Extracto
Actualmente en la clínica, la gente usa hematoxilina y eosina (H & amp; E mancha) e inmunohistoquímica métodos para identificar la generación y género de cánceres para muestras patológicas humanas. Dado que estos métodos no son precisos y consume mucho tiempo, el desarrollo de un método rápido y preciso para detectar el cáncer se demanda urgentemente. En nuestro estudio, se identificaron los péptidos de unión para el cáncer de pulmón a células A549 utilizando bacterias método de visualización de la superficie. Con esos péptidos de unión para las células A549 en la superficie, las bacterias fluorescentes (
Escherichia coli con
expresado de forma estable la proteína verde fluorescente) sirvieron como reactivos de detección específicos para el diagnóstico de cánceres. La actividad de unión del péptido fluorescente complejo bacterias fue confirmada por las células de cáncer individual, de células de cáncer de adjuntos y ratones muestras de xenoinjerto de tumor. Un método de fijación único fue desarrollado para complejo de péptido-bacterias con el fin de hacer que este complejo más factible para el uso clínico. Este complejo de péptido-bacterias fluorescentes tiene un gran potencial para convertirse en una nueva herramienta de diagnóstico para la aplicación clínica
Visto:. Dong B, Wang A, L Yuan, Chen L, K Pu, Duan W, et al. (2013) Las bacterias fluorescentes péptido-luminiscentes complejo como reactivos para el diagnóstico del cáncer. PLoS ONE 8 (1): e54467. doi: 10.1371 /journal.pone.0054467
Editor: Shi Yu Yang, University College de Londres, Reino Unido
Recibido: 9 Octubre, 2012; Aceptado 11 de diciembre de 2012; Publicado: 18 Enero 2013
Derechos de Autor © 2013 Dong et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No.30870683 y 81171451). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Con el desarrollo de nuevas técnicas en relación con el diagnóstico y el tratamiento para el cáncer, la tasa de mortalidad de los pacientes con cáncer ha disminuido en las últimas décadas. Sin embargo, el objetivo de curar el cáncer está todavía lejos de alcanzar. En la actualidad, los puntos clave para aumentar la tasa de curación y la calidad de vida de los pacientes con cáncer son más tempranas y el diagnóstico preciso y un tratamiento eficaz para este tipo de enfermedades malignas. La aplicación de reactivos luminiscentes sensibles y moléculas de direccionamiento de las células cancerosas proporciona herramientas útiles para el diagnóstico preciso y un tratamiento eficaz para el cáncer. materiales luminiscentes novedosos tales como puntos cuánticos [1], los nanomateriales conversión ascendente [2] y nanoburbujas [3] se han intentado aplicar a los sistemas de imágenes de cáncer. Varias moléculas, tales como anticuerpos [4], péptidos [5], [6] y aptámeros [7] se han utilizado como moléculas para el diagnóstico y la terapia del cáncer. Aunque hay algunos avances para el desarrollo de materiales luminiscentes y moléculas de direccionamiento, sistemas eficaces para el diagnóstico y la terapia del cáncer no han sido plenamente establecida. A principios y métodos de diagnóstico más precisas combinando moléculas de direccionamiento con las moléculas de imágenes sólidas atraer el interés cada vez más investigadores [8]. Nuestro estudio tiene la intención de establecer un sistema novedoso que incluye péptidos dirigidos y bacterias fluorescentes para el diagnóstico preciso de los cánceres. péptidos dirigidos podrían ser examinados e identificados por el método de bacterias superficie de visualización desarrollado en la década de 1990 [9], [10]. Utilizando la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), diversos péptidos con actividad de unión específica se han obtenido en un camino alto rendimiento con bacterias método de visualización [11], [12]. Actualmente, con este método, los péptidos de direccionamiento de las células del cáncer de mama [13] y péptidos sustrato de proteinasa [14] han sido identificados. En nuestro estudio, con la identificación de los péptidos de unión específica para las células A549 del cáncer de pulmón, se establecería una nueva técnica para la detección de células de cáncer de pulmón utilizando el sistema de bacterias péptido fluorescente. Además, el sistema bacterias péptido fluorescente podría ser utilizado como reactivo de diagnóstico en la aplicación clínica para pacientes de cáncer en el futuro.
