Extracto
Antecedentes
ciglitazona pertenece a la clase de las tiazolidinedionas de la familia medicamentosa y es un ligando de alta afinidad para el activado por proliferadores de peroxisomas receptor γ (PPAR?). Aparte de su actividad antidiabética, esta molécula muestra eficacia antineoplásica en numerosas líneas celulares de cáncer.
Metodología /Principales conclusiones
Uso RT4 (derivado de un bien diferenciado de grado I papilar del tumor) y T24 (derivados a partir de un carcinoma de células indiferenciadas) de cáncer de vejiga de grado III, se investigó el potencial de ciglitazona para inducir la muerte celular por apoptosis y caracterizaron los mecanismos moleculares implicados. En las células RT4, la G2 detención del ciclo celular inducida por drogas /M caracteriza por una sobreexpresión de p53, p21
WAF1 /CIP1 y p27
Kip1 coincidiendo con una disminución de la ciclina B1. Por el contrario, en las células T24, que desencadena apoptosis
vía
vías extrínseca e intrínseca. la detención del ciclo celular y la inducción de la apoptosis se produjeron a concentraciones elevadas a través de las vías de activación independiente de PPAR. Se demuestra que
in vivo
tratamiento de ratones desnudos por ciglitazona inhibe el desarrollo de xenoinjerto de cáncer de vejiga de alto grado. Hemos identificado un nuevo mecanismo por el cual ciglitazona mata las células cancerosas. Ciglitazona hasta reguladas TRAIL soluble y unida a la membrana y dejar que las células T24 resistente a TRAIL para responder a sendero a través de la activación de caspasas, la muerte del receptor vía de señalización y la escisión de la subasta. Nos presentó pruebas de que la apoptosis inducida por TRAIL es impulsado en parte por ciglitazona mediada baja regulación de los niveles de c-FLIP y proteína survivina a través de un mecanismo de degradación del proteasoma dependiente.
Conclusiones /Importancia
Por lo tanto , ciglitazona podría ser clínicamente relevante como quimiopreventivo o agente terapéutico para el tratamiento de cánceres uroteliales de alto grado TRAIL-refractario
Visto:. Plissonnier ML, Fauconnet S, Bittard H, Lascombe I (2011) el antidiabético Drogas ciglitazona induce las células de alto grado del cáncer de vejiga la apoptosis a través de la regulación de TRAIL. PLoS ONE 6 (12): e28354. doi: 10.1371 /journal.pone.0028354
Editor: Laszlo Buday, Academia de Ciencias de Hungría, Hungría
Recibido: 16 Agosto, 2011; Aceptado: 7 de noviembre de 2011; Publicado: December 12, 2011
Derechos de Autor © 2011 Plissonnier et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de investigación de la Ligue Nationale Contre le Cancer (Comité du Doubs). M. L. Plissonnier fue apoyado por una beca de la Cancéropôle du Grand-Est. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el carcinoma urotelial de las cuentas de la vejiga para ~ 5% de todas las muertes por cáncer en los seres humanos. La mayoría de los tumores de vejiga (75%) son no músculo invasivo en el diagnóstico y después de la terapia quirúrgica local, tienen un alto riesgo de recurrencia y una propensión al progreso en el grado o etapa [1]. tumores invasivos del músculo (25%) tienen un peor pronóstico [2] ya que el 50% de los pacientes con recaída de la enfermedad metastásica dentro de los 2 años de tratamiento. A pesar de los avances con la cirugía y la inmunoterapia y quimioterapia intravesical en el tratamiento de los pacientes y, aunque los nuevos agentes quimioterapéuticos (inhibidores de la tirosina quinasa, agentes anti-angiogénicos ...) se utilizan, se ha observado ninguna mejora en la supervivencia. Por lo tanto, el desarrollo de nuevos regímenes quimioterapéuticos eficaces y con menos efectos secundarios son sin duda necesarios para disminuir la morbilidad y la mortalidad de carcinoma urotelial.
