Extracto
Antecedentes
Durante el crecimiento y la supervivencia de las células cancerosas de andrógenos ablación de la próstata 'se convierta en independiente de los mecanismos reguladores normales. Estas células independientes de andrógenos adquieren la notable capacidad de adaptarse a la microambiente que rodea cuyos factores, tales como neurotransmisores, influyen en su supervivencia. Aunque los resultados se están haciendo evidentes sobre la expresión de alfa
1A-adrenérgicos en las células epiteliales de cáncer de próstata, su papel funcional exacta en las células independientes de andrógenos aún no se ha establecido. Trabajos anteriores han demostrado que las balsas de lípidos de membrana asociados a proteínas de señalización claves median el crecimiento y supervivencia de las vías de señalización en las células de cáncer de próstata.
Metodología /Principales conclusiones
Con el fin de analizar la topología de la membrana de la α
1A-adrenoceptores exploramos su presencia mediante un enfoque bioquímico en detergentes purificado fracciones de membrana resistentes de la línea celular de cáncer de próstata independiente de andrógeno-DU145. observaciones de microscopía electrónica demostraron la colocalización de la α
1A-receptores adrenérgicos con la caveolina-1, el principal componente proteico de caveolas. Además, hemos demostrado que la estimulación agonista de la α
1A-adrenoceptores resistencia a la apoptosis inducida thapsigargina-inducido y que la caveolina-1 era necesaria para este proceso. Además, immunohistofluorescence reveló la relación entre los altos niveles de α
1A-receptores adrenérgicos y la caveolina-1 de expresión con cáncer de próstata avanzado. También mostramos por inmunotransferencia que la resistencia a la apoptosis inducida por TG describe en las células DU145 está mediado por quinasas reguladas por señales extracelulares (ERK).
Conclusiones /Importancia
En conclusión, proponemos que α
1A estimulación de los receptores adrenérgicos en células de cáncer de próstata andrógeno-independiente
a través de
caveolas constituye uno de los mecanismos que contribuyen a su protección frente a la apoptosis inducida por TG
Visto:. Katsogiannou M, Boustany CE , Gackiere F, Delcourt P, Athias A, Mariot P, et al. (2009) Las caveolas Contribuir a la resistencia a la apoptosis inducida por la α
1A de los receptores adrenérgicos en células de cáncer de próstata independiente de andrógenos. PLoS ONE 4 (9): e7068. doi: 10.1371 /journal.pone.0007068
Editor: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 2 de Junio, 2009; Aceptado: August 25, 2009; Publicado: 18 Septiembre 2009
Derechos de Autor © 2009 Katsogiannou et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Ministerio francés de Investigación y la Universidad de Lille 1, el INSERM y la región Norte-Paso de Calais, así como la Ligue Nationale Contre le Cancer (Comité du Nord) y la Asociación para la Investigación sobre el cáncer (ARC) . Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata es una de las formas más comunes de cáncer en hombres y la segunda causa de muerte por cáncer en los países industrializados [1]. Varios factores, tales como andrógenos y factores de crecimiento regulan la proliferación de células epiteliales y la apoptosis en el cáncer de próstata y en fase inicial normal de la próstata (CaP). ablación de andrógenos es actualmente la terapia principal usada para bloquear el crecimiento de células cancerosas dependientes de andrógenos. Sin embargo la proliferación y la supervivencia células de CaP 'a menudo se convierten independiente de los mecanismos reguladores que conducen a una enfermedad refractaria a las hormonas [2] para los que actualmente no existe una terapia exitosa. células de CaP independiente de los andrógenos tienen la notable capacidad para adaptarse al microambiente que rodea cuya influencia en las vías de supervivencia intracelular sigue siendo objeto de debate [3]. De hecho, las células de CaP están en contacto con varios factores tales como hormonas, factores de crecimiento y neurotransmisores que se cree que influir en la fisiología de estas células. Entre otros, se ha mostrado interés para el catecolaminas epinefrina y norepinefrina endógena. De hecho, el estroma subepitelial de la próstata es particularmente rica en los nervios autónomos y α
1-adrenoceptores (α
1-AR). El subtipo α
1A-AR, en particular, se encuentra en las células del músculo liso, pero su expresión también se ha descrito en las células epiteliales [4], [5]. La α
1A-AR es un miembro de la superfamilia de los receptores acoplados a la proteína G (GPCR) mediar acciones de las catecolaminas mencionados anteriormente en una variedad de células [6].
