Extracto
El papel de los microbios se ha sospechado en el cáncer de próstata, pero difícil de confirmar en pacientes humanos. Mostramos aquí que una infección bacteriana gastrointestinal (GI) es suficiente para mejorar la neoplasia intraepitelial prostática (PIN) y carcinoma microinvasive en un modelo de ratón. Encontramos que los animales con una predilección genética para la desregulación de
señalización de Wnt,
Apc
Min /+
ratones mutantes, fueron significativamente más susceptibles al cáncer de próstata en una inflamación de manera dependiente tras la infección por
Helicobacter hepaticus
. Además, la neoplasia temprana observó en infectada
Apc
Min /+
ratones era transmisible a los ratones no infectados mediante inyección intraperitoneal de los ganglios linfáticos mesentéricos (MLN) a partir de células solas
H. Hepaticus
ratones mutantes infectados. La transmisibilidad de la neoplasia se puede prevenir mediante la neutralización antes de la inflamación usando el anticuerpo anti-TNF-α en ratones donantes MLN infectados. Tomados en conjunto, estos datos confirman que la inflamación sistémica provocada por bacterias del tracto gastrointestinal desempeña un papel fundamental en la tumorigénesis de la glándula prostática
Visto:. Poutahidis T, capilla de los K, Levkovich T, Lee CW, Doulberis M, Z Ge , et al. (2013) Patógenos bacterias intestinales mejorar el desarrollo del cáncer de próstata a través de la activación sistémica de las células inmunitarias en ratones. PLoS ONE 8 (8): e73933. doi: 10.1371 /journal.pone.0073933
Editor: Deyu Fang, de la Universidad de Northwestern Feinberg School of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 15 Abril, 2013; Aceptado: July 24, 2013; Publicado: 26 Agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Poutahidis et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por RO1CA108854 (VER) y un premio CEHS proyecto piloto P30-ES002109 (SEE). CEHS (Centro de Ciencias de Salud Ambiental) es un centro de concesión otorgado al MIT por el NIH-NIEHS (Instituto Nacional de Ciencias de Salud Ambiental). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Sólo una pequeña proporción de displásicas y lesiones neoplásicas tempranas que surgen en los epitelios por todo el cuerpo en realidad avanzar en cáncer [1-3]. El cáncer aparece cuando las células con potencial maligno lograr todos los estímulos necesarios para su evolución genética y epigenética en malignidad [4]. Ahora está bien documentado que para muchos tipos de cáncer es un importante contribuyente células y factores del sistema inmune [4-6]. En la glándula de la próstata, varias líneas de evidencia sugieren que la inflamación crónica conduce el proceso de cáncer de próstata [5,7,8], pero su fuente sigue siendo difícil de alcanzar. Los agentes infecciosos, la lesión de células epiteliales químico o físico, desequilibrios hormonales y factores dietéticos han sido propuestas como las causas más probables de la inflamación crónica de la próstata [8-10].
La determinación de si la malignidad de próstata puede ser prevenible mediante la focalización inflamación subyacente tiene una importancia especial, ya que es una causa principal de discapacidad relacionada con el cáncer y la muerte entre los hombres. En el tracto gastrointestinal (GI), las infecciones con microbios patógenos, tales como con
Helicobacter pylori
, conducen a la inflamación crónica (gastritis) y el cáncer (adenocarcinoma gástrico) en humanos y en modelos de ratón [4]. Del mismo modo, en modelos de ratones inmunodeficientes la parte baja de la bacteria intestinal
Helicobacter Hepaticus gratis (
H. Hepaticus
) desencadena la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) y carcinoma colorrectal (CCR) [11-13] relacionados. En la glándula de la próstata, sin embargo, existen pocos modelos animales para probar posibles funciones directas o indirectas, incluso de microbios patógenos en tumores malignos de próstata [8,10,14].
En los humanos, el gen de la poliposis adenomatosa coli (APC) es un gen supresor de tumor crítico que impide malignidad de próstata y otros tejidos [15]. Aquí, nosotros usamos ratones mutantes que carecen de una copia de la
Apc
gen (
Apc
Min /+
ratones) y exhibición desregulación de la β-catenina y la vía de señalización Wnt y son de otra manera utilizado ampliamente como un modelo de adenomas intestinales [16].