Las tiazolidinedionas (TZD), incluyendo la rosiglitazona, troglitazona, pioglitazona y ciglitazona son una clase de insulina sensibilizar a las drogas. Además, la rosiglitazona y la pioglitazona están actualmente en uso clínico para el tratamiento de la diabetes tipo II para millones de pacientes. Estos TZD son ligandos de alta afinidad de síntesis química de activado por proliferadores de peroxisomas receptor γ (PPAR?) [3], [4]. PPAR es un factor de transcripción activado por ligandos de la superfamilia de receptores hormonales nucleares. Además de su papel conocido en la regulación del metabolismo y la inflamación, PPAR también se ha implicado en la carcinogénesis basado en estudios que demuestran su capacidad para modular la diferenciación celular, proliferación y apoptosis. Aparte de su actividad antidiabética, TZD suscitar efectos inhibidores del crecimiento
in vitro
en las células cancerosas de orígenes diversos tejidos y
in vivo
[5]. Pocos estudios indican que la pioglitazona o troglitazona exhibieron actividades antiproliferativas o pro-apoptóticos contra líneas celulares de cáncer de vejiga [6] - [9] y en el urotelio de rata [10]. Sólo un estudio informó que ciglitazona exhibe efectos inhibidores sobre el número de células en una serie de líneas celulares de carcinoma de células transicionales de modelado metastásico de la vejiga (TSU-Pr1, TSU-Pr1-B1 y TSU-Pr1-B2) [6].
la apoptosis se produce
a través de dos mecanismos separados
todavía interrelacionadas de señalización: la vía del receptor inducida por la muerte extrínseca activada por las señales de los receptores de pro-apoptóticos en la superficie celular, y la vía intrínseca mitocondrias mediada activadas por señales mitocondriales desde dentro de la celular [11]. Los principales mediadores de la apoptosis son las caspasas, una familia de cisteína proteasas que escinden un conjunto crítico de las proteínas celulares cerca de residuos de ácido aspártico específicos.
Entre los posibles tratamientos efectivos contra el cáncer, TRAIL (ligando apoptosis relacionados con la inducción TNFa) es una agente antineoplásico prometedor debido a que induce apoptosis en células de cáncer con sólo un efecto insignificante sobre las células normales [12]. TRAIL desencadena la cascada de caspasas
a través de la vía apoptótica
extrínseca través de la interacción con receptores de TRAIL-sensible de muerte (DR), tales como DR4 y DR5, lo que lleva a la formación de la muerte de inducción de complejo de señalización (DISC), el reclutamiento y la rápida activación de la caspasa 8. en el tipo I las células, inducida por TRAIL-R caspasa-8 activación resulta directamente en la activación de caspasas y apoptosis aguas abajo, mientras que en las células tipo II caspasa-8 de activación es ineficaz y la señal debe ser amplificada a través de caspasa 8-escisión de la proteína Bid pro-apoptótica y la activación de la vía apoptótica mitocondrial [13] a través de la activación de caspasa 9. Ambos caspasas 8 y 9 activan la caspasa ejecutor 3, que es el activador primario de la fragmentación del ADN de apoptosis y conduce a la apoptosis de células de cáncer [14].
survivina y la proteína FLICE inhibidora celular (c-FLIP) son aguas abajo y aguas arriba reguladores anti-apoptóticos de la cascada de señalización de apoptosis, respectivamente.
al igual que otros inhibidores de la apoptosis (IAP), survivina actúa aguas abajo de la mitocondria para prevenir el procesamiento o la activación del iniciador de la caspasa-9, conduce a la inhibición de la actividad de las caspasas efectoras. Sin embargo, el papel de la survivina no se limita a la inhibición de la apoptosis, pero también implica la regulación de la división celular [15]. C-FLIP es la principal proteína que impide la activación de la caspasa 8 de receptores de muerte por medio de la unión al dominio de muerte asociado a Fas y la caspasa 8 en el disco. Aunque se han descrito múltiples isoformas de empalme de ARNm de c-FLIP, sólo dos de ellos, c-FLIP
S y c-FLIP
L, se han estudiado de manera significativa a nivel de proteínas. Ambas proteínas pueden ser reclutados para el complejo de señalización induce a la muerte e inhiben la muerte mediada por el receptor de la apoptosis [16]. Tanto c-FLIP
L y c-FLIP
S son proteínas rápido volumen de negocios; por lo tanto, sus niveles están sujetos a regulación por la ubiquitina /proteasoma mediada por la degradación [17], [18].