α
1 antagonistas -AR ya se utilizan para el tratamiento clínico de la hiperplasia benigna de próstata (BPH) [7], donde su beneficio terapéutico se atribuye a una acción directa sobre α
1-AR presente en la próstata células del músculo liso [8]. Sin embargo, varios estudios han proporcionado pruebas sobre los efectos adicionales de los antagonistas α
1-AR tales como doxazosina en el tratamiento de la HPB a largo plazo. Estos agentes se han demostrado para inhibir el crecimiento de la próstata mediante la inducción de la apoptosis en las células estromales y epiteliales y que surgen como posibles regímenes terapéuticos para la prevención y el tratamiento de CaP independiente de andrógenos [9], [10], [11]. Además, estudios previos de los compañeros de trabajo sobre epitelial cáncer de próstata humano (HPCE) Las pilas y la línea celular de cáncer de próstata dependiente de andrógenos LNCaP mostraron que la fenilefrina (PHE), una α
agonista 1A-AR, estimula su proliferación [12 ], [13]. A pesar de estos resultados prometedores, todavía no se ha establecido el papel funcional de α
1A-AR en células de CaP andrógeno-independientes.
Se ha descrito que la señalización y el tráfico de varios GPCR están regulados por la especializada dominios de la membrana plasmática conocidos como balsas de lípidos [14]. Además, datos recientes sobre cardiomiocitos han demostrado que α
1-AR, así como las moléculas implicadas en su vía de transducción de señales se acumulan en caveolae, una subclase de microdominios de membrana [15], [16]. Caveolae son 50 a 100 nm invaginaciones de membrana de plasma en forma de botella, que se caracteriza por un lado por un alto contenido de colesterol y glicoesfingolípidos y por otra parte por la presencia de caveolina-1 (CAV-1), la proteína constitutiva importante de 20-25 kD [17]. Curiosamente, CAV-1 se ha asociado con muchas enfermedades como la aterosclerosis y la enfermedad de Alzheimer [18], [19]. En cuanto a su papel en el cáncer, se ha establecido que el CP se asocia con mayor CAV-1 de expresión [20]. De hecho, esta proteína se ha identificado como un marcador asociado con la progresión de CaP y de la enfermedad refractaria a las hormonas, que juega un papel determinante en el andrógeno-independencia de células de CaP [21]. Por su asociación con los receptores y enzimas específicos de la membrana plasmática, CAV-1 puede ser un mediador directo de la supervivencia, el crecimiento y metástasis de señales en células de CaP [22].
Hasta la fecha, no se sabe mucho acerca de la mecanismos que subyacen a la participación de los neurotransmisores en la supervivencia de las células de CaP, permiten independiente el papel de α
1A-AR en las células epiteliales independientes de andrógenos y la progresión del CaP. En este sentido, se tiene la tentación de vincular la presencia de α
1A-AR y CAV-1 y la hipótesis de que la α
1A-AR podría mediar
a través de
caveolas sus efectos funcionales sobre el crecimiento o la supervivencia de las células de CaP etapa avanzada.
el objetivo de nuestro trabajo fue, por tanto, para explorar el papel de la α
1A-AR en células de CaP andrógeno-independientes. En este caso, se investiga la presencia de α
1A-AR en las caveolas de las células DU 145, una línea celular de CaP independiente de los andrógenos derivada de la metástasis cerebral. Analizamos la consecuencia de α
estimulación 1A-AR por PHE en el receptor y CAV-1 de distribución de membrana, así como su efecto sobre la composición de lípidos de las fracciones de la balsa de membrana purificadas a partir de células DU145. Además, se describe el efecto de PHE en la resistencia a la apoptosis de estas células a través de la activación de ERK y Nuestros resultados implican fuertemente la implicación de caveolae en esta vía de señalización. Por último, por immunohistofluorescence y RT-PCR, se observa una correlación positiva de α
expresión 1A-AR y CAV-1 y CaP en estadio avanzado. La presencia de α
caveolas 1A-AR-rico podría, por tanto, contribuir a la resistencia a la apoptosis generalizada que caracteriza el tejido prostático independiente de andrógenos.