Apc
Min /+
ratones desarrollan espontáneamente neoplasia intraepitelial prostática (PIN) y el carcinoma microinvasor (CA microinvasor) al aumentar la edad, imitando las etapas iniciales del cáncer de próstata se observan en los seres humanos en en la quinta o sexta década de la vida [15,17]. Se demuestra que la administración orogástrica con
H. Hepaticus
, un no-colitigenic para este modelo de ratón colonizador intestinal bacteriana [17], aumenta significativamente el cáncer de próstata. Es importante destacar que el desarrollo de cáncer de próstata era transmisible a los animales no infectados únicamente por transferencia de células de nódulos linfáticos mesentéricos de
H. Hepaticus
infectado con
Apc
ratones Min /+
donantes.
Resultados
infección orogástrica con
Helicobacter Hepaticus
aumenta el riesgo de carcinoma de próstata en varones
Apc
Min /+ ratones
Para determinar el impacto de la infección intestinal, utilizamos
Apc
Min /+
ratones que estaban libres de cáncer (ratones jóvenes a la edad de 12 semanas no tenía carcinoma de próstata o pólipos intestinales) [17]. Los ratones recibieron una dosis oral
H. Hepaticus
o simulada se sometieron a la dosificación con los medios de comunicación a las seis semanas de edad. A las 12 semanas de edad,
Apc
/+ ratones Min
infectados con
H. hepaticus
muestra características de carcinoma de próstata consistentes con los observados en los varones humanos (Figura 1A, 1B; Tabla S1).
H. Hepaticus
infectado con
Apc
/+ ratones Min
exhiben una mayor PIN (p & lt; 0,01); control no infectadas en comparación con el tratamiento simulado-dosificado igualada y microadenoCA (0,01 p & lt)
Apc
Min /+
ratones (Figura 1C y S1). Ni
H. Hepaticus
infectado con ni sin infectar de 12 semanas de edad
en peso
ratones mostraron patología prostática significativa. En conjunto, estos resultados demuestran que la infección del tracto GI con
H. Hepaticus
rápidamente aumenta la carcinogénesis de próstata en ratones genéticamente susceptibles.
A) A la edad de 12 semanas,
Apc
/+
ratones Min desarrollan de forma espontánea neoplasia de próstata focales bajo y alto grado intraepitelial (LGPIN, punta de flecha blanca; PIN de alto grado, negro cabeza de flecha), pero el carcinoma microinvasor única rara (a). Edad coincidente
Apc
Min /+ ratones con
H
.
Hepaticus
, desarrollar significativamente más lesiones PIN y microinvasiveCA (asterisco) que se caracteriza por la próstata altamente atípica glándula células epiteliales que se rompen a través de la lámina basal y de infiltrarse en el estroma adyacente (b). Cuando las células del nódulo linfático mesentérico de
H
.
Hepaticus
infectado con
Apc
Min /+ ratones
son transferidos a la cavidad peritoneal de
H
.
Hepaticus
exento de
Apc
Min /+ ratones
los ratones receptores desarrollan lesiones preneoplásicas y neoplásicas tempranas (microinvasiveCA-asterisco) comparables a los encontrados en ratones donantes (do). TNF-α ozono de
H
.
Hepaticus
infectado con
Apc
/+ ratones Min
trae ocurrencia lesiones neoplásicas de próstata (LGPIN, blanco cabeza de flecha) al nivel de
H
.
Hepaticus
-free ratones (d). Hematoxilina y eosina. Bares = 50 micras. B) aberrante β-catenina y laminina patrón de lesiones en microinvasiveCA inmunotinción en el cáncer de próstata. DLP de
WT H
.
hepaticus-
ratones positivo (A y C),
H
.
Hepaticus
infectado con
Apc
Min /+
ratón (b) y
H
.
Hepaticus
exento de
Apc
Min /+
ratón transferido con células de nódulos linfáticos mesentéricos de
H
.