Materiales y Métodos
1. Cultivo de células y Materiales
líneas celulares de carcinoma de pulmón humano (células A549 y células H460), la línea celular de adenocarcinoma de mama humano (2-HepG), línea (MCF-7), hepatocelular humano línea celular de carcinoma de cuello uterino humano de células de carcinoma (HeLa) y línea celular de carcinoma de laringe humana (Hep-2) se utilizaron en este estudio. Estas líneas celulares se cultivaron en RPMI-1640 (Hyclone Corp., EE.UU.) y células de fibroblastos de pulmón humano (HLF) se cultivaron en Medio Eagle Modificado de Dulbecco (Hyclone Corp., EE.UU.) en un CO 5%
2 incubador humidificado a 37 ° C. El medio se suplementó con 10% de suero bovino fetal (FBS) (Hyclone Corp., EE.UU.) y 1% de penicilina /estreptomicina (China Nacional de Medicina Corp., China). A549, células H460 y HLF fueron regalos de tipo Biliang Dr. Zhang [15], [16] (Instituto de Guangzhou de la biomedicina y la salud, CAS, China). Las células MCF-7, HepG-2, HeLa y Hep-2 fueron regalos de tipo Haiyan Dr. Liu [17], [18] (El Ciro Tang Hematología Center, Universidad Soochow, China). Los otros agentes químicos en este estudio fueron adquiridos de la Medicina China National Corporation.
2. Proyección de Encuadernación monoclonales bacterias péptido-fluorescentes con células A549
La biblioteca de péptidos bacteriana de
E. coli y usados en este estudio fue un regalo de Patrick S. Daugherty en el Departamento de Ingeniería Química, Universidad de California, Santa Bárbara. En esta biblioteca péptido bacteriano, todos los
E. coli
superficie presenta péptido 13-mer (X2CX7CX2) fusionar en el segundo bucle extracelular de la proteína permutada circularmente membrana externa ompX (CPX) [13], en el que expresa péptidos y proteína fluorescente verde (GFP) fueron inducidos por la adición de L - (+) - arabinosa (0,02% w /v) a un cultivo en fase logarítmica [13], [19]
alícuotas congeladas de 1 × 10
9 bacterias fueron descongelados y cultivados. durante la noche en caldo óptima super (SOB) a 37 ° C y suplementado con 34 g /ml de cloranfenicol (CM) y 0,2% D (v /w) - (+) - glucosa. El día siguiente, las bacterias se subcultivaron a las 1:50 en caldo Lisogenia (LB) suplementado con 34 g /ml CM durante 2 horas a 37 ° C y se indujo por 0.02% (w /v) L - (+) - arabinosa para 1 h a temperatura ambiente para asegurar la GFP y péptidos expresados en bacterias. Después de células (48 h después de la inoculación) A549 y HLF cultivadas se recogieron por tripsinización y se volvieron a suspender en tubos. 10
7 células HLF se co-incubaron con 100 veces más células bacterianas en exceso durante 45 minutos en un agitador de inversión a 4 ° C. Las suspensiones celulares se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 min a 4 ° C y se recogió el sobrenadante. Este procedimiento podría repetirse para otro momento debido al aumento de los acontecimientos de unión no específica producido por células HLF. El sobrenadante se co-incubaron con 10
7 células A549 durante 45 minutos en un agitador de inversión a 4 ° C y suspensiones celulares se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 min a 4 ° C y después se lavaron tres veces con PBS. El sedimento se resuspendió con PBS frío y 5 ml de inmediato analizó por FACS (BD FACS Aria II, BD Corp. EE.UU.). La puerta de clasificación en el experimento de FACS se estableció basándose en las señales fluorescentes de las muestras de control negativo. Una vez que los ajustes de fluorescencia habían sido optimizados para el control negativo, una puerta de tipo apropiado se ha elaborado para la clasificación de la biblioteca sobre la base de la fluorescencia. Una puerta de tipo se ha elaborado para excluir la mayor cantidad de control negativo como sea posible mientras que todavía captura de eventos positivos en la biblioteca fueron cerrada [13] .Las células fluorescentes verdes para la clasificación porque si los péptidos que estaban en la superficie de las bacterias fluorescentes verdes podrían unirse con las células A549 y las señales fluorescentes verdes de células aumentarían. Al menos 10