Métodos
Cultivo de células
La línea celular de cáncer de próstata humano independiente de andrógenos DU145, obtenido de la American Type Culture Collection, se mantuvo en cultivo en medio RPMI 1640 (Life Technologies, Inc), suplementado con 10% (v /v) de FCS (Seromed, Poly-Labo, Estrasburgo , Francia), 5 mM de L-glutamina y kanamicina 2 mM (Sigma). Las células fueron cultivadas rutinariamente en matraces de 50 ml (Nunc, Polylabo, Estrasburgo, Francia) a 37 ° C en un humidificado 5% de CO
2-95% atmósfera de aire. Estas células constituyen un modelo adecuado para cerebrales metastásico células cancerosas presentes en el cáncer de próstata refractario a las hormonas.
transfecciones celulares y la generación de CAV-1 knock-down línea celular DU145
Dos listos para el utilizar siRNAs contra α
1A-AR (siADR1A, Eurogentec) se transfectaron transitoriamente (50 nM) con HiPerfect reactivo de transfección (Qiagen) en las células DU145. Control de siRNA (siCTL) los experimentos se realizaron mediante la transfección de siRNA contra luciferasa
siLuciferase (siCTL):. 5'-CUUACGCUGAGUACUUCGA-3 '. siADR1A-1 (mezcla de): 5'-CAGGAAAGAUGCAGAGGA-3 'y 5'-UUCCUCUGCAUCUUUCCU-3'. siADR1A-2 (mezcla de):. 5'-GCGUCUACGUGGUGGCCA-3 'y 5'-UUGGCCACCACGUAGACG-3'
Las líneas celulares estables se obtuvieron mediante la transfección de células DU145 con un ARN pSUPER vector de codificación corto horquilla (shRNA) contra CAV-1 (secuencia: CTGGAATAAGTTCAAATTCTT 2121 3'UTR) (DUshcav-1) (o vector pSUPER vacío para control de línea celular, DUshCTL) usando Nucleofector, según lo recomendado por el fabricante (Amaxa GmbH, Köln, Alemania). Estamos transfectadas 2 × 10
6 células DU145 tratados con tripsina con 3 g de vector y luego se usa las células transfectadas para sembrar una placa de 24 pocillos (Nunc) a muy baja densidad. Los clones fueron seleccionados underexpressing CAV-1 sobre la base de su resistencia a los antibióticos a puromycine y validados por Western Blot.
Los anticuerpos y reactivos
Los anticuerpos primarios utilizados para inmunofluorescencia (IF) y microscopía de inmunotransferencia (IB ) fueron los siguientes: (1:100) de conejo anti-α
1A adrenérgico (Santa Cruz Biotechnology), (1:100) de conejo anti-caveolina-1 (Santa Cruz Biotechnology), (1:50) de ratón anti-caveolin- 1 (Laboratorios de transducción de BD), (1:400) de ratón anti-β-actina (Sigma), (1:200) anti-calnexina (Chemicon, Millipore, París, Francia), (1:1000) de ratón anti-citoqueratina 18 (Chemicon, Millipore, París, Francia), (1:1000) de conejo anti-PARP (Señalización celular), (1:100) de ratón anti-Bax (6A7) (Santa Cruz Biotechnology) que reconoce un epítopo expuesto de Bax en la activa conformación, (1:1000) de conejo anti-procaspasa 3 (Upstate), (1:1000) anti-fosfo-p44 /42 MAP quinasa y (1:1000) anti-p44 /42 MAP quinasa (Cell Signaling). Los anticuerpos secundarios utilizados para IB fueron: (1:10000) peroxidasa de rábano picante vinculado anti-ratón o anti-conejo (Chemicon). Ciertamente, si utilizamos (1:1000) Alexa Fluor ® 488-etiquetados y anticuerpos secundarios (1:2000) 546-etiquetados (Molecular Probes).
Las células fueron tratadas con 10 mM L-clorhidrato de fenilefrina (PHE ), 1 prazosin mu M (PRA) y 10 PD98059 mu M durante tres días (renovado cada 24 h) y 10 mM tapsigargina (TG) durante 48 horas en medio RPMI. PHE tratamientos a corto plazo se realizaron en una solución que contenía (mM): NaCl, 116; KCl, 5,6; CaCl
2, 1,8; MgCl
2, 1.2; NaHCO
3, 5; NaH
2 PO
4, 1; HEPES, 20; pH 7,3. Todos los productos químicos fueron suministrados por Sigma excepto TG (Alomone) y PD98059 (Calbiochem).