Hepaticus
infectado con
Apc
Min /+
donante (d). glándulas DLP normal tuvo un patrón de tinción de la membrana de las células epiteliales normales lateral β-catenina (a) y una lámina basal intacta (c). En contraste, las lesiones microinvasiveCA se caracterizaron por la estabilización citoplasmática y nuclear (puntas de flecha) de β-catenina (b) y en ausencia de laminina (asterisco) sugestivo de degradación de la membrana basal en maligno focos de células epiteliales de la invasión incipiente. contratinción de hematoxilina, cromógeno DAB. Bares = 25 micras. C) Gráfico de barras que muestra la frecuencia de códigos PIN y microinvasiveCA en los grupos de tratamiento. La aparición de cáncer de próstata más significativamente elevados se denota con asterisco. barras de error estándar corresponden a las comparaciones estadísticas microinvasiveCA. D) DLP de
H
.
Hepaticus
exento de
Apc
Min /+
ratón con células MLN transferido desde un
H
.
Hepaticus
infectado con
Apc
Min /+
donante, PIN de alto grado. La mayoría de las células precursoras mieloides con núcleos en forma de anillo que residen en el estroma tienen el fenotipo linaje granulocítico típica (negro punta de flecha) mientras que menos parecen ser mielo /monocítica en el tipo (blanco punta de flecha). Bar = 16 micras.
Las elevaciones de citoquinas inflamatorias ocurrir sin enfermedad inflamatoria manifiesta en
H. Hepaticus
infectado con
Apc
/+ ratones Min
A continuación se probó si
H. hepaticus
infección conduce a un aumento de las respuestas inflamatorias, como se muestra anteriormente [13]. Hemos encontrado que
H. Hepaticus
infectado con
Apc
Min /+
ratones exhiben una mayor citoquinas pro-inflamatorias sistémicas, incluyendo el factor de necrosis tumoral (TNF) -α (p = 0,013), IL- 1α (p = 0,024), IL-3 (p = 0,0009) y eotaxina (p = 0,003) (Figura 2A izquierda). Curiosamente, las próstatas de
H Hepaticus
infectado con
Apc
/+ ratones Min
carecían de enfermedad inflamatoria abierta, pero de vez en cuando exhibieron los mastocitos, neutrófilos, y también precursores mieloides las células que llevan los núcleos en forma de anillo [18] (Figura 1D).
a) Los niveles séricos de citocinas pro-inflamatorias se incrementaron en
Apc
Min /+
ratones después de
H
.
Hepaticus
infección. Eotaxina, IL-3, TNF-α e IL-1α fueron significativamente elevados en comparación con los no infectados
Apc
Min /+
controles emparejados por edad. Cuando se compara con
H
.
Hepaticus
infectados
en peso
ratones, infectados
Apc
/+ ratones Min
tenían significativamente más altos de IL-17, IL-1α, IL -3, eotaxina y la concentración de IL-9 en su suero sanguíneo. Bio-Plex de citoquinas ensayo utilizó suero de
n
= 5 ratones por grupo. *** P & lt; 0,001; * P & lt; 0,05. B) paracorticales áreas en los ganglios linfáticos mesentéricos.
H
.
Hepaticus
infectados
Apc
Min /+
ratones con alto riesgo de cáncer de próstata tenían grandes cantidades de citoplasmática y extracelular de IL-17 que disminuyó significativamente después del agotamiento de TNF-α. inmunohistoquímica IL-17 específica; contratinción de hematoxilina, cromógeno DAB. Bares = 25 micras. C) La evaluación morfométrica de la IL-17 en las secciones con tinción inmunohistoquímica de los ganglios linfáticos mesentéricos. Tanto
Apc
/+
estado genético Min y la infección intestinal por
H
.
hepaticus
se correlacionan significativamente con un aumento mediada por TNF-α de IL-17 expresión en los ganglios linfáticos mesentéricos. *** P & lt; 0,001; ** P & lt; 0,01; * P & lt;. 0,05
La neutralización de inhibe la inflamación
H. Hepaticus
carcinoma de próstata inducida en hombres
Apc
Min /+
se encontró ratones
Pro-inflamatoria de citoquinas TNF-α a ser elevados (p = 0,013) en el suero después de
H. Hepaticus
infección durante seis semanas en el macho de tres meses de edad,
Apc
Min /+
ratones (Figura 2A). TNF-α es en el vértice de una cascada de eventos pro-inflamatorias cancerígenos [5]. Para probar si se requiere la inflamación de la patología de la próstata disparado por las bacterias del tracto GI, se realizó la neutralización sistémica de TNF-α mediante inyección intraperitoneal de un anticuerpo anti-TNF-α por la duración de 3 semanas a partir de las 3 semanas después de la infección (PI). Se encontró que el tratamiento anti-TNF-α llevó a significativamente menor (p & lt; 0,01) la patología de próstata en
H. Hepaticus
infectado con
Apc
Min /+
ratones (Figura 1A, 1C y S1; Tabla S1). Tomados en conjunto con los datos anteriores, esto indicaba que
H. Hepaticus
-Accionados reciban a las respuestas inflamatorias mejorados efectos neoplásicos en el tejido prostático.
