Extracto
irradiación con iones pesados induce una mayor frecuencia de ADN de doble filamento se rompe (DSBs) que debe ser reparado adecuadamente . el acortamiento de los telómeros crítico puede desencadenar respuestas al daño de ADN, tales como las DSB. Los telómeros son muy sensibles al estrés oxidativo tal como radiación ionizante. La subunidad catalítica de proteínas dependiente de ADN quinasa (DNA-PKcs) es el componente central en el extremo no homóloga (NHEJ) reparar complejo y participa en el mantenimiento de los telómeros. Por lo tanto, se espera para mejorar el efecto de la irradiación de la muerte celular de iones pesados a través de la inhibición de DNA-PKcs. Para probar esta hipótesis, la radiosensibilidad celular se midió por el ensayo genético clonal. la reparación de daños de ADN se cuantificó por relativamente largo PCR. La apoptosis se cuantificó mediante análisis de citometría de flujo de anexina V /PI doble tinción, y la senescencia se analizó por la actividad de galactosidasa. longitud de los telómeros fue semi-cuantificado por PCR en tiempo real. P53 y p21 expresión se determinó por Western Blot. Nuestros datos demuestran que las células MCF-7 y HeLa con la inhibición de DNA-PKcs eran más susceptibles a la irradiación con iones de carbono que los que no la inhibición de DNA-PKcs. A pesar de que NHEJ fue inhibida por el inhibidor específico de DNA-PKcs, NU7026, más daño del ADN inducido por la irradiación de iones de carbono fue reparado dentro de 24 horas después de la irradiación en ambas líneas celulares. Sin embargo, el potencial de reparación de daño letal (PLDR) no pudo restaurar la inactivación celular en DNA-PKcs células inhibidas. MCF-7 células mostraron extensa senescencia acelerada y la reducción de la longitud del telómero, mientras que las células HeLa fueron sometidos a la apoptosis significativa después de la irradiación con NU7026 incubación. Además, ambas líneas celulares con telómeros más cortos eran más susceptibles a la radiación de iones de carbono. Nuestros datos actual sugiere que la inhibición de DNA-PKcs podría mejorar la sensibilidad celular a la radiación de iones de carbono a través de molestar a su papel funcional en la protección del extremo de los telómeros. La combinación de la inhibición de DNA-PKcs y la irradiación de iones de carbono puede ser un método eficaz de la terapia de iones pesados
Visto:. Zhou X, Zhang X, Xie Y, Tanaka K, Wang B, Zhang H (2013 ) las células del cáncer de ADN-PKcs inhibición sensibiliza a Carbon-Ion irradiación a través de los telómeros que capsula interrupción. PLoS ONE 8 (8): e72641. doi: 10.1371 /journal.pone.0072641
Editor: Xin-Yuan Guan, la Universidad de Hong Kong, China
Recibido: 14 de abril de 2013; Aceptado: 11 Julio 2013; Publicado: 27 Agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Zhou et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por las subvenciones del Programa Nacional de Investigación básica de China (2010CB834202), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (10835011), y los proyectos de tecnologías de Investigaciones Científicas de la provincia de Gansu (0702NKDA045, 0806RJYA020) y 11J364 proyecto HIMAC que es apoyado por National Instituto de Ciencias radiológicas. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los telómeros son estructuras especializadas de ADN-proteína que tapa los extremos de los cromosomas. Alrededor del 90% de las células cancerosas contienen telómeros cortos, pero presentan una alta actividad de la telomerasa. A medida que las células cancerosas se dividen más a menudo, que poseen, en promedio, los telómeros más cortos que las células normales. Por lo tanto, sin la función de la telomerasa adecuada para mantener la longitud de los telómeros, los telómeros en las células cancerosas pueden acortar a un ritmo más rápido que las células normales. Críticamente los telómeros cortos pueden dar lugar a aberraciones cromosómicas [1] e inducir la respuesta al daño del ADN (DDR) [2]. Por lo tanto, la longitud del telómero puede ser un factor importante para la inactivación de células de cáncer.
Los telómeros desempeñan papeles importantes en las respuestas celulares a los agentes que dañan el ADN, tales como radiación ionizante (IR) [3]. Varias líneas de evidencia han sugerido que el mantenimiento de los telómeros está relacionada con la radiosensibilidad. Por ejemplo, tanto la radiosensibles AT células y células ABS mostraron un número de defectos telómeros asociado y de su proteína relacionada radiosensibilidad está presente en los telómeros [4] - [7]. doble filamento se rompe en los telómeros deben estar debidamente procesadas por la telomerasa con la ayuda de proteínas de unión a los telómeros. Si no es así, las roturas en los telómeros podrían iniciar la degradación de los cromosomas y /o reordenamientos, DDR y eventualmente conducir a la muerte celular [8].
La radiación de alta LET puede inducir una mayor y más complejo de daño en el ADN de baja radiación LET. radiación de baja LET produce principalmente un solo capítulo rompe (SSB), mientras que la radiación de alta LET produce principalmente las DSB y daños en clúster, que representan una forma peligrosa de daños. Si no se repara correctamente, DSBs causan cambios genéticos y /o la muerte celular. Las respuestas diferenciales de las células después de la exposición a la irradiación a diferentes valores de LET pueden corresponder al hecho de que la naturaleza del daño en el ADN es distinta. Existen informes que muestran que la estructura de los telómeros es particularmente susceptible al estrés oxidativo [9]. Por lo tanto, la radiación de alta LET puede causar un daño más severo a los telómeros que los de baja radiación LET. Como la mayoría de las células cancerosas albergan telómeros más cortos que las células normales, los telómeros en las células cancerosas pueden ser más probable que disminuya a una longitud crítica con la inhibición de la telomerasa. Por lo tanto, postulamos que el efecto de la irradiación de células de iones pesados matando podría mejorar mediante la interferencia debida al alargamiento de los telómeros en las células cancerosas.