Los resultados de estudios preclínicos con TRAIL recombinante han demostrado sus actividades antitumorales significativos, lo que indica el potencial de utilizar TRAIL como un agente contra el cáncer [19]. A pesar de este papel proapoptótico de TRAIL en las células transformadas, muchas células cancerosas desarrollan resistencia a la apoptosis inducida por TRAIL. Por lo tanto, se ha informado de que las líneas celulares del cáncer de vejiga, tales como T24 y HT1376, son resistente a TRAIL [20]. La identificación de fármacos o agentes que pueden superar la resistencia RUTA y sensibilizar a las células cancerosas hacia la apoptosis inducida por TRAIL es por lo tanto de importancia crítica para atacar a las células cancerosas resistentes a TRAIL. La combinación de TRAIL con la radiación y algunos agentes quimioterapéuticos [21], [22] han proporcionado un éxito limitado, ya que esta combinación también dio como resultado un aumento de la toxicidad sistémica.
El presente estudio informó de los efectos de la ciglitazona en RT4 (derivado de un bien diferenciado de grado I del tumor papilar) y T24 (derivado de un carcinoma indiferenciado de grado III) líneas celulares de cáncer de vejiga. La elección de estos en particular líneas celulares de cáncer de vejiga es relevante ya que en las células RT4, P53 es de tipo salvaje y el marcador mesenquimal N-cadherina no se expresa mientras se detecta el marcador de E-cadherina epitelial. Inversamente, en las células T24, P53 está mutado y E-cadherina está ausente y se sustituye por N-cadherina [23]. Por lo tanto, dependiendo del estado diferenciado de las células, se demostró que el tratamiento individual ciglitazona inducida G2 detención del ciclo celular de fase /M pero desencadena la apoptosis sólo en células de cáncer de vejiga T24 de alto grado a través de mecanismos de activación independiente de PPAR. Además, por primera vez, a nuestro conocimiento, el tratamiento de ratones desnudos por ciglitazona entorpece seriamente el crecimiento de xenoinjertos de tumores de vejiga de alto grado que confirma nuestros
in vitro
resultados. Lo más interesante es la combinación de ciglitazona y TRAIL muestra que deje ciglitazona células T24-TRAIL refractaria para responder a TRAIL. Por primera vez en células de cáncer de vejiga, que reveló que ciglitazona mediada sobre regulación de TRAIL y una marcada disminución de c-FLIP y survivina mediada, en parte, a través de un proceso de degradación proteosomal contribuyen a ciglitazona inducida por la muerte celular y para el efecto sensibilizante de esta TZD sobre la apoptosis inducida por TRAIL.
Resultados
bloques ciglitazona RT4 (de bajo grado) y T24 (alto grado) las células en la fase G2 /M, pero induce la apoptosis sólo en células T24 a través de la caspasa activación
para investigar el efecto de ciglitazona en RT4 y T24 células de cáncer de vejiga apoptosis, las células se trataron con concentraciones variables de fármaco (5-60 mM) durante 24 h y se evaluaron para yoduro de propidio contenido de ADN teñido usando citometría de flujo análisis. Como se muestra en la Figura 1A, en células RT4, el fármaco indujo un aumento dependiente de la dosis de las células en la fase G2 /M del ciclo celular en asociación con un incremento del nivel de expresión de p53, p21
Cip1 /Waf1 y p27
Kip1 y un descenso del nivel de proteína ciclina B1 (Figura 1B). Pero no hubo un aumento significativo de la población sub-G1 en comparación con células control sin tratar (Figura 1C) que indican que un tratamiento de 24 h-ciglitazona no indujo la apoptosis de estas células incluso a una alta concentración de fármaco 60 mM. Además, ciglitazona no indujo disociación de caspasa 3 y su sustrato PARP (Figura 1D).
Las células fueron tratadas durante 24 h con o sin ciglitazona a las concentraciones indicadas. (A) Porcentaje de células que muestran la distribución del ciclo celular. El contenido de ADN (C) hypodiploid (pico sub-G1). (B), (D) Después del tratamiento, se recogieron las células y los extractos de proteínas totales se sometieron a inmunotransferencia para la detección de la procaspasa 3, PARP, p53, p21
Cip1 /Waf1, p27
Kip1 y ciclina B1. β-actina se utilizó como control interno de carga. Los datos mostrados son representativos de 3 experimentos independientes realizados por triplicado.