ciclo celular análisis
Las células se cultivaron en tres placas de 60 mm por condición y los fármacos se aplicaron como se describe encima. Después de los tratamientos, se tripsinizaron las células, se recogieron y se resuspendieron en 0,2 ml de PBS estéril. se añadió 1 ml de etanol frío al 70% en suspensiones de células mientras vórtex. Las muestras se centrifugaron, se lavaron en PBS estéril y después se incubaron con ribonucleasa (2 mg /ml) durante 15 min. Después, se añadió yoduro de propidio (25 mg /ml final en PBS-Triton X-100 0,1%) y se dejó incubar durante 30 min adicionales. contenido de ADN se midió mediante la excitación de yoduro de propidio a 488 nm y midiendo la emisión a 520 nm (FL3) utilizando un citómetro de flujo (Beckman Coulter Epopeyas XL4-MCL con la adquisición Expo32). Los experimentos se repitieron cuatro veces.
Western Blot
El medio de cultivo de células se descartó y los matraces se lavaron con PBS helado. Las proteínas celulares se extrajeron utilizando tampón RIPA [1% (v /v) de Triton X-100, 1% (w /v) de desoxicolato de Na, NaCl 150 mM y 20 mM de fosfato de sodio o de potasio, pH 7,2] con EDTA 5 mM y cóctel anti-proteasas (P8340; Sigma) durante 30 min en hielo. Después de raspar, cualquier material insoluble se eliminó por centrifugación a 30000 x
g
durante 10 min a 4 ° C y la cantidad de proteína se evaluó mediante el método de BCA (Pierce Chemical Company, Rockford, IL, EE.UU.). Igual cantidad de proteínas se sometieron a SDS /PAGE (16% de geles). Finalmente, las proteínas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa sobre usando un electro-blotter semi-seco (Bio-Rad). Después de 1 h de saturación en la leche no grasa 5% (o 5% de BSA (albúmina de suero bovino) solamente para anti-fosfo-p44 /42 MAPK), las membranas se incubaron durante la noche con anticuerpos primarios diluidos (ver "anticuerpos y reactivos"). A continuación, las membranas se lavaron (3 x 10 min) con un tampón de TNT (15 mM Tris /HCl, pH 8, NaCl 140 mM y 0,05% de Tween 20) y se trataron con los anticuerpos secundarios peroxidasa ligada correspondiente de rábano picante (anti-ratón o anti-conejo, Pierce), (1:10000) diluido en TNT /leche (o TNT /BSA) durante 1 h a temperatura ambiente. Después de varios lavados en tampón TNT, las membranas se procesaron para la detección de quimioluminiscencia usando el sustrato quimioluminiscente Super Señal West Dura (Pierce) según las instrucciones del fabricante. Las membranas fueron finalmente expuestos a películas X-OMAT AR (Eastman Kodak Company, Rochester, NY, EE.UU.). La intensidad de las señales se evaluó mediante densitometría y semi-cuantificado utilizando la relación de cada muestra entre la intensidad de proteína de interés dividida por la intensidad de la actina o calnexina. Cada experimento se repitió al menos dos veces.
Aislamiento de detergente resistentes membranas (DRM) y Dot blot
Las células fueron lavadas, desguazados, se centrifugaron y se eliminó el sobrenadante. El sedimento se resuspendió con tampón de aislamiento B (de acuerdo a la Hoja de Axis-Shield Aplicación S33) y se homogeneizó con un homogeneizador Dounce (Kontes) de 15 micras aclaramiento mano de mortero y después se centrifuga durante 10 min a 1000 ×
g
. El sobrenadante correspondiente a extracto de lípidos balsa bruto se aisló y se añadió 0,2% de Triton X-100. A 5-paso discontinua Optiprep® (Axis-Shield PoC AS) gradiente se formó con tampón D (tampón B + 1% de Triton X-100) (w /v) con el fin de obtener 1,66 ml de 35%; 2,5 ml de 20%; 2,5 ml de 15%; 2,5 ml 10%; 0,83 ml de 5%. Crudo extracto de balsa de lípidos se hizo denso con sacarosa (230 mg por 0,5 ml de lisado) y puso en la interfase entre gradientes de 35% y 20%. Ultracentrifugación a 165400 x
g
durante 4 horas a 4 ° C en 50 rotor Ti (Beckman Coulter) fue seguido por la recolección de abajo hacia arriba de 1,1 ml de fracciones. 1,1 ml de 20% (v /v) TCA (ácido tricloroacético) se añadió a cada fracción con el fin de precipitar las proteínas. Los tubos se mantuvieron en hielo durante 20 min se centrifuga a 10000 ×
g
