron elegidos por TaqMan Primer Express ™ 1.5 (Applied Biosystem, Foster City, CA). Los cebadores se compraron de Invitrogen y sondas de Biosearch Technologies (Novato, CA). Las secuencias de cebadores y sondas se muestran en la Tabla S6. Las curvas de calibración se construyeron con diluciones en serie de productos de PCR específicos. mezclas de amplificación (25 l) contenían la muestra de ADN (20 ng), 10 × tampón TaqMan (2,5 l), 200 mM dNTP, 1,25 ADN T Hotstar Taq ™ polimerasa, 200 nM de cada cebador y 100 nM sonda. las condiciones de ciclos térmicos que comprenden 5 min a 95 ° C y 40 ciclos a 95 ° C durante 15 s y 60 ° C durante 30 s. Todas las muestras se analizaron por triplicado. el parámetro C
t se define como el número de ciclo fraccional al que la fluorescencia generada por la escisión de la sonda pasa por encima de un umbral fijo de referencia. El número de copias del gen diana en las muestras desconocidas se cuantifica midiendo C
valores de t y mediante el uso de una curva estándar para determinar el número de copias [34]. el número de copias de genes se calculó usando la siguiente ecuación: g = (S
T /S
C) /(N
N /T
C).
PIK3CA
número de copias se evaluó como se describe anteriormente por nosotros [14].
camino de baldosas aCGH
aCGH se realizó tal como se describe anteriormente [14], [15]. desequilibrios genómicos se identificaron utilizando aCGH-Smooth [35] tal como se describe anteriormente [36].
ensayos FISH
ensayos FISH de doble color fueron realizados de acuerdo con un protocolo estándar [37], [38 ]. Los conjuntos de sonda, EGFR /CEP7 y PathVysion y la CEP7 controles fueron obtenidos de Abbott Molecular (Des Plaines, Illinois), HER3 /CEP12 se obtuvo de Qbiogene; BRAF sonda se generó a partir del clon clon bacteriano artificial (BAC) que se utiliza para aCGH. El número de copias de los genes diana (etiquetadas en fluoróforos rojos) y las sondas del CPA (etiquetadas en Spectrum Verde) se verificaron en por lo menos 100 células en interfase y 20 metafase para untar. Las imágenes fueron capturadas y se fusionaron utilizando la estación de trabajo CytoVision (Applied Imaging, San Jose, CA).
-clonación Sub
ADN genómico se aisló de mutante
EGFR
o
KRAS
líneas celulares de cáncer y se utiliza como una plantilla para la amplificación por PCR de
EGFR
o
KRAS
. Los cebadores y las condiciones de las reacciones de PCR fueron como se describe anteriormente. Los productos de PCR fueron clonados en vector pCR2.1-TOPO usando el kit de clonación TOPO TA (Invitrogen). Se seleccionaron alrededor de 20 clones (range15-25) para la secuenciación usando el cebador directo M13 o correspondientes
EGFR
o
KRAS
cebadores. Los resultados se expresan como el porcentaje de alelos mutantes presentes en el número total clonado.
TKI sensibilidad
El ensayo colorimétrico MTS (Promega) se realizó según las instrucciones del fabricante. Este ensayo se basa en la conversión de MTS en formazán soluble por las enzimas deshidrogenasa endógenos que se encuentran en las células metabólicamente activas. Las células se sembraron a 1 x 10
3-4 × 10
3 células /pocillo en cultivo de tejidos tratados placas de 96 pocillos. Al día siguiente, TKI (erlotinib o gefitinib) se añadió a cada placa en una serie de diluciones a través de la placa de tal manera que ocho concentraciones diferentes del fármaco fueron probados. El día 5, se añadieron 20 l de MTS, seguido de una incubación de 1 hora a 37 ° C y luego se leyó la absorbancia a 490 nm en un lector de placas.