Como se observó para las células RT4, hubo un aumento dependiente de la dosis de G2 /M fracción de células T24 (datos no presentados), pero a diferencia de RT4 células, el análisis de la distribución de ADN nuclear en las células T24 mostraron un aumento dependiente de la dosis de la población sub-G1 con la muerte celular ~ 40% a partir de 40 concentración mu M (Figura 2A). Para caracterizar la vía de la muerte celular provocada por ciglitazona, la escisión de las caspasas 9, 8, 3 se determinó por análisis de transferencia Western. A partir de una concentración 40 mM de fármaco, un procesamiento mejorado considerable tanto de la caspasa 9 y caspasa 8 a sus fragmentos activos se detectó (Figura 2B). La caspasa 3 que representa la enzima ejecución aguas abajo clásica de la caspasa 8 y 9 se escindió en su forma activa (20/18 kDa). La activación de caspasa 3 se confirmó mediante la escisión del pro-forma PARP (116 kDa) a la forma inactiva (85 kDa) (Figura 2B). Como se muestra en la Figura 2C, mientras que los niveles de p53 y Bax expresión se mantuvieron sin cambios, Bcl-2 se disminuyó drásticamente y la subasta se ha truncado. Estos resultados indican que las células T24 podrían amplificar la señal de apoptosis a través de la mitocondria y se comportan como células tipo II después de la exposición ciglitazona.
Las células fueron expuestas durante 24 h a vehículo o ciglitazona a las concentraciones indicadas. (A) El porcentaje de células que muestran el contenido de ADN hipodiploide (pico sub-G1) se evaluó por citometría de flujo análisis. (B), (C) La escisión de las caspasas 9, 8, 3 y PARP así como la expresión de proteínas pro y anti-apoptóticas se determinaron por análisis de transferencia Western. (D,
izquierda
) Las células se preincubaron 1 h con 50 mM de caspasa 8 (Z-IETD-FMK) o 9 (Z-LEHD-FMK) inhibidor específico antes del tratamiento con ciglitazona 40 M durante 12 h y la evaluación de las caspasas 8, 9, 3 y procesamiento de la subasta se analizó mediante Western-blot. β-actina se utilizó como control interno de carga; (D,
derecha) Después de los tratamientos indicados, las células se tiñeron con PI para el análisis de la fragmentación del ADN por citometría de flujo. Los datos son medias ± SD de 3 experimentos independientes realizados por triplicado. *
P Hotel & lt; 0,05, diferencias significativas en comparación con las células no tratadas; **
P Hotel & lt; 0,05., Diferencias significativas en comparación con las células tratadas con ciglitazona con el uso de
t
prueba de dos colas de Student para datos independientes
La caspasa activación de la cascada es un evento clave para el proceso de apoptosis. Como se esperaba, la incubación con la caspasa 8 (Z-IETD-FMK) o 9 (Z-LEHD-FMK) inhibidores específicos bloqueado caspasas 8 o 9 de procesamiento (Figura 2D, panel izquierdo) y la disminución de la apoptosis ciglitazona inducida como se evidencia por una disminución significativa de la población sub-G1 (Figura 2D, panel derecho) asociado con un menor caspasa 3 de escisión (Figura 2D, panel izquierdo). Estos datos indican que RT4 y las células T24 no tenían una respuesta similar al tratamiento ciglitazona. De hecho, la apoptosis inducida por ciglitazona se restringió a las células T24 a pesar de que bloquea las células T24 y RT4 en la fase G2 /M del ciclo celular. Además, las dos principales vías de apoptosis, la muerte del receptor y las vías mitocondriales, parecen estar activada en las células T24.
ciglitazona no actuó a través de la activación transcripcional de PPAR?
Para determinar si era transactivación de PPAR? requerido para la detención del ciclo celular ciglitazona-promovido o apoptosis, las células RT4 y T24 fueron tratados durante 24 h por 40 M de fármaco solo o en combinación con 80 mM de GW9662, un potente inhibidor irreversible de PPAR. La acción de ciglitazona en G2 detención del ciclo celular /M en las células RT4 no fue inhibida (Figura 3A, panel izquierdo). Como era de esperar, el aumento del nivel de expresión de p27
Kip1, observada con ciglitazona, no se vio afectada cuando GW9662 se asoció con el fármaco (Figura 3A, panel derecho). El impacto de la ciglitazona sobre la muerte celular T24 (Figura 3B, panel izquierdo) y la caspasa 3 de escisión (Figura 3B, panel derecho) no se invirtió en presencia del antagonista de PPAR. Por lo tanto, GW9662 no tuvo ningún efecto inhibitorio, pero sin embargo fue efectiva ya que en las células T24, que bloqueó la sobreexpresión del objetivo A-FABP PPAR tras el tratamiento ciglitazona (Figura 3C) como se informó anteriormente [24]. En conjunto, esta serie de experimentos estableció que en células de cáncer de vejiga T24, la apoptosis inducida a través de PPAR ciglitazona vías de señalización de activación independiente.