a 4 ° C durante 10 minutos. El precipitado se lavó con metanol, se centrifugaron a continuación, volver a suspender en 4% (v /v) SDS. Dado que las muestras no estaban muy concentradas en proteínas y detección por inmunotransferencia de tipo Western clásica era difícil de obtener, las muestras se cargaron en membrana de nitrocelulosa en un pozo de 96 unidad de Dot-Blot de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Bio-Rad). En pocas palabras, los diez fracciones fueron vistos sobre una membrana de nitrocelulosa en serie. Una vez seco, la membrana se incubó en solución de bloqueo durante 1 h (TNT /leche) a continuación, se hibridaron con los anticuerpos deseados siguiente procedimiento IB clásico tal como se describe anteriormente (véase el "Western Blot"). Precauciones fueron tomadas en consecuencia mantener constante para las condiciones de tratados y no tratados algunos factores importantes. La densidad de células utilizado para los experimentos fue constante y cuando la extracción con detergente en frío se llevó a cabo tanto la concentración del detergente y la relación de la concentración del número de células /detergente eran los mismos. Cada pocillo se cargó con 25 l de cada fracción. Este método estandarizado se repitió al menos tres veces y se utilizó para evaluar los cambios en la partición de una molécula diana en DRM, evitando falsas estimaciones cuando se basa en las cantidades relativas con respecto a todas las otras moléculas presentes.
La cuantificación de fosfatidilcolina (PC) y esfingomielina (SM)
los lípidos se extrajeron de acuerdo con el método de Folch et al. [23]. Dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC Sigma), dimyristoylphosphatidylserine (DMPS Avanti Polar Lipids), lauroylsphingomyelin (LSM Avanti Polar Lipids) se utilizaron como patrones internos. análisis de fosfolípidos se realizó en una columna Hypersil mm Si 2 × 200 (Agilent Technologies, Massy, Francia) siguiendo el protocolo [24]. Positivo ESI-MS se realizó en un MSD 1100 Espectrómetro de Masas (Agilent Technologies). El voltaje de orificio se fijó en 120 V, la tensión capilar a 3,5 kV, el gas de secado (nitrógeno) fluye a 8 l /min y el rango de escaneado desde m /z 400 a 950. pico integrado fueron a partir extraídos de iones cromatogramas (EIC) para m /z = 700 a 950 en el tiempo de retención (RT) de PC, PS, SM se divide por el EIC para m /z = 679 en la RT de DMPC, m /z = 681 en la RT de DMPS o m /z = 647 en la RT de LSM. Los niveles se determinaron por comparación de esta relación con una curva patrón de cantidades conocidas de fosfatidilcolina y esfingomielina.
cuantificación de colesterol
Extracción y saponificación se realizaron de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente [25] con algunas modificaciones. La cuantificación de colesterol se realizó usando un HP6890 cromatógrafo de gases equipado con un inyector HP7683 y un detector selectivo de masas HP5973 (Agilent Technologies). La cromatografía se realiza usando un HP-5MS columna capilar de sílice (30 mx 0,25 mm de diámetro interno, 0,25 m de espesor de película, Agilent Technologies) fusionada. Se utilizó un programa de seguimiento de iones seleccionados para la espectrometría de masas. Los iones utilizados para el análisis (m /z) fueron los siguientes: epicoprostanol, 370; colesterol, 368. Las curvas de calibración se obtuvieron mediante el análisis de los estándares preparados a partir de patrones auténticos (Steraloids) y se extrajo con el método utilizado para las muestras
.
Los protocolos de cuantificación anteriores para lípidos y el colesterol se repitieron tres veces para tres experimentos individuales en no tratado (control) y las células DU145 tratadas con PHE por 10 min. Como las cantidades de lípidos y colesterol cuantificadas en cada fracción (ng /ml o g /ml) varió ligeramente entre los experimentos, los resultados se normalizaron mediante la determinación de los valores medios de los tres experimentos representado por el porcentaje de lípidos y colesterol en cada fracción en condiciones de control en comparación con las condiciones de PHE-tratada.