96 pocillos de la placa de datos se importaron en una Base de datos interna de la droga de sensibilidad in vitro Los ensayos (DIVISA por Luc Girard, manuscrito en preparación), donde se calculan los IC50, así como diversos análisis estadísticos. Para calcular los valores de IC50, los datos fueron fondo-resta (columnas 1 y 12 normalmente contenían material sin células o drogas y sirvieron como valores de fondo), y ajustaron al modelo RDC (R paquete 'DRC' de Christian Ritz y Jens Streibig, http://www.bioassay.dk) para generar una curva sigmoidal de la cual se determinó la concentración que inhibe el 50% de las células (IC50).
análisis estadísticos
de Fisher de dos colas pruebas exactas se determinaron utilizando el software Prisma 4 (GraphPad, San Diego, CA). los valores & lt; P 0,05 se consideraron significativos. Otros análisis estadísticos se discuten en las categorías apropiadas en la sección Resultados.
Resultados
Las mutaciones (m) y GCN (g) en líneas celulares de cáncer de pulmón
Se examinaron 32 SCLC y tres líneas de cánceres de células pequeñas de sitios extrapulmonares (cánceres de células pequeñas extrapulmonares, ExPuSC), para las mutaciones somáticas y GCN de
EGFR
genes de la ruta. Encontramos un total de sólo tres mutaciones en 35 líneas celulares y las tres eran
PIK3CA
mutaciones (Tabla S1). GCN para
EGFR
genes de la ruta se encuentra con poca frecuencia en SCLC (Tabla S2). Dado que las mutaciones somáticas y GCN para
EGFR
genes de la ruta eran raros en el CPCP, limitamos nuestras más estudios para NSCLC.
Para cualquiera de los siete genes de la prueba, las mutaciones (39/77, 50,6% ), las ganancias de número de copia (50/77, 64,9%) o bien (65/77, 84,4%) eran frecuentes en las líneas de NSCLC. Estos resultados se discuten en mayor detalle más adelante.
Las mutaciones (m) de
genes EGFR
vía en NSCLC
Hemos examinado las líneas de NSCLC, por mutaciones somáticas de
EGFR genes
vía de las enumeradas en la sección Métodos. Encontramos un total de 40 mutaciones en líneas celulares de 39 (50,6%) (figura 1a, Tabla S3). Estas mutaciones, de 19
KRAS gratis (24,7%), 10
EGFR gratis (13%), cinco
BRAF gratis (6,5%), cuatro
PIK3CA
(5,2%), un
HER2 gratis (1,3%), un
HER4 gratis (2,2%) y ninguno de
HER3
. m
EGFR
, m
BRAF Opiniones y m
HER2
estaban presentes exclusivamente en los adenocarcinomas, mientras que m
KRAS
fueron más frecuentes en el adenocarcinoma y grandes histología de células. m
PIK3CA
fueron las únicas mutaciones que no se dirigen a la histología de adenocarcinoma (Fig. 1c).
La figura 1a. muestra la frecuencia de mutaciones y copiar ganancias número de
genes EGFR
vía (
EGFR
,
KRAS
,
BRAF
,
PIK3CA
,
HER2
,
HER3
y
HER4
). Cuarenta mutaciones se identificaron en 39 líneas celulares. Las mutaciones y de la copia número ganancias fueron más frecuentes para
EGFR gratis (13%, 40,3%) y
KRAS gratis (24,7%, 14,3%) que de otro gen. GCN para
HER2 gratis (18,2%) eran también comunes. Se identificó sólo un
HER2
y uno
HER4
mutación somática. Los números por encima de las columnas indican el número de líneas celulares con mutaciones (columnas azules) o ganancias de número de copias (columnas rojas). 1b Fig. La cifra representa el número de genes que demuestran GCN en líneas de células mutantes y de tipo salvaje. De las 77 líneas de células examinadas, 39 (50,6%) tenía una mutación en al menos uno de los siete los genes de la vía EGFR examinados. GCN eran frecuentes en ambas líneas celulares de tipo mutante y salvaje. 1c Fig. muestra la frecuencia de las mutaciones sobre la base de subtipo NSCLC. Las mutaciones de
EGFR
y
BRAF
se encuentran exclusivamente en el subtipo adenocarcinoma. El único
HER2
mutación estaba en un adenocarcinoma en comparación con el
HER4
mutación somática que se identificó en un ca. células escamosas 1d Fig. muestra la frecuencia de las ganancias de número de copias (GCN) (G & gt; 4 por qPCR) sobre la base de subtipo NSCLC. GCN para
BRAF
y
PIK3CA
se observa sobre todo en el adenocarcinoma y el carcinoma de células escamosas, respectivamente. GCN para el resto de los genes no estaba a favor de ninguno de los subtipos.