5 eventos fueron registrados y las células tumorales con el aumento de las señales fluorescentes verdes y soltar en la puerta de color naranja se recogieron con FACS. Las células recogidas se cultivaron durante la noche en SOB que contenía 0,2% de D - (+) - glucosa y CM 34 mg /ml. Las bacterias de unión con las células cancerosas se amplificaron específicamente para la siguiente ronda de selección. A partir de la próxima ronda, 10
6 células fueron suficientes para el análisis FACS y clasificación. Hasta que la señal fluorescente de células tumorales dejan de aumentar en forma secuencial dos rondas, se dio por terminado el procedimiento de cribado de péptidos de unión. bacterias seleccionadas con péptidos de unión se cultivaron en la placa de medio LB que contenía 1% de agar y 34 mg /ml CM. Después se cultivaron durante 24 h a 37 ° C, las bacterias péptido fluorescente monoclonales se seleccionaron y se cultivaron en 5 ml de SOB que contenía 0,2% (m /v) D - (+) - glucosa y 34 mg /ml CM a 37 ° C durante la noche. El día siguiente, la actividad de unión de clones individuales se examinó mediante la medición de las señales de GFP fluorescente de células después de las células A549 incubadas con esas bacterias péptido fluorescente monoclonales. Las secuencias de péptidos de unión en la superficie de las bacterias con péptido fluorescente monoclonales se obtuvieron mediante el envío de las bacterias a Sangon Biotech Co., Ltd. Shanghai, China para la secuenciación.
3. Caracterización de la especificidad de unión y la eficiencia entre las bacterias y las células de péptidos fluorescentes
Los experimentos se realizaron en ambas células unidas y separadas. El experimento microscopía de fluorescencia se llevó a cabo en primer lugar, para examinar la especificidad de unión de bacterias con péptido fluorescente monoclonales con células unidas. las células A549, células HLF, células H460, células MCF-7, células Hep-2, HepG-2 células y las células HeLa (3 × 10
5) se sembraron en placas de cultivo celular de 12 pocillos un día antes del experimento. Después de la inducción, 100 l de suspensión de bacterias (≈8 × 10
7) en 1 ml de PBS, se incubaron con todo tipo de células a temperatura ambiente que se ha demostrado para asegurar proteínas en la superficie de las células expresan normalmente durante la incubación [13] durante 45 min y se lavaron tres veces por PBS. Las células se fotografiaron con un microscopio de fluorescencia (Nikon Ti, Nikon Corp. Japón) para confirmar la actividad de unión de bacterias con péptido fluorescente monoclonales con células. La actividad de unión entre las bacterias péptido fluorescente monoclonales con células desprendidas se examinó por citometría de flujo. El procedimiento de examen de la actividad de unión de bacterias con péptido fluorescente es similar a la de la detección de los péptidos de unión con las células.
4. Las bacterias intento de mantener la actividad de unión con diferentes métodos de fijación
La fijación se realiza con diferentes reactivos de fijación (etanol [20], metanol [21], acetona [22] y paraformaldehído al 4% [23]). Después se centrifugó a 5000 rpm durante 5 min, el sobrenadante se eliminó y las bacterias se fijaron en los reactivos de fijación para 20 min a temperatura ambiente. Los reactivos en exceso se eliminaron de fijación y de las bacterias fijadas fueron suspendidos por PBS y se almacenaron a 4 ° C.