membrana plasmática "Rip Off"
Este método se basa en un protocolo publicado [26]. Las células fueron cultivadas en cubreobjetos de vidrio. Formvar® recubiertas de rejillas de cobre (de acuerdo con [27]) fueron recubiertas con polilisina. Los cubreobjetos se colocaron las células hacia abajo sobre las rejillas y una ligera presión se ejerció usando un tapón de caucho a continuación, los cubreobjetos fueron puestos y las rejillas fueron cuidadosamente Independiente después se fijaron en 8% (v /v) PFA (paraformaldehído). Después de lavar en PBS y la saturación en PBS /2,5 mM, glicina /burro immunolabelling suero se llevó a cabo de acuerdo con técnicas estándar, utilizando anticuerpos primarios seguidos de especies específicas de los conjugados de anti IgG de oro de 6 nm, 12 nm y 18 nm. Finalmente, las redes fueron contrastadas y se prepararon para la observación en un microscopio electrónico de transmisión Hitachi H-600 (aumento x 20 000) a 75 kV.
ultraestructural Microscopía
Para la microscopía electrónica de transmisión, las células fueron fijadas en 2,5% de glutaraldehído preparó en 0,1 M de cacodilato de tampón y después de la fijada en 1% de tetróxido de osmio en el mismo tampón. Después de la deshidratación acetonitrilo, el sedimento se incrusta en Epon. secciones delgadas de serie (90 nm) fueron cortadas utilizando un ultramicrotomo Reichert Ultracut E y se recogieron en 150 hexagonales de malla rejillas de cobre con barrotes. Después de la tinción con acetato de uranilo al 2% preparado en 50% de etanol y la incubación con una solución de citrato de plomo, se observaron las secciones en un microscopio electrónico de transmisión Hitachi H-600.
Inmunofluorescencia indirecta
muestras de resección de BPH de próstata humana congelada en isopentano enfriado con nitrógeno líquido y se mantiene en "Tissue-Tek" a -80 ° C antes de 10 micras secciones se prepararon a -20 ° C con un criostato, se montaron sobre portaobjetos de vidrio y procedió a IF estudio. tejidos prostáticos normales y cancerosas han sido facilitadas por las diapositivas de tejido-array (SuperBioChips Laboratories), deparaffinized de acuerdo a las indicaciones del fabricante (Cliniscience) antes de la preparación de SI de acuerdo con [28]. En pocas palabras, todos los portaobjetos se bloquearon durante 30 min con PBS /1.2% (v /v) de gelatina después se incubaron con anticuerpos primarios deseados durante 1 hora a 37 ° C y luego con anticuerpos secundarios (1 h, 37 ° C). Imaging se realizó utilizando Zeiss LSM 510 cabeza confocal (Carl Zeiss) conectado a un microscopio Zeiss Axiovert 200 M con una lente de objetivo × 40 de inmersión en aceite (apertura numérica 1,45). Las láminas fueron escaneados utilizando un láser de iones de argón y un láser de iones de helio /neón. Todos los parámetros de escaneado se mantuvieron constantes a lo largo de los diferentes experimentos. AIM 3.2 software microscopio confocal (Carl Zeiss) se utilizó para la adquisición y análisis de datos.
RT-PCR
transcripción inversa-PCR se llevó a cabo como se describe anteriormente [29]. El 178 pb α
1A-AR isoforma 1 amplicón se amplificó con 5'-AGACCAATCCTCCTGTACCAC-3 '(hacia delante) y 5'-CTCTGCATCTTTCATGTCCTAG-3' (hacia atrás). El 220 pb CAV-1 amplicón se amplificó con 5'-AGTGCTCCTGTTCTCCCTTC-3 '(hacia delante) y 5'-CTTGTCGATGGCTTCCTTCAC-3' (hacia atrás) (Eurogentec). El control interno GAPDH amplicón 236 pb se amplificó con 5'-TTCACCACCATGGAGAAGGC-3 '(hacia delante) y 5'-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3' (hacia atrás). El 241 pb citoqueratina 18 amplicón se amplificó con 5'-TGAGTCAGAGCTGGCACAGA-3 '(hacia delante) y 5'-TGGTGTCATTGGTCTCAGACA-3' (hacia atrás). Por último, los 210 pb citoqueratina 14 amplicón se amplificó con 5'-TGCGAGATGGAGCAGCAGAA-3 '(hacia delante) y 5'-TGCCATCGTGCACATCCATGA-3' (hacia atrás). alfa
1A-AR, cav-1, citoqueratina 14 y 18 de ARNm expresiones fueron validados por análisis de la densidad del gel mediante el uso de ARNm de GAPDH como control interno.
muestras de tejido humano
biopsias BPH Humano fueron obtenidos de pacientes que consienten siguiendo las consideraciones éticas locales. Todos los experimentos con tejidos del paciente se llevaron a cabo con el número de aprobación 'CP 01/33', emitido por los 'del Comité Consultivo Internacional de protection des Personnes dans Investigaciones Biomédicas de Lille ».