células RT4 y T24 fueron tratados durante 24 h por 40 M de ciglitazona solo o en combinación con 80 mM de GW9662, un potente inhibidor irreversible de PPAR. (A,
izquierda
) Acumulación de células RT4 en la fase G2 /M del ciclo celular se analizó mediante citometría de flujo análisis; (A,
derecha) Después del tratamiento, los lisados de células enteras se prepararon y 20 g de extracto de proteína total se sometieron a inmunotransferencia para la detección de p27
Kip1. (B,
la izquierda) El porcentaje de células que muestran el contenido de ADN hypodiploid (pico sub-G1) se evaluó mediante análisis de citometría de flujo; (B,
derecha) Después del tratamiento, los lisados de células enteras se prepararon y 15 g de extracto de proteína total se sometieron a inmunotransferencia para la detección de la procaspasa 3. (C) Evaluación de la eficacia antagonista PPAR GW9662 en los adipocitos grasos Acid Binding Protein (a-FABP), un objetivo PPAR conocido en las células T24 por análisis de transferencia Western. β-actina se utilizó como control interno de carga. Los datos son medias ± SD de 3 experimentos independientes realizados por triplicado. *
P Hotel & lt; 0,05., Diferencias significativas en comparación con las células no tratadas con el uso de
t
prueba de dos colas de Student para datos independientes
ciglitazona hasta regula solubles y TRAIL unido a la membrana de las células T24
Hemos investigado si ciglitazona puede modular la expresión de TRAIL en células T24 y RT4. Tras 40 mM exposición ciglitazona, se observó un aumento del nivel de ligando TRAIL en extractos de células enteras T24 como se evaluó por transferencia de Western, un aumento de TRAIL unido a la membrana como se evidencia por citometría de flujo análisis con un anticuerpo específico TRAIL conjugado con PE, así como un incremento del nivel de TRAIL en medio celular acondicionado T24 determinado por ELISA (Figura 4A). Por otro lado, ciglitazona, que no induce la apoptosis en las células RT4, no plantearon TRAIL en extractos de células enteras, así como en la superficie celular y en medio condicionado (Figura 4B). por lo tanto creemos que ciglitzone podría provocar la apoptosis de las células del cáncer de vejiga T24 de alto grado mediante el aumento de la expresión de TRAIL.
células RT4 y T24 fueron tratadas durante 24 h con ciglitazona a 40 y /o 60 micras. En las células RT4 (A) y T24 (B), los lisados de células enteras se sometieron a ensayo para la expresión de TRAIL por análisis de transferencia Western. β-actina se utilizó como control interno de carga. Las células se tiñeron con anti-TRAIL-PE y se analizaron por citometría de flujo. Después del tratamiento ciglitazona 40 mM durante 24 h, se recogieron los medios condicionados y la concentración de TRAIL se midió por ELISA. Los datos son medias ± SD de 2 experimentos independientes realizados por cuadruplicado. *
P Hotel & lt; 0,05, diferencias significativas en comparación con las células no tratadas con el uso de
t
prueba de dos colas de Student para datos independientes. (C) Las proteínas celulares se aislaron de las células T24 y se sometieron a inmunotransferencia para la detección de DR4 y DR5. β-actina se utilizó como control interno de carga. (D) células T24 fueron expuestos a 40 ciglitazona mu M durante 12 h, se tiñeron con anti-DR4-PE o anti-DR5-PE y se analizaron por citometría de flujo. (E) células T24 se preincubaron con o sin anticuerpos monoclonales de bloqueo DR4 y los receptores DR5 (5 mg /ml) durante 1 h y se estimularon durante 12 h por 40 ciglitazona M o 50 TRAIL ng /ml para las células RT4 (
Insertar
). El porcentaje de células que muestran el contenido de ADN hipodiploide (pico sub-G1) se evaluó por citometría de flujo análisis. Los datos son medias ± SD de 3 experimentos independientes realizados por triplicado. *
P Hotel & lt; 0,05, diferencias significativas en comparación con las células no tratadas; **