Las mutaciones son mutuamente excluyentes
Hemos examinado por cualquier asociación entre las mutaciones somáticas en líneas de células individuales. Con el fin de probar la hipótesis de que
mutaciones del gen EGFR
vía son mutuamente excluyentes, hemos utilizado simulaciones de Monte Carlo para calcular el valor de p empírico. La hipótesis nula es que las mutaciones se producen de forma independiente. Hemos simulado la distribución conjunta de eventos de mutación entre estos siete genes utilizando las tasas de mutación marginales observados y la asunción independiente. En cada simulación, hemos observado que el número de líneas celulares con múltiples mutaciones. Repetimos el simulaciones 10.000 veces y se obtuvo la distribución empírica de que el número de líneas celulares con mutaciones múltiples; Por último, comparamos el número observado de líneas celulares con múltiples mutaciones con esta distribución empírica para calcular el valor de p
En este estudio, el valor p de un solo lado es 0,0014.; Por lo tanto, rechazamos la hipótesis nula y concluimos que las mutaciones genéticas son eventos mutuamente exclusivos para estos genes en líneas celulares de cáncer, con una excepción (Tabla 1). Gran línea de carcinoma de células NCI-H460 tenía tanto
KRAS
y
PIK3CA mutaciones
.
Comparación de los métodos para determinar el número de copias ganancias
aCGH , FISH y PCR cuantitativa se utilizaron para probar el número de copias de genes de las líneas celulares de cáncer. No hay un valor umbral biológica clara para definir el número de copias anormales de líneas celulares de NSCLC humano; se seleccionaron los valores de umbral que permitan obtener el mejor acuerdo categoría positiva o negativa entre las tres pruebas. En concreto, se calculó la estadística Kappa [39] entre las pruebas aCGH y qPCR más de dos rejillas de corte dimensionales como 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5 y 5; y luego hizo lo mismo con FISH y PCR cuantitativa. Los valores de corte que lograron el mejor acuerdo entre los tres ensayos fueron como sigue: 4 para qPCR, 3 para CGH y 4.5 para los peces; y usamos estos valores para definir la presencia de las ganancias de número de copias en líneas celulares de NSCLC. Usando estos valores de cierre de operaciones y todos los datos disponibles, no hubo concordancia altamente significativa (p & lt; 0,001) entre los tres métodos, como se muestra en la Tabla 2.
gen EGFR
vía GCN
a medida que los datos qPCR se completa para todas las líneas (mientras subconjuntos fueron probados por los otros dos métodos que son más laborioso y costoso), que utiliza datos de qPCR para todos los nuevos análisis. Copiar ganancias numéricas fueron frecuentes (& gt; 10%) para
EGFR
,
HER2
,
HER3
y
KRAS gratis (figura 1a, Tabla S4) . En particular, las ganancias de
EGFR
eran más de dos veces más frecuente (40%) que para cualquier otro gen. En general, con las excepciones de g
BRAF gratis (limitado a la histología de adenocarcinoma), y g
PIK3CA gratis (limitado en gran parte a la histología de células escamosas), GCN no mostró ningún sesgo subtipo histológico aparente ( Fig. 1c).
la relación entre las mutaciones y el número de copias ganancias
a diferencia de las mutaciones, las ganancias de copia de números no eran mutuamente excluyentes, ya sea con otros GCN o con mutaciones (Fig. 2). Encontramos GCN para dos o más genes en 32,5% (25/77) de las líneas celulares (Tabla S4). Sin embargo, hemos observado una asociación altamente significativa entre las mutaciones de
EGFR
o
KRAS Opiniones y GCN de sus respectivos genes (Figura 3a, 3b).