La citometría de flujo y análisis de fluorescencia experimentos de microscopía se realizaron como se ha indicado anteriormente para examinar la actividad de unión de bacterias fijadas con células. En comparación con las bacterias péptido fluorescente monoclonales frescos, la proporción de bacterias fijadas a las células varió de 100:1 a 500:1 obtener evidente y detecta señales fluorescentes en las células. Normalmente, después de bacterias se fijaron, las señales fluorescentes verdes de las bacterias se redujeron en cierta medida. Para examinar si la actividad de unión de bacterias fijadas con células se dependía de tiempo, microscopía de fluorescencia y análisis de FACS se llevaron a cabo varias veces en el día 1, el día 7 y el día 30 después de la fijación.
5. El examen de actividad de unión del sistema de bacterias péptido fluorescente con el tejido del tumor de xenoinjerto en ratones
experimento de unión se realizó en tejido incluido en parafina. ratones A549 muestras de xenoinjertos tumorales en las diapositivas de parafina fueron regalos de tipo Dr. Laura Cerchia y Dr Vittorio De Franciscis (Istituto di Endocrinologia ed Oncología Experimental, CNR, Nápoles, Italia). El documento relacionado sobre la preparación de muestras ya ha sido publicado en la revista PLoS ONE [24]. El procedimiento de desparafinado para las muestras de parafina se realizó siguiendo el procedimiento aceptado [25]. 1 × 10
6 (en 100 l) frescas de péptido-bacterias y 5 × 10
6 péptido-bacterias fijadas se incubaron por separado con las secciones del tumor de parafina para 1 h a temperatura ambiente. Después de lavar con PBS tres veces, se observaron las secciones del tumor bajo un Nikon A1R láser confocal de barrido microscopio (Nikon Corp. Japón).
Resultados
1. El enriquecimiento de la unión específica Biblioteca péptidos para las células A549
Con el fin de aislar ligandos de unión específicos de células de un fenotipo de células tumorales dado decidimos establecer un modelo de sistema incluyendo normal (no tumoral) línea celular (HLF) y línea celular de carcinoma de pulmón (A549). HLF células trabajaban para contra-selección en el proceso de selección. Una biblioteca de 13-mer con péptidos de cisteína restringido se utilizó para la selección de péptidos de unión contra las células intactas (Figura 1A). En cada ronda de paso de selección de las células A549 se realizaron una o dos etapas de contra contra las células HLF. Durante el proceso de selección, hemos aumentado progresivamente la presión selectiva cambiando condición de incubación, condición de lavado y área de la puerta de FACS. Durante ronda 6 y 7, la proporción de células fluorescentes verdes a células completas se mantuvo sin cambios, lo que sugiere que la población se había detenido a evolucionar bajo la presión de selección. De hecho, la piscina en la ronda 6 se enriqueció para los péptidos que aparecen en la superficie de las bacterias que se unen preferentemente a las células A549 (Figura 1B). Sesenta clones individuales de bacterias de este grupo se seleccionaron y se cultivaron durante la siguiente etapa del análisis.
(A) Representación esquemática de los péptidos de detección y selección con biblioteca de exposición bacteriana. 1. construyó la biblioteca mediante la transformación de plásmidos en
E. coli MC1061
; 2. descartan las bacterias de unión con las células normales después de preincubación; 3. incubó la mezcla de células cancerosas y las bacterias residuales; 4. analizó el efecto de la unión de las células cancerosas con bacterias usando FACS; 5. Ordenar las bacterias fijarse a las células cancerosas mediante citometría de flujo y se cultivaron las bacterias en un medio de unión; 6. realizó la próxima proyección bacterias unión redonda; 7. Aislado las bacterias de unión a células de cáncer y se secuenciaron los péptidos presentados en la superficie de las bacterias. (B) El progreso de enriquecimiento de bacterias de unión con células cancerosas mediante FACS en 6 rondas de cribado.