Las citoquinas inflamatorias fueron elevados en
H. Hepaticus
infectado con
Apc
/+ ratones Min
pero no en
H. Hepaticus
infectado con
en peso
ratones de la misma camada
Una característica de este modelo de ratón es que
H. Hepaticus
infectado con
Apc
Min /+ ratones muestran
aumentado significativamente PIN de alto grado (PIN de alto grado) y el carcinoma de próstata; Sin embargo, emparejado
H. Hepaticus
infectado con
en peso
ratones de la misma camada no se desarrollan PIN o carcinoma de lesiones significativas (Figura 1B, 1C y S1, el cuadro S1). Tras el análisis de los niveles de citoquinas en suero, descubrimos diferencias significativas en los niveles de proteína de IL-1α (p = 0,02) e IL-17 (p = 0,0005) entre los
Apc
Min /+
y
en peso
ratones de la misma camada (Figura 2A derecha). Del mismo modo,
In situ
etiquetado de IL-17 mostraron una mayor niveles de IL-17 + expresión en MLN en
H. Hepaticus
infectado con
Apc
/+ ratones Min
pero no en el
H. Hepaticus
infectado con
en peso
controles (Figura 2B y 2C). El tratamiento de
H. Hepaticus
infectado con
Apc
Min /+
ratones con anti-TNF-un anticuerpo redujo significativamente la expresión del gen mRNA (p & lt; 0,01) y proteína (p & lt; 0,001) niveles de IL-17A en MLN (Figura 2B y 2C). Tomados en conjunto, estos datos acumulados plantearon la posibilidad de que las diferencias sistémicas procedentes de la inflamación desencadenada por bacterias de origen tracto gastrointestinal pueden contribuir a los procesos cancerígenos en tejidos distantes como el de próstata.
riesgo de cáncer de próstata es transmisible a los destinatarios no infectadas utilizando mesentérica células de ganglios linfáticos (MLN) de
H. Hepaticus
infectado con
Apc
Min /+ ratones
A sabiendas de que el origen del tracto GI respuesta inflamatoria es necesario para el cáncer de próstata en nuestro modelo, la hipótesis de que las células dentro asociado al intestino ganglios linfáticos (MLN) pueden ser clave en el cáncer de próstata en este modelo. Con el fin de probar esta hipótesis, hemos utilizado la transferencia de células de MLN recoge de
H. Hepaticus
o donante infectado con sham-dosificado
Apc
Min /+
o
en peso
ratones de la misma camada (Figura 3). Para este experimento, todos los animales receptores eran
Helicobacter
sp
exento masculina
Apc
Min /+
o
en peso
camada. ratones macho de 6-8 semanas de edad se sometió a inyección ip de 5X10
6 sola suspensión de células en HBSS por ratón de las células recolectadas de los ganglios linfáticos mesentéricos de
H. Hepaticus
infectado con o simulada dosificado
Apc
Min /+
o
en peso
ratones.