El análisis estadístico
los resultados se expresaron como la media ± SEM. El análisis estadístico se realizó utilizando desapareado
t
pruebas (para la comparación de dos grupos) o el análisis de las pruebas de varianza, seguido de Dunnett (para el control de múltiples
frente
comparaciones de prueba). Las diferencias se consideraron significativas cuando
p Hotel & lt; 0,05 (*),
p Hotel & lt; 0,01 (**) y
p Hotel & lt; 0,001 (***).
: Resultados de la
α
1A-AR se asocia con CAV-1 en la superficie celular DU145
estudios previos han descrito una interacción directa de α
1A -AR con CAV-1 [15]. Por otra parte, α
señalización 1A-AR se conoce para localizar en caveolae [14], [30]. Para explorar la topología de la membrana de α
1A-AR, se utilizó la técnica de "estafa", desarrollado en células adherentes que permiten el aislamiento y la observación por microscopía electrónica de grandes superficies de la membrana plasmática [26]. α
1A-AR tinción inmunoelectrónica (6 puntos nm, punta de flecha negro) colocalizes con CAV-1 (18 puntos nm, punta de flecha blanca) en microdominios de membrana plasmática de aproximadamente 50-100 nm (Figura 1).
las membranas plasmáticas fueron "off-rasgado" tal como se describe en la sección "Métodos" y se incubó con anti-CAV-1 y anti-α
anticuerpos 1A-AR. Los anticuerpos secundarios acoplados con 6 nm y 18 nm partículas de oro fueron utilizados en contra de anti-α
1A-AR (punta de flecha negro) y anti-CAV-1 (punta de flecha blanca), respectivamente. Las rejillas se procesaron a continuación para la observación de microscopía electrónica. Colocalización de ambas proteínas se indica por los círculos. Bar, 200 nm.
plasmáticas de proteínas de membrana de redistribución y composición lipídica alteraciones en fracciones DRM inducidas por fenilefrina
Análisis de microdominios de membrana plasmática, caveolas o la composición de lípidos balsa normalmente comienza con la solubilización de detergente de células enteras, seguido de centrifugación en gradiente de densidad y recuperación de DRM de fracciones ligeras del gradiente. Hemos investigado la asociación de α
1A-AR con DRM purificada a partir de extractos de membrana de células DU145 entero sobre un gradiente de densidad OptiPrep®. Para la caracterización de las fracciones DRM, la presencia de una membrana de plasma cadherina específica pan marcador se evaluó primero como control positivo (Figura 2A, a). Su presencia en las 10 fracciones purificadas demuestra que las fracciones aisladas de DRM corresponden a regiones de la membrana plasmática. Además, el PCNA nuclear proteína (antígeno nuclear de proliferación celular) y la bax proteína mitocondrial se utilizaron como controles negativos, ya que se conocen no asociarse con la membrana de plasma. Su ausencia en las fracciones DRM valida la ausencia de contaminación por las membranas intracelulares (Figura 2A, a).
(A) fracciones de DRM del aumento de la densidad (de la fracción 1 a 10) obtenido como se indica en "Métodos" sección y analizada por Dot blot. (A) Pan cadherina se utilizó como control positivo confirmando que las fracciones obtenidas corresponden a la membrana de plasma. PCNA (antígeno nuclear de proliferación celular) y Bax se utilizaron como controles negativos, su ausencia de confirmar la ausencia de contaminación de las fracciones DRM por las proteínas intracelulares no se sabe están asociados con balsas. (B) Dot blot de la recogida de la fracción DRM en condición de control (CTL) y 10 min de tratamiento con 10 mM fenilefrina (PHE). P2Y2 receptor purinérgico se utilizó como control negativo de la especificidad del efecto de la fenilefrina en la redistribución de proteínas en fracciones. rectángulo negro marca el cambio de α
1A-AR, CAV-1 y la proteína Gα
q11 a las fracciones de menor densidad. composición (B) de los lípidos de las 10 fracciones se cuantificó como se describe en la sección "Métodos" en el control (columna negro) y las células PHE tratados (columnas grises) para (a) lisofosfatidilcolina (LPC), (b) la fosfatidilcolina (PC), (c) la esfingomielina (SM), (d) colesterol. Las barras de error representan SEM calculan a partir de tres experimentos independientes. El análisis estadístico utilizó el
t
prueba; *,
p Hotel & lt; 0,05, **,
p Hotel & lt; 0,01 y ***,