P Hotel & lt; 0,05., Diferencias significativas en comparación con las células tratadas con ciglitazona con el uso de
t
prueba de dos colas de Student para datos independientes
ciglitazona hicieron no afectar a la expresión de DR4 y DR5 en células T24
en las células T24, hemos demostrado una escisión de la caspasa 8 y el aumento de TRAIL por ciglitazona. Para analizar si la muerte celular inducida por ciglitazona depende de modificación de la expresión del receptor de muerte, las células fueron tratadas con el fármaco 40 o 60 M durante 24 h. Hemos demostrado que ciglitazona no modificó DR4 y DR5 nivel de expresión tal como se evaluó en lisados de células enteras por Western Blot (Figura 4C) así como su expresión en la superficie celular como se evidencia por citometría de flujo análisis con anticuerpos conjugados con PE específicos (Figura 4D). Para investigar si la apoptosis activada por ciglitazona era una función de la amplificación de la señalización del receptor de muerte, DR4 y DR5 estimulación fue bloqueado por pre-incubación de las células con el bloqueo de anticuerpos anti-DR5 anti-DR4 o antes del tratamiento de drogas. La inactivación de ambos DR4 y DR5 disminuyó significativamente la apoptosis ciglitazona-promovido (Figura 4E). Para validar la eficacia de los anticuerpos de bloqueo a las concentraciones utilizadas receptor de muerte, expusimos las células RT4 sensibles a TRAIL a RUTA como control positivo (Figura 4E, inserto). Como era de esperar, la inactivación de cada uno de los receptores inhibió completamente la apoptosis inducida por TRAIL. Estos datos muestran que ciglitazona activa la vía extrínseca de apoptosis a través de DR4 y DR5.
ciglitazona inhibe el desarrollo de la vejiga xenoinjerto de tumor en ratones desnudos
Para investigar el efecto antitumoral de ciglitazona
in vivo
(Figura 5), las células T24 y RT4, así fueron inyectados por vía subcutánea en ratones desnudos atímicos de 6 semanas de edad, y mujeres. Cuando se formaron tumores palpables, los ratones fueron tratados por vehículo o ciglitazona (15 mg /kg) a razón de una inyección por semana durante tres semanas. El volumen del tumor se midió dos veces por semana hasta que se sacrificaron los ratones. La incidencia del tumor fue de 100% en todos los animales. ratones El volumen de los tumores en T24 células injertadas-no aumentó en los animales tratados con ciglitazona en comparación con animales de control tratados con vehículo. Hubo una diferencia significativa de la tercera inyección de ciglitazona (
P
& lt; 0,05) (Figura 5A, panel izquierdo). En RT4 ratones células injertadas, el volumen del tumor parecía desarrollar menos que en los ratones de control tras el tratamiento ciglitazona pero esto no fue estadísticamente significativa (Figura 5A, panel derecho). Para determinar si la inhibición del desarrollo tumoral por ciglitazona es debido a la inhibición de la proliferación, la apoptosis, o ambos, se evaluó la expresión de Ki67 y activación de caspasa 3 en las secciones de tejido tumoral por análisis inmunohistoquímico. El número de células Ki67 positivas fue menor en T24 y RT4 células-xenoinjertados secciones tumorales de animales tratados con ciglitazona comparación con las secciones tumorales de animales no tratados. Por el contrario, no había caspasa detectable activado 3 en RT4 secciones de tumor células xenoinjertados y un fuerte activado caspasa 3 tinción en las células-xenoinjertado secciones tumorales de animales tratados ciglitazona comparación con las secciones tumorales de animales no tratados (Figura 5B) T24. Estos resultados indican, por primera vez para nuestro conocimiento, de que la reducción significativa del volumen del tumor observado en los ratones tratados con ciglitazona (xenoinjertados con células de cáncer de vejiga T24) requiere la inhibición de la proliferación, así como la inducción de la apoptosis.