ilustración esquemática de células MLN los experimentos de transferencia diseñado para probar la hipótesis de que el tracto gastrointestinal local de eventos de red inmunes causan desequilibrios inmunes sistemáticas que determinan el destino de las lesiones preneoplásicas en epitelios topográficamente distantes tales como los de la glándula prostática. Ensayos utilizaron 6 ratones por grupo. Los experimentos se realizaron por duplicado
En consecuencia, se halló una mayor baja de manera significativa (p & lt; 0,05). Y alto grado (p & lt; 0,01) en el PIN no infectada
Apc
Min /+
ratones que solamente habían recibido células MLN de
H. Hepaticus
infectado con
Apc
Min /+
ratones (Figura 1A, B, C y S1) a las 6 semanas después de la inyección ip, en comparación con las células del donante de MLN sham-dosificado
Apc
Min /+
ratones. Estos no infectadas
Apc
Min /+ Windows que recibieron células de
H. Hepaticus
infectado con
Apc
/+
características mostradas Min de preneoplasia y carcinoma consistentes con los observados en
H. Hepaticus
infectado con
Apc
Min /+
ratones (Figura 1A), y se asemeja a las observadas en los varones humanos. Además, los ratones
en peso
receptores no infectados que recibieron las células ganglionares de
H. Hepaticus
infectado con
Apc
ratones Min /+
donantes también había aumentado LGPIN (p & lt; 0,001), PIN de alto grado (p & lt; 0,001) y el adenocarcinoma (p & lt; 0,001) (Figura 1C y S1; Tabla S1) en comparación con el peso de los ratones no infectados que recibieron las células ganglionares de
H. Hepaticus
exento de
Apc
ratones Min /+
donantes que muestran que la predisposición genética de los epitelios de próstata no se requiere específicamente para el efecto cancerígeno de los
H. Hepaticus
infección. Esta característica transmisibilidad mostró que
H. Hepaticus
células activados por eran suficientes para los procesos neoplásicos en las glándulas extraintestinales como el de próstata.
La neutralización de la inflamación impide MLN transmisibilidad de células del riesgo de cáncer de próstata a los ratones no infectados
Finalmente, probó si la neutralización de la inflamación era suficiente para inhibir de células MLN transmisibilidad mediada de cáncer de próstata en este modelo de ratón. Hemos utilizado la transferencia de células de MLN recoge de
H. Hepaticus
infectado con
Apc
Min /+
ratones que habían sido tratados con anti-TNF-anticuerpo durante 3 semanas (Figura 3). Para este experimento, todos los animales receptores eran
Helicobacter
sp
exento masculina
Apc
Min /+
o
en peso
animales de la misma camada. ratones macho de 6-8 semanas de edad se sometió a inyección ip de 5X10
6 sola suspensión de células en HBSS por ratón de las células recolectadas de los ganglios linfáticos mesentéricos de
H. Hepaticus
infectado con
Apc
Min /+
ratones. Como se predijo, no se encontraron diferencias significativas entre los no infectados
Apc
Min /+
ratones no infectados vs
Apc
Min /+
ratones que habían recibido MLN de ratones anti-TNF-a-tratado (p & gt; 0,05). Del mismo modo, hubo significativamente menos LGPIN (p & lt; 0,01) y el PIN de alto grado (p & lt; 0,05) en los no infectados
Apc
Min /+
receptores de MLN de tratado con anti-TNF
H. Hepaticus
ratones infectado con en comparación con
Apc
Min /+ ratones receptores
de MLN de
H. Hepaticus
infectado con
Apc
Min /+
ratones (Figura 1C y S1; Tabla S1). Estos datos indican que el papel pro-inflamatoria de las células MLN es la causa subyacente de la transmisibilidad del riesgo de cáncer de próstata observado.
Discusión
En el presente estudio, probamos varón joven
apc
Min /+ ratones
en un /6J fondo C57BL como modelo experimental para investigar las asociaciones de la inflamación con la carcinogénesis de la próstata. Al igual que con los seres humanos, donde el riesgo de cáncer de próstata tiene un fuerte componente genético,
Apc
/+ ratones mutantes
Min están predispuestos genéticamente a la neoplasia epitelial [13,16,17]. Nosotros y otros han demostrado en el pasado que
Apc
/+ ratones Min
también progresivamente desarrollar cáncer de próstata sobre la base de un aumento de lesiones PIN a juego que se ve en los varones humanos [15, 17]. En nuestros estudios,
Apc
/+ ratones Min
desarrollar lesiones neoplásicas tempranas en la próstata dorsolateral tan temprano como a los 3 meses de edad anteriores pólipos intestinales evidentes. En edad = 6 meses, el 40% de los
Apc
/+ ratones Min
desarrollar adenocarcinoma microinvasor 10-20%, mientras que también tienen lesiones más avanzadas de cáncer de próstata [15]. Este aspecto da la
Apc
/+
utilidad Min ratón como un modelo para examinar la progresión de las lesiones neoplásicas y preneoplásicas tempranas en la próstata humana [1-3].