2. La identificación de bacterias monoclonales péptido-fluorescentes con alta eficiencia Encuadernación
Las bacterias péptido fluorescente monoclonales con alta eficacia de unión se identificaron a partir de 60 clones para experimentos adicionales. Antes de que los clones fueron enviados a la secuenciación, se utilizó FACS para comparar la eficacia de la unión de las bacterias a las células HLF y A549. Después de la incubación con bacterias péptido fluorescente monoclonales inducidos, el porcentaje de las células fluorescentes a células completas representa la tasa de unión de los péptidos en la superficie de bacterias clonales con células. Los resultados indicaron que la tasa de unión de todas las bacterias de los 60 clones fue de alrededor de 10% -80% para las células A549, mientras que fue de menos de 5% para las células HLF (datos no mostrados). En comparación con los que tienen 20% del tipo de unión, péptidos fluorescentes bacterias con tasa de unión del 80% podría tener mayor afinidad con las células. La tasa de unión de las bacterias con péptido fluorescente monoclonales (clon 4) con la más alta eficiencia de unión era 80% para las células A549 y 0,4% para las células HLF (Figura 2). Los resultados de la secuenciación mostraron que siete secuencias de clon único se obtuvieron a partir de 60 clones (Tabla 1). No había ninguna secuencia conservada observado por todos estos clones.
La fracción de unión de las células A549 con bacterias (mostrar en la puerta de naranja) fue del 80% y la de las células HLF fue del 0,4%.
3. Evaluación de la especificidad de unión de las bacterias fluorescentes monoclonal Péptido-
La identificación de un pequeño grupo de bacterias con péptido fluorescente que puede distinguir las células A549 de las células HLF plantea una cuestión de si estas bacterias con péptido fluorescente puede unirse así con otros tipos de células. Para este fin se determinó para examinar el potencial de unión relativa de todas las bacterias péptido fluorescente para varias líneas celulares. Se determinó primero el tipo de célula especificidad mediante la medición de la actividad de unión de todas las bacterias péptido fluorescente en un panel de líneas celulares no relacionados. Se encontró que ninguna de las siete bacterias péptido fluorescente no se unió a otros tipos de células de carcinoma humano incluyendo el hígado (HepG-2), de laringe (Hep-2), cervical (Hela) y de mama (MCF-7) células de carcinoma. Los resultados de la observación del microscopio de fluorescencia y citometría de flujo en células unidas y separadas verificó la especificidad de unión de los péptidos bacterias fluorescentes. Figura 3 mostró los resultados típicos de las bacterias con péptido fluorescente que tenían la más alta eficiencia de la unión a células A549 (clon 4). Además, las bacterias con sólo el andamio de proteínas CPX no podían unirse con las células A549, lo que significa péptidos que presentan en la superficie de las bacterias mediadas el acontecimiento de unión entre bacterias y células A549. Más atención debe prestarse a otras células de carcinoma de pulmón, por ejemplo, H460. Nuestros resultados ilustran que las bacterias péptido fluorescente monoclonales no podían reconocer las células H460 -otra línea celular también pertenecen a la categoría de cáncer de pulmón de células no pequeñas, lo que implicaba que las bacterias péptido fluorescente monoclonales tienen la posibilidad de reconocer los diferentes géneros de células de cáncer de pulmón.
(A) imágenes de microscopía de fluorescencia de clones bacterianos se incubaron con las células. A549
△ se incubó con CPX sólo las bacterias y otras células se incubaron con bacterias péptido fluorescente monoclonales seleccionados, la barra de escala era 20 micras. resultados (B) FACS de varias células de unión de péptidos con bacterias fluorescentes monoclonales en relación 1:100. (C) Porcentaje de fracción de bacterias con péptido fluorescente monoclonales que se unen con varias células a partir de datos FACS. Los datos fueron la media ± S. D. de al menos tres experimentos independientes.