Los ratones fueron inoculados por vía subcutánea con crecimiento exponencial T24 y las células de cáncer de vejiga RT4 (5 × 10
6 células). Cuando el tamaño del tumor alcanzó los 40 mm
3 en volumen, los ratones fueron divididos al azar en el control y grupos tratados (n = 10). inyecciones intraperitoneales de ciglitazona se administraron a una dosis semanal de 15 mg /kg durante tres semanas. Los animales de control recibieron sólo el vehículo de solución salina a raíz de un programa idéntico. curvas tumorales (A) el crecimiento se determinaron midiendo el volumen del tumor. *
P
& lt; 0.05, las diferencias significativas en comparación con los animales no tratados con el uso de dos vías ANOVA (evaluación del desarrollo volumen del tumor con el tiempo); **
P Hotel & lt; 0,05, diferencias significativas entre el control y los ratones tratados en cada tiempo de post-injerto con el uso de
t
prueba de dos colas de Student para datos independientes. (B) tinción inmunohistoquímica de secciones incluidas en parafina representativos de los tumores de los ratones no tratados o tratados ciglitazona. Las secciones se fijaron y se tiñeron para Ki-67 y la caspasa activa 3. Cada panel es representativo de 5 secciones para cada uno de los diez tumores de ratones control y tratados con ciglitazona. Aumento original, × 20.
ciglitazona y el tratamiento combinado TRAIL induce apoptosis sinérgica a través del receptor de muerte vía, la activación de caspasas y Bid señalización de escisión
células T24 son conocidos por ser altamente resistente a TRAIL después de la exposición a concentraciones crecientes de TRAIL humano recombinante soluble exógeno que van desde 10 a 200 ng /ml [25]. De acuerdo con nuestros resultados demuestran que ciglitazona hasta regula la expresión de TRAIL, que postula que ciglitazona mata las células T24 mediante la restauración de su sensibilidad a la apoptosis inducida por TRAIL. Para validar esta hipótesis, las células se trataron con vehículo o ciglitazona 40 mM durante 24 h o 50 ng /TRAIL recombinante ml para los últimos 12 h solos o en combinación. Como se informó anteriormente, hemos demostrado también que las células T24 fueron refractarios a la apoptosis inducida por TRAIL. Más interesante, hubo un aumento significativo de la muerte celular en células ciglitazona y TRAIL-cotreated en comparación con las células tratadas solo ciglitazona-(Figura 6A, parte superior). La acción TRAIL-sensibilización de ciglitazona resultó en pro-caspasa 8 y 3 de procesamiento y la proteolisis PARP pero participa también el bucle de amplificación mitocondrias como se indica por la caspasa 9 y Bid escisión (Figura 6A, abajo). En presencia de la caspasa 8 (Z-IETD-FMK) o la caspasa 9 (Z-LEHD-FMK) inhibidores específicos, se observó una inhibición de cualquiera de la caspasa 8 o caspasa 9 de procesamiento y la ausencia de escisión de la subasta, así, de ciglitazona y células cotreated TRAIL (Figura 6B, parte inferior). Esto se asoció con una disminución de la muerte celular en presencia de inhibidores de caspasa como se evidencia por una disminución significativa de la fragmentación del ADN (Figura 6B, parte superior). Para confirmar la implicación de la activación del receptor de muerte, DR4 y DR5 estimulación fue inhibida por pre-incubación de las células con el bloqueo de anticuerpos anti-DR5 anti-DR4 o antes del tratamiento (Figura 6C). La inactivación de cada uno de los receptores TRAIL y sobre ciglitazona cotratamiento bloquearon eficazmente la muerte celular que confirma que la apoptosis fue mediado a través de interacciones específicas entre TRAIL y sus receptores.