Un hallazgo importante de este estudio es que la infección por
H. Hepaticus
, una bacteria que coloniza principalmente el intestino grueso de ratones C57BL /6
ApcMin
/
+
ratones sin typhlocolitis abierta [13,19- 21], aumentó significativamente la incidencia de PIN y lesiones de adenocarcinoma microinvasivos en la próstata. Como era de esperar, 3 meses de edad
Apc
/+ ratones Min
infectados con
H. hepaticus
tenía ni abierta ni IBD grandes pólipos adenomatosos todavía forman en los intestinos (datos no mostrados). Sin embargo, incluso a esta temprana edad, estos ratones exhibieron aumentó citoquinas pro-inflamatorias sistémicas, tales como TNF-α, IL-1α, IL-3, eotaxina y IL-9, en comparación con sus homólogos de control no infectadas, indicativo de sistema inmune activación. Estos datos, tomados junto con la evidencia previa que
H. hepaticus
infección es capaz de modular la tumorigénesis en sitios extra-intestinal [21,22], sugieren que los eventos de la red inmune del tracto GI clínicamente silenciosos desencadenados por la microbiota intestinal pueden causar desequilibrios inmunes sistemáticos. A su vez, estos desequilibrios pueden afectar el destino de las lesiones preneoplásicas en epitelios topográficamente distantes tales como los de la glándula prostática.
Las funciones interrelacionadas de la elevada entorno de citoquinas proinflamatorias y el componente celular inflamatorio encuentran en el cáncer de próstata propensos
H. Hepaticus
infectado con
Apc
/+ ratones Min
son interesantes. Dentro de la glándula de la próstata, PIN y adenocarcinoma microinvasive presentados mastocitos, neutrófilos, y células precursoras mieloides que llevan núcleos en forma de anillo. TNF-α se demostró previamente esencial en el reclutamiento de células cebadas y la tumorigénesis en
Apc
Min /+
ratones [13,17,23]. La liberación de factores, incluyendo el TNF-α y varias proteasas de mastocitos residen en el estroma de la próstata puede tener un papel importante en la tumorigénesis [10].
TNF-α e IL-1α se han implicado en un conjunto NF -κB mediada cascada de señales que inhibe la apoptosis y aumenta la proliferación de células epiteliales en preneoplasia de próstata humano y el cáncer [24]. Además, la IL-1α promueve la proliferación anormal de las células epiteliales de la próstata humano a través de factor de crecimiento de insulina y las señales de crecimiento relacionados con el factor de crecimiento de fibroblastos-7 [25,26]. Eotaxina e IL-3 regulan la maduración de la médula ósea, la liberación y la trata de tejidos de células precursoras mieloides [27] tales como los que se observan en las glándulas de la próstata de
H. Hepaticus
infectado con
Apc
Min /+
ratones. papeles potenciales de eotaxina, IL-3 y células precursoras mieloides asociadas en epitelial orden de carcinogénesis más investigación. El papel pro-inflamatoria potente de la IL-9 se aprecia cada vez más. Th9 células constituyen la última adición expansión de la matriz subtipo de células T cooperadoras. IL-9 estimula el crecimiento de células hematopoyéticas, especialmente células cebadas y la secreción de varias quimiocinas que reclutan células adicionales a los tejidos inflamados [28]. El importante papel de la IL-9 en la autoinmunidad y alergia [28] puede proporcionar pistas importantes, especialmente a la luz de recientes hipótesis que conectan la inflamación de la próstata con cáncer. Próstata lesión de las células epiteliales puede entonces causar pérdida de la tolerancia a los antígenos prostáticos normales y por lo tanto dar lugar a una reacción autoinmune que se autoperpetúa [10]. En el presente estudio, nuestro hallazgo de que la neutralización de TNF-α fue suficiente para contrarrestar mejora el riesgo de cáncer de próstata en un modelo de ratón sugiere que esta citocina tiene un papel central en la creación de un entorno macro inflamatoria sistemática pro-tumorigénicos que permite la progresión del cáncer en la glándula prostática.