4. Mantenimiento de la unión capacidad de las bacterias de péptidos fluorescentes con células tumorales para la aplicación clínica
Se necesitaba un método de fijación para mantener la especificidad de unión y la eficiencia de las bacterias a las células para aplicaciones más amplias. A través de la comparación del efecto vinculante de las bacterias con las células después de bacterias se fijaron con etanol, metanol, acetona y 4% de paraformaldehído, elegimos paraformaldehído como reactivo de fijación para su posterior estudio. Aunque las bacterias fijadas todavía mantienen la capacidad de unirse con las células, la eficacia de la unión de las bacterias de uso era menor que la de las bacterias frescas. Para obtener un efecto de unión comparable para las bacterias fijos, aumentamos la relación de las bacterias a las células de 100:1 a 500:1. Los resultados mostrados en la Figura 4A y S1 indicaron que bacterias fijadas todavía mantienen la especificidad de unión. Por otra parte, después de la comparación con las células de control negativo, la línea celular no tumoral (HLF) con algunas líneas de células tumorales (H460 y Hep-2), la especificidad de unión de las bacterias de uso era mejor que la de las bacterias frescas. Posteriormente, se analizó el cambio en la eficiencia de unión de bacterias fijadas tras el lapso de tiempo. En este experimento, los objetivos elegimos eran bacterias, bacterias frescas recién fijos (día 1) y bacterias fijos almacenados durante 7 días y 30 días. Los resultados (Figura 4B, 4C y 4D) demostraron que las bacterias fijadas todavía mantienen una mayor eficiencia de unión con células incluso después de haber sido almacenado durante 30 días, lo que indica que las bacterias fluorescentes fijos podrían utilizarse para detectar células A549 incluso después de haber sido almacenado durante bastante mucho tiempo.
(a) Porcentaje de fracción de fresco y bacterias péptido fluorescente monoclonales fijos de unión con varias células a partir de datos de FACS. Las células que se unen a las bacterias frescas (negro) en relación 1:100 y se unen a las bacterias fijos (gris) a una relación 1:500. (B) Las imágenes del microscopio de fluorescencia de las células A549 incubación con bacterias frescas y bacterias fijadas en relación 1:500, en el día 1, el día 7 y el día 30 después de la fijación y la barra de escala fue de 20 micras. (C) FACS resultados de las células A549 de unión con las bacterias péptido fluorescente monoclonales frescos y fija en relación 1:500 en diferentes puntos temporales. (D) Porcentaje de fracción de bacterias con péptido fluorescente monoclonales frescos y fijos de unión con células A549 a partir de células de datos de FACS de unión con bacterias frescas y bacterias fijadas en relación 1:500 en diferentes puntos temporales. Los datos fueron la media ± S. D. de al menos tres experimentos independientes.
5. Detección de tejido tumoral A549 del xenoinjerto en ratones con bacterias fluorescentes péptido-
Después de tejido tumoral se incubaron en el xenoinjerto de ratones con bacterias A549 péptido fluorescente monoclonales inducidos (clon 4 y CPX solamente), la sección del tumor en xenoinjerto emite fluorescencia verde porque los péptidos sobre la superficie de bacterias fluorescentes podían reconocer las células tumorales. Sin embargo, la sección de tejido adyacente a la parte tumor incubó con el clon 4 de péptido-bacterias y la sección de tumor incubadas con CPX sólo las bacterias no emitir señales de fluorescencia (Figura 5). Estos resultados podrían ser reproducidos con bacterias péptidos fluorescentes fijos (datos no mostrados).
La barra de escala fue de 20 micras. Los datos eran representativos de al menos tres experimentos independientes.