p
. & Lt; 0,001
con el fin de determinar si microdominios previamente definidos están involucrados en la α
vía de señalización 1A-AR en las células DU145, hemos examinado α
estimulación 1A-AR por su agonista específico fenilefrina (PHE). análisis de transferencia puntual de DRM fracciones reveló la distribución de la CAV-1 en gradiente de densidad baja (5% -20%) las fracciones 1-6 y α
1A-AR en las fracciones 1 y 3-6 en el control (CTL) condiciones. Después del tratamiento de 10 minutos por 10 M PHE distribución CAV-1 se observó en gradiente de baja densidad (5% -10%) las fracciones 1-5 y α
1A-AR se detecta ahora en todas las fracciones 1-6 (incluyendo baja densidad la fracción 2) (Figura 2 A, B, panel superior CTL; PHE inferior del panel). Es importante destacar que los contenidos Gα
q11 (un α
1A-AR efector) mostraron un cambio de las fracciones 4-5 a las fracciones 1 a 5 después del tratamiento PHE y permanecen presentes en fracciones de mayor densidad, lo que sugiere que la activación del receptor no implica todas las proteínas Gα
Q11 presentes a nivel de la membrana. También se evaluó la P2Y2 receptor purinérgico utilizado como control negativo de la especificidad de la modificación en la distribución de la proteína inducida por PHE. α
1A-AR y P2Y2 son ambos GPCR comparten vías de señalización similares. P2Y2 se encuentra en las mismas fracciones si las células DU145 fueron tratados o no (Figura 2 A, B, CTL y PHE), por lo que demuestra la especificidad de la distribución proteína modificada PHE inducida observado anteriormente.
Además, estábamos interesado en la composición lipídica de las fracciones purificadas DRM. Los lípidos que se sabe que ser enriquecido en balsas de lípidos biológicos, tales como lisofosfatidilcolina (LPC), esfingomielina (SM), fosfatidilcolina (PC) y colesterol [31], se analizaron [32]. Una vez más, hemos investigado las posibles alteraciones de la composición lipídica de las fracciones DRM después de la estimulación PHE. Nuestras observaciones muestran un aumento significativo en las cantidades de estos lípidos principalmente en gradiente de baja densidad (5% -10%) las fracciones 1 a 5 como resultado de la estimulación PHE (Figura 2B, a, b, c, d). Estos resultados están de acuerdo con el hecho bien establecido de que el alto contenido de lípidos provoca flotante de microdominios de lípidos en las fracciones de baja densidad durante la centrifugación. los datos publicados anteriormente en sistemas modelo de lípidos muestran que el tamaño de las balsas de lípidos depende de la composición de la membrana de lípidos [33], [34]. Las alteraciones observadas en las composiciones de lípidos debido a la reorganización de la membrana puede dar cuenta de microdominios de menor densidad que resulta en la redistribución de la α
1A-AR, CAV-1 y Gαq
11 observado en fracciones DRM.
Proteína y la reorganización de los lípidos inducida por fenilefrina se asocia con CAV-1-rica agrupación membrana
se cree que al estímulo extracelular, de la membrana plasmática se prepara para la formación de dominios más estabilizadas y cúmulos moleculares con mayor tamaño y la vida útil como caveolae [35], [36]. Con el fin de entender la participación de caveolae en el α
señalización 1A-AR, hemos explorado el efecto de la estimulación PHE en la superficie celular DU145 morfología (Figura 3A). Células tratadas durante 10 minutos con 10 mM PHE presentan numerosas invaginaciones de la superficie correspondiente a caveolas (Figura 3A, B) en comparación con células no tratadas (Figura 3A, a). Caveolas son evidentes como perfiles circulares con forma uniforme y 50-80 nm de diámetro. En este caveolas micrografía electrónica representativa están presentes como pozos individuales (Figura 3a, b, puntas de flecha negras) ya veces en los arreglos más complejos interconectados con perfiles citoplasmáticos caveolar (Figura 3A, B, puntas de flecha blancas).
(A) micrografía electrónica de Representante de células DU145 en (a) estado no tratado (b) después del tratamiento 10 min por 10 M PHE. Caveolas y caveolina vesículas que contienen de 50-80 nm de diámetro son densos en electrones se indican mediante puntas de flecha negras. puntas de flechas blancas indican las caveolas en forma compleja.