Otra citoquina pro-inflamatoria que encontramos significativamente elevado comparando
H. Hepaticus
infectado con
Apc
Min /+ ratones con
H. Hepaticus
infectado con
en peso
ratones de la misma camada fue Il-17A. Las diferencias significativas en Il-17 eran de particular interés debido a que hemos demostrado anteriormente IL-17 + en las células del nodo linfático mesentérico (MLN) de los ratones después de la infección con el
H. Hepaticus
[20]. Del mismo modo, la IL-17 se ha implicado en el desarrollo del cáncer de colon infección provocada en
Apc
Min /+
ratones [29,30]. La correlación de la
Apc
Min /+
genotipo ratón con MLN sistemática y elevaciones de la IL-17 expresión puede tener una base genética, ya que la IL-17-asociado en el déficit función de las células inmunes de este modelo de ratón se ha informado [30]. Es importante destacar que la evidencia reciente de ambos ratón preclínico [31] y los estudios clínicos humanos apoyan un papel significativo para la IL-17 en la carcinogénesis de próstata [32,33].
Para proporcionar una prueba experimental de esta hipótesis y retener el complejo inmunológico interacción de las diversas poblaciones de células que elegimos para transferir las poblaciones totales de células MLN en ratones. actividades inmunológicas dentro de tejido del ganglio linfático sistémica [20] pueden ser el nexo de unión GI flora microbiana con alteraciones sistemáticas universalmente pro-tumorigénicos del sistema inmune. Sorprendentemente, se encontró que el aumento de riesgo de cáncer de próstata es transmisible a los no infectados
Apc
Min /+
receptores de células MLN única tomados de
H. Hepaticus
infectado con
Apc
Min /+
donantes. No hubo evidencia de
H. Hepaticus
organismos en el tejido de la próstata de los ratones receptores de trasplante utilizando PCR o por
In situ
examen mediante tinción de plata (datos no mostrados), pero la translocación de
H. Hepaticus
organismos o sus antígenos de los intestinos a los ganglios linfáticos siguen siendo un factor que contribuye posible. Nuestro hallazgo de que las células tomadas de MLN tratado con anti-TNFa
H. Hepaticus
infectado con
Apc
Min /+
perdió el cáncer de próstata efectos promotores proporciona evidencia de que la inflamación ha mejorado este proceso carcinogénico.
En conclusión, una posible papel de los microbios en tumores malignos de próstata se ha sospechado [9], pero no probada permanecido hasta ahora. Aquí hemos demostrado que la ingestión de
H. Hepaticus
sola carcinogénesis de próstata mejorada en
Apc
Min /+
ratones. Nuestra conclusión de que la inflamación ha mejorado este proceso de formación del cáncer añade soporte mecánico a los beneficios bien documentados de no esteroides antiinflamatorios (AINE) en pacientes humanos. Sorprendentemente, los ratones no infectados que recibieron solamente células de ganglio linfático se convirtió en altamente susceptible al cáncer de próstata. Esta observación de que el cáncer de próstata es inducible por células destilados de otro órgano puede ayudar a explicar por qué la etiopatogenia del cáncer de próstata en los seres humanos ha sido difícil de dilucidar. Queda por determinar definitivamente si otros microbios del tracto gastrointestinal en los seres humanos, tales como
H pylori
, puede tener un efecto similar en próstata y otros cánceres que no son gastrointestinales de los seres humanos.
Materiales y Métodos
los animales experimentales
Todos los animales fueron alojados y manipulados de Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care (AAALAC) acreditados por las instalaciones con las dietas, métodos experimentales y la vivienda como específicamente aprobado por el Institutional Cuidado de Animales y el empleo. El MIT CAC (IACUC) aprobado específicamente los estudios, así como el alojamiento y manipulación de estos animales.
Apc
Min /+ ratones
sobre un fondo C57BL /6J se obtuvieron originalmente de los laboratorios Jackson y criado en la casa para proporcionar
Apc
Min /+ ratones y
tipo salvaje gratis (
wt)
camada para los receptores y donantes experimentales.
Helicobacter
mantendrá el estatuto de los ratones fue confirmada por PCR utilizando
Helicobacter
cebadores específicos de género, como se describe anteriormente [20].
Experimental
Helicobacter Hepaticus
infección
Un total de 44 ratones experimentales se dosificaron a las 6 semanas de edad con
H. Hepaticus gratis (cepa 3B1, ATCC#51449) y luego colocado de forma separada en un área de contención biológica dentro de la misma instalación para animales.
H. hepaticus
se cultiva en condiciones microaeróbicas, preparado, y confirmó pura como se describe en otro lugar [11,20]. ratones experimentales recibieron 0,2 ml de inóculo fresco por sonda gástrica cada dos días para un total de tres dosis. Ciego, los ganglios linfáticos mesentéricos (MLN) y la próstata se recogieron 6 semanas después de la infección en la necropsia y se analizaron por PCR para confirmar (intestino) o excluir (MLN, próstata) la colonización.