Discusión
En nuestro estudio, los péptidos de unión específicos para células de cáncer de pulmón fueron identificados con las bacterias método de visualización de la superficie. No hubo secuencias conservadas para aquellos péptidos que indicaban que estos péptidos podrían interactuar con diferentes proteínas en la superficie de las células tumorales. Aunque estos péptidos podrían usarse como moléculas diana para el diagnóstico y tratamiento de cánceres, en este estudio, hemos tratado de explorar el potencial de fluorescencia
E. coli MC1061
, que tenía péptidos específicos en la superficie, trabajó directamente como reactivos de diagnóstico. Los resultados de la
in vitro
experimento indicaron que las bacterias seleccionadas con péptidos en la superficie podrían unirse específicamente con las células A549 con alta afinidad, independientemente de si las células se unen o separan. La capacidad de las bacterias de péptido fluorescente para reconocer ciertas células tumorales se confirmó por experimentos de xenoinjerto de ratones tumorales. Con los resultados de los
in vitro
experimentos, un nuevo método fue desarrollado por primera vez para detectar células de cáncer de pulmón directamente con bacterias fluorescentes. Teniendo en cuenta el tiempo del estante y la seguridad de las bacterias, la manipulación de bacterias vivas era necesario para su posterior aplicación. A través de la comparación del efecto de diferentes reactivos de fijación (etanol, metanol, acetona y 4% de paraformaldehído), 4% de paraformaldehído fue seleccionado como el mejor reactivo de fijación. Las bacterias fijadas con este reactivo podría mantener una alta eficiencia y especificidad de unión a las células durante al menos un mes.
En la práctica clínica y la mesa de trabajo, la mayor parte del tiempo, la tecnología de imágenes se utilizan para el diagnóstico de cáncer de pulmón. Muchas moléculas de imágenes que ya tienen un uso clínico y subclínico, por ejemplo, moléculas radiactivas funcionales para la formación de imágenes PET [26], nuevos materiales magnéticos para la resonancia magnética de imagen [27], nuevos materiales para la formación de imágenes ultrasónicas [28] y las imágenes de PET /RM [29 ]. Incluso ya hay informes acerca de la bacteria como un reactivo bioluminiscente de imágenes en el diagnóstico [30], pero su aplicación fue limitada debido a la escasez de la precisión, la sensibilidad y la fuerza luminiscente de este reactivo de formación de imágenes. Nuestro nuevo sistema nos puede ayudar no sólo para discriminar las células de cáncer de pulmón de otras células, sino también para determinar el género de las células del cáncer de pulmón, lo que hace que este método más preciso para el diagnóstico. En la actualidad, los métodos que se usan clínicamente para determinar el género de células incluyen hematoxilina y eosina (H & amp; E mancha) [31] y la inmunohistoquímica [32], pero estos dos métodos son más complicadas, costosas y subjetiva en comparación con nuestro nuevo método . Con la baja inversión (sólo un microscopio de fluorescencia es necesario) y el tiempo de preparación de muestras, nuestro método proporciona una nueva forma complementaria para la toma de decisiones rápidas y precisas acerca de si los tumores son benignos o malignos, ¿dónde está el borde de la sección del tumor e incluso qué género de tumor tiene el paciente durante las operaciones quirúrgicas [33], [34].
Nuestro estudio presenta un nuevo método para detectar células de cáncer de pulmón directamente con bacterias péptido fluorescente como reactivos luminiscentes
in vitro
. Este método tiene las ventajas de bajo coste, facilidad de obtención, facilidad de ejecución, el tiempo de preparación corto y objetividad. Sin embargo, actualmente no hemos podido dilucidar el mecanismo molecular detallada sobre el proceso de unión entre los péptidos y las células. Por otra parte, todavía necesitamos más muestras clínicas para confirmar la validez de nuestro sistema. A pesar de que, a partir de los resultados experimentales actuales, creemos que este método tiene un enorme potencial como un nuevo medio de diagnóstico clínico. En estudios futuros, se necesita el apoyo de los datos experimentales de masas para promover la traducción de este método desde el banco a la clínica.
Apoyo a la Información
Figura S1. : Resultados de la FACS de varias células de unión de péptidos con bacterias fluorescentes monoclonales fija en relación 1:500.
doi: 10.1371 /journal.pone.0054467.s001 gratis (TIF)
Reconocimientos
Agradecemos al Dr. Vittorio de Franciscis y Laura Cerchia para proporcionar ratones A549 muestras de xenoinjertos de tumores en diapositivas parafina. Se agradece al Dr. Biliang Zhang y Liu Haiyan para proporcionar líneas celulares.