La figura 2a. espectáculos que copian las ganancias y las mutaciones de números no son mutuamente excluyentes. Como se desprende de la figura GCN para
EGFR
y
KRAS ¿Cuáles son significativamente más frecuentes en
EGFR
y
KRAS
líneas celulares mutantes respectivamente (p & lt; 0,05 ). Sólo había un
HER2
y
HER4
de línea y celulares de cáncer mutante por lo que no se incluyeron en esta figura. 2b Fig. espectáculos que copian las ganancias numéricas no son mutuamente excluyentes y las ganancias de un gen pueden ocurrir en presencia de las ganancias de otros genes.
EGFR
y
KRAS
genes preferentemente tener ganancias número de copias (GNC) en líneas celulares que albergan las respectivas mutaciones (paneles a y B). En líneas mutantes, el alelo mutante casi siempre está en exceso en comparación con el alelo de tipo salvaje (paneles C y D), un fenómeno que hemos denominado MASI. En la mayoría de los casos MASI el alelo mutante demuestra GCN; sin embargo MASI también puede estar presente en las líneas celulares que tienen un número diploide copia del oncogén, (adquirida disomía uniparental) ya sea uniforme (NCI-H460) o heterogéneo (NCI-H1975).
alelo mutante específica desequilibrio (MASI) para
EGFR
y
KRAS
genes
Como se señaló anteriormente GCN de
EGFR
y
KRAS
fueron más frecuentes en líneas celulares que albergan estas mutaciones. Empleando el método sub-clonación se ha descrito anteriormente, se investigó si el
EGFR
y
KRAS
genes demostró preferentemente GCN específicos de alelos mutantes en las líneas celulares que albergan las mutaciones respectivas (Fig. 3). Los datos, para probar si los alelos mutantes se amplifican en líneas celulares mutantes de genes se agrupan los datos con el resultado binario. Cada línea celular es un clúster y la hipótesis nula es que la tasa de mutación es de 0,5. Debido a que el número de subclones de cada línea celular varió, se utilizó el método de análisis para el resultado binario agrupado con varios tamaños de grupo [40]. En líneas mutantes, el alelo mutante era casi siempre en exceso en comparación con el alelo de tipo salvaje, un fenómeno que hemos denominado MASI. El valor de p
EGFR
líneas celulares mutantes fue 0,019 y para
KRAS
línea celular mutante fue 0,0003 que indica que los alelos mutantes eran preferentemente dominante en ambos casos. La mayoría de los casos MASI se debieron al aumento de número de copias del alelo mutante. Sin embargo, en una minoría de casos MASI también se observó en células que tienen números de copias diploides diploides o cerca adquirida (disomía uniparental). Por lo tanto hemos utilizado el término MASI en comparación con las ganancias de mutantes específicos de alelo.
Características de los
EGFR
líneas celulares mutantes
Los datos clínico-patológicos y moleculares de la célula 10 CPNM líneas que albergan
EGFR
mutaciones se resumen en la Tabla 3. Todos contenía una de las dos mutaciones importantes en el dominio quinasa, ya sea deleciones del exón 19 (n = 7) o mutación L858R en el exón 21 (n = 3 ). Las mutaciones se observaron exclusivamente en el adenocarcinoma y nunca fumadores o pacientes con baja exposición al tabaco (≤ 10 paquetes al año). Una
EGFR
línea celular mutante fue desarrollado en Japón y los nueve restantes se desarrollaron en América del Norte. De los nueve desarrollado en América del Norte, sólo uno era de un individuo de origen asiático. Además, se identificó que
EGFR
mutaciones fueron más comunes en un número relativamente pequeño grupo de edad (& lt; 55 años).
Siete de estas líneas celulares eran sensibles a gefitinib. Las tres líneas resistentes tuvieron una segunda mutación: o la mutación de resistencia asociada T790M en el exón 20 (n = 2) o una deleción homocigótica de los
PTEN
de genes y la ausencia de su proteína [41] (observaciones no publicadas de autor ).