células T24 fueron tratados o no con el 40 ciglitazona M durante 24 h o recombinante humana TRAIL (50 ng /ml) durante 12 h o cotreated con ciglitazona y TRAIL (añadido aquí desde hace 12 h). (A,
Top of) El porcentaje de células que muestran el contenido de ADN hypodiploid (pico sub-G1) se evaluó mediante análisis de citometría de flujo. Los datos son medias ± SD de 3 experimentos independientes realizados por triplicado. *
P Hotel & lt; 0,05, diferencias significativas en comparación con las células no tratadas; **
P Hotel & lt; 0,05, diferencias significativas en comparación con las células expuestas al tratamiento individuales con el uso de
t
prueba de dos colas de Student para datos independientes; (A,
parte inferior) de detección de inmunotransferencia de las caspasas 8, 9 y 3, PARP y la oferta. (B) Las células se incubaron previamente 1 h con 50 mM de caspasa 8 (Z-IETD-FMK) o 9 (Z-LEHD-FMK) inhibidor específico de tratamiento antes indicado;
top
, el porcentaje de células que muestran el contenido de ADN hypodiploid se evaluó mediante análisis de citometría de flujo;
parte inferior, las caspasas 8, 9, 3 y la escisión de la subasta se ensayó mediante análisis de Western Blot. (C) Las células se preincubaron con o sin anticuerpos monoclonales que bloquean los receptores DR4 y DR5 para 1 h y se estimularon como se indica. El porcentaje de células que muestran el contenido de ADN hipodiploide se evaluó por citometría de flujo análisis. detección (D) La inmunotransferencia de c-FLIP y survivina desde T24 lisados de células enteras. (E) Las células se trataron previamente con 25 mM inhibidor del proteasoma MG132 durante 30 min y se estimularon con 40 mM ciglitazona durante 12 h;
top
, el porcentaje de células que muestran el contenido de ADN hypodiploid se evaluó mediante análisis de citometría de flujo;
inferior, inmunotransferencia detección de c-FLIP y survivina. β-actina se utilizó como control interno de carga. (B, C, E) Los datos son medias ± SD de 2 experimentos independientes realizados por triplicado. *
P Hotel & lt; 0,05, diferencias significativas en comparación con las células no tratadas; **,
P Hotel & lt; 0,05., Diferencias significativas en comparación con las células y ciglitazona TRAIL cotreated con el uso de
t
prueba de dos colas de Student para datos independientes
ciglitazona regula a la baja c-FLIP y survivina a través de un proteasoma dependiente de la degradación
además, investigó el efecto de ciglitazona y la asociación de ciglitazona con TRAIL en la expresión de inhibidores de la apoptosis tales como survivina y c-FLIP conocido a estar involucrados en la regulación de las dos vías de apoptosis intrínsecos y extrínsecos. Tal como se presenta en la Figura 6D, ciglitazona, tal como un tratamiento individual o en combinación con TRAIL, redujo tanto c-FLIP niveles
S y proteína survivina en la misma medida y dramáticamente las reguladas c-FLIP
L. Por el contrario, TRAIL solo tratamiento no afectó considerablemente c-FLIP y proteína survivina niveles. Estos hallazgos indican que la baja regulación de c-FLIP y survivina probablemente contribuye a ciglitazona-desencadenó la apoptosis y para ciglitazona mediada por sensibilización a la apoptosis inducida por TRAIL.
La vía ubiquitina-proteasoma juega un papel central en la regulación de control del ciclo celular y la apoptosis [26]. Varias proteínas anti-apoptóticas tales como c-FLIP y survivina representan objetivos destacados de la proteasoma. Para determinar si el ciglitazona inducida por la baja regulación de los reguladores negativos, la apoptosis está mediada a través de este proceso, se investigaron los efectos del inhibidor del proteasoma MG132. MG132 restauró los niveles de survivina y c-FLIP (Figura 6E, abajo) lo que indica que la baja regulación de ambos inhibidores de la apoptosis fue proteasoma dependiente. Como se muestra en la Figura 6E (arriba) el nivel de población de células sub-G1 en las células cotreated se redujo significativamente en presencia de MG132. Por lo tanto, se requiere la recuperación de c-FLIP y survivina, que ciglitazona y TRAIL significativamente atenuada la apoptosis inducida por la combinación, pero no es suficiente para superar la apoptosis co-tratamiento-promovido en células T24.
Discusión
el presente informe ha demostrado que la inhibición del crecimiento celular inducida por el control de ciglitazona curso del ciclo celular o la inducción de la apoptosis de acuerdo con el grado del tumor de células uroteliales derivadas de cáncer de vejiga. apoptosis efectos ocurrieron a altas concentraciones (40-60 M) de forma independiente de la activación de PPAR? como ya se ha informado en otros modelos celulares [27]. Se han propuesto varios mecanismos independientes potencial PPAR-activación que pueden inducir apoptosis. Estos incluyen la generación de especies reactivas de oxígeno [28], la inducción de acidosis celular [29], la participación de la respuesta-1 de crecimiento temprano y NSAID-activado-gen 1 en el cáncer de colon [30].
Para la primera vez en las células uroteliales malignas, presentamos pruebas de que ciglitazona inducida G2 /M detención del ciclo celular y cambios en los reguladores del ciclo celular. El principal regulador de la G2 a la transición M es la MPF (M-fase factor promotor), que comprende la subunidad catalítica Cdc2 y de la subunidad reguladora de ciclina B1. Varias observaciones sugieren que p21
Cip1 /Waf1 juega un papel importante en el control de punto de control G2 /M.