Diseño experimental
Un total de 96
Apc
Min /+
ratones y 60 en peso ratones fueron incluidos en varios regímenes de tratamiento o como controles experimentales. Los experimentos se llevaron a cabo utilizando dos ensayos separados con 5-6 ratones cada uno, como se especifica en la Tabla S1. Sesenta
Apc
Min /+
ratones y 40 en peso de edad ratones de 6 semanas se inyectaron intraperitonealmente con 5 x 10
6 MLN células suspendidas en HBSS. Los ratones donantes de células eran varones
H. Hepaticus
infectados con seis semanas antes, o
Helicobacter
exento de C57BL /6
en peso
o
Apc
Min /+
ratones.
TNF-α neutralización
Un total de 24
H. Hepaticus
infectado
Apc
Min /+
o
en peso
ratones a la edad de 9 semanas (a partir de las 3 semanas después de
H. Hepaticus
infección) recibió anti-TNF-α anticuerpos (clon XT-3;. BioExpress, Lebanon, Nueva Hampshire) a 200μg por ratón tres veces por semana durante tres semanas como se describe anteriormente [13]
Detección de sistémico expresión de la proteína citoquina
los niveles de citoquinas en suero de 5-6 animales de cada grupo experimental se analizaron utilizando el sistema de ensayo Bioplex Pro Mouse citoquinas (BioRad, Hercules, CA) de acuerdo con el protocolo de los fabricantes. Brevemente, las muestras de suero se diluyeron usando el kit de diluyente de la muestra, se incubaron con perlas recubiertas de anticuerpos seguido de una incubación de anticuerpo secundario y se analizaron por duplicado en un sistema Bio-Plex 200 (BioRad, Hercules, CA).
La evaluación histológica e inmunohistoquímica
Los tejidos fijados en formalina fueron procesados y embebidos en parafina 5μm tejido secciones fueron teñidas por H & amp; e, tinción de plata de Warthin-Starry o IHC y evaluados para las lesiones de la próstata por un patólogo veterinario cegados para probar la identidad. Las lesiones preneoplásicas y neoplásicas de próstata temprano, detectaron a partir de los últimos criterios de informe de consenso [34], fueron evaluados cuantitativamente como se ha descrito anteriormente por Poutahidis et al (2009) [17].
anticuerpos primarios de conejo utilizados para inmunohistoquímica incluyeron contra -β-catenina (Thermo Fisher Scientific /Vision Lab, Fremont, CA), anti-laminina (Thermo Fisher Scientific /Vision Lab, Fremont, CA) y anti-IL17 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Los antígenos fueron recuperados con Proteasa 1 (Roche Diagnostics /Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) para la detección de la laminina. antígeno de recuperación de calor inducido se realizó con tampón citrato pH 6 para la β-catenina o con EDTA pH 8 para la detección IL17. El anticuerpo primario se detectó la unión con anticuerpo de cabra anti-conejo Zytochem Plus HRP Polymer (Zytomed Systems, Berlin, Alemania). La señal se detectó con diaminobencidina (Invitrogen, Camarillo, CA) y los tejidos se counterstained con hematoxilina.
Para la cuantificación de IL-17 expresión en MLN, treinta 40x imágenes de alta potencia de campo de secciones teñidas con IHC fueron capturados por grupo de tratamiento. Diez imágenes de cada grupo fueron seleccionados al azar para los recuentos. Cálculo automático de los números de píxeles correspondientes a la IL-17 en las imágenes apareció en un histograma después de procesar cada imagen con el color umbral plug-in del programa de procesamiento y análisis de imagen ImageJ (NIH, Bethesda, MD). conteos morfométricos se registraron como el número de IHC etiquetado píxeles por imagen.
análisis estadísticos
La prevalencia de LGPIN, PIN de alto grado y micro-adenoCa entre los grupos se compararon mediante la prueba de Kruskal-Wallis de una vía ANOVA y post-test de Dunn. Las comparaciones directas se realizaron mediante la prueba de Mann-Whitney. Suero análisis de datos de citocinas se realizó mediante la prueba t de estudiante de 2 colas.