Efectos de las mutaciones y copiar ganancias numéricas en la sensibilidad a la ITC
para evaluar el efecto de las mutaciones y copiar ganancias numéricas en la sensibilidad a la ITC, se analizaron los valores de IC50 de 45 líneas celulares de cáncer . Debido TKI sensibilidad clínica se dirige preferentemente histología de adenocarcinoma, se incluyeron 31 adenocarcinomas. Todo el subconjunto incluye todos los
EGFR
,
HER2
y
HER4
líneas de células mutantes y 12
KRAS Opiniones y 3
BRAF
líneas celulares. Debido a
PIK3CA
mutaciones favorecido la histología de adenocarcinoma no sólo un
se incluyó PIK3CA
línea celular mutante. De todo el subconjunto 17 líneas eran de tipo salvaje para todos los genes analizados (Tabla S5) guía
Hemos encontrado una excelente concordancia entre los valores de IC50 entre gefitinib y erlotinib. (P & lt; 0,0001) (Figura 4, Tabla S7). Debido a que nuestro conjunto de datos para la sensibilidad a gefitinib fue más extensa que elegimos para utilizar los datos de gefitinib para análisis adicionales
Cuarenta y cinco líneas celulares fueron probados para la sensibilidad de ambos fármacos y la concordancia fue excelente (p & lt; 0,0001)..
La Fig. 5 ilustra los patrones de sensibilidad de las líneas celulares ensayadas. La concentración in vitro de 1 mM utilizados en el cultivo de tejidos se correlaciona con la concentración plasmática de gefitinib en pacientes tratados con la dosis estándar de gefitinib es decir, 250 mg al día. Este umbral se ha usado por los investigadores en el pasado para distinguir sensible partir de líneas celulares sensibles y /o resistentes a [7]. Sobre la base del umbral antes mencionado y la forma de la curva, dividimos nuestras líneas celulares en 3 categorías: sensible (≤1 m), intermedio (& gt; 1 micra pero ≤10 mu M) y resistentes (& gt; 10 micras ) como se ve en la figura Fig. 5. Los valores de IC50 siguen una línea que demostró un punto de cambio de pendiente en aproximadamente 10 micras, y por lo tanto demostró una distribución bimodal, aparentemente (Fig. 5). Como las líneas celulares con valores por debajo de 1 M fueron considerados como sensibles, que los valores arbitrariamente categorizaron entre 1 y 10 micras como intermedio en la sensibilidad.
Fig 5. muestra una curva de log de los valores de IC50 para gefitinib 45 de células NSCLC líneas. Se clasifican en tres categorías sobre la base de IC50 gefitinib: sensible (IC50 & lt; 1 mM), intermedio (IC50 & gt; 1 pero & lt; 10 mM) y resistente (IC50 & gt; 10 M). De las nueve líneas celulares sensibles, siete de ellos albergan
EGFR
mutaciones, uno tiene GCN para
EGFR
y uno tiene GNC para
HER2
. De los
EGFR
líneas celulares mutantes restantes, dos tenían la mutación T790M (uno intermedio y uno resistente) y uno tenía una deleción homocigótica del
PTEN gratis (resistente).
KRAS
líneas de células mutantes y de tipo salvaje eran resistentes a gefitinib.
Hubo nueve líneas celulares en el grupo sensible y que incluyen siete de los diez m
EGFR
líneas, una g
EGFR
línea celular y uno g
HER2
línea celular. La categoría intermedia consistió en dos líneas de células únicas; un m
EGFR
línea celular que tiene una mutación T790M secundario y un g
HER2
línea celular. La categoría de línea celular resistente fue la más grande e incluyó dos m
EGFR
líneas celulares, uno que tiene la mutación T790M secundaria y el otro tiene una deleción homocigótica del
PTEN
gen. Las líneas resistentes que quedan incluidas todas las líneas de tipo salvaje y todas las líneas que tienen
KRAS
,
BRAF
,
HER2
,
HER4
y
PIK3CA mutaciones
.
el uso de pruebas univariadas, se analizó la asociación entre la sensibilidad a gefitinib y el estado mutacional o GCN de las diversas
genes EGFR
de la vía y se encontró una correlación significativa entre la sensibilidad a gefitinib con
EGFR
mutación (p = 0,002) y
EGFR
copiar ganancias de número (p = 0,001). Hemos probado la hipótesis de que las mutaciones KRAS confieren resistencia intrínseca a los ITC.