En este estudio, se demostró que la radiosensibilidad de las células MCF-7 y HeLa fue mucho mayor por NU7026, un inhibidor específico de ADN-PKcs, después de la irradiación de iones de carbono. Otras investigaciones demostraron que con un efecto limitado en la capacidad de reparación del ADN, las células MCF-7 tratadas con NU7026 mostraron aceleraron la pérdida de telómeros después de la irradiación de iones de carbono. Como ADN-PKcs no sólo es el componente clave en el complejo de reparación NHEJ, sino que también se dedica a la función de los telómeros, que postula que NU7026 podría mejorar la radiosensibilidad al interferir con el acceso de la telomerasa al telómero después de la irradiación de iones de carbono.
Tratamiento de irradiación Materiales y Métodos
Cultivo de células y
la célula de cáncer de mama humano lineMCF-7 y la línea celular de cáncer de cuello uterino HeLa fueron adquiridos de la American Type Culture Collection. Las células se mantuvieron en Dulbecco medio de Eagle modificado (Gibco, EE.UU.) suplementado con suero bovino fetal 10%. Las células fueron cultivadas en 5% de CO
2 en el aire humidificado a 37 ° C.
de rayos X se generaron con una máquina de rayos X (Pantak-320S, Shimadzu, Japón) hace funcionar a 200 kVp y 20 mA usando un filtro de cobre de 0,5 mm de aluminio + 0,5-mm. Se utilizó un medidor de tasa de exposición (AE-1321 M, Applied Engineering Inc, Japón) para la dosimetría. Las tasas de dosis fueron 1,1 Gy /min. Las células en crecimiento exponencial se irradiaron a temperatura ambiente, con células de cultivo no irradiados (control) que se manejan en paralelo con las muestras irradiadas.
irradiaciones de carbono de iones se realizaron a temperatura ambiente en el Acelerador médico pesado Ion Center (HIMAC) del Instituto Nacional de Ciencias radiológicas (Chiba, Japón), con 290 MeV /n carbono-ion; el valor LET para el carbono-litio fue de 40 keV /m. Las tasas de dosis fueron de 1 Gy /min. Algunos procedimiento de irradiación también se llevó a cabo en el Centro de Investigación de Iones Pesados en Lanzhou HIRFL, Instituto de Física Moderna de la Academia China de Ciencias, Lanzhou, China, con 300 MeV /n carbono-litio y un valor de 49 KeV LET /m.
Ensayo clonogénico
Las células en crecimiento exponencial se sembraron en placas de petri para la formación de colonias. 1000-10000 células se sembraron dentro de una hora después de la irradiación sobre la base de la dosis de radiación recibida. Para el examen de la recuperación de daño potencialmente letal (PLDR), las células se cultivaron en el medio durante un período de recuperación de 24 h después de la irradiación y después sembrado. Las células se incubaron adicionalmente hasta que las colonias formadas eran lo suficientemente grandes para ser contados, sin dejar de ser separable. Las colonias se fijaron con metanol y se tiñeron con solución de Giemsa 0,6%. Las colonias se contaron manualmente. Sólo se puntuaron las colonias que contienen más de aproximadamente 50 células.
se obtuvo Apoptosis Ensayo
La cuantificación de células apoptóticas usando el kit de detección de Anexina V-FITC (beyotime, CN) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los datos se evaluaron con el software FlowJo 7.2.1. Siguientes controles se utilizan para configurar la compensación y los cuadrantes:. Células no teñidas y células teñidas con FITC-anexina V o con PI sola
La senescencia Ensayo
células MCF-7 se lavaron dos veces con PBS y se fijo con 2% de formaldehído, 0,2% de glutaraldehído durante 5 min. Después, las células se lavaron de nuevo con PBS y se tiñeron con una solución de 1 mg /ml 5-bromo-4-cloro-3-inolyl-ß-galactosidasa en dimetilformamida (20 mg /Stock ml), 5 mM de ferrocianuro de potasio, 150 mM NaCl, 40 mM de ácido cítrico /fosfato de sodio, pH 6,0, y 2 mM de MgCl
2. Después de la incubación durante la noche a 37 ° C, las células se lavaron dos veces con PBS y después se fotografiaron.
QPCR para la longitud del telómero Medición
El sistema de qPCR FTC-3000 (FUNGLYN, CA) se utilizó para análisis. El ADN genómico total de 50 ng se utilizaron para el ensayo de la longitud del telómero, en una reacción de 20 l que contenía 1X SYBR Premezcla Ex Taq II (Takara, Japón) y 200 nmol /l de cada cebador. La información de la secuencia con respecto a los cebadores se enumeran en la Tabla 1. Reacciones triplicado se realizaron para cada marcador usando el siguiente perfil de ciclos térmicos adaptado de Cawthon [10]: 15 min a 95 ° C en stage1; 2 ciclos de 15 s a 94ºC, 15 s a 49 ° C en la etapa 2; y 32 ciclos de 15 s a 94 ° C, 15 s a 58 ° C, 15 s a 72 ° C con adquisición de la señal en la etapa 3. El 72 ° C lee siempre que los valores de Ct para la amplificación de los telómeros y c-myc modelo. se utilizó el enfoque de cuantificación relativa (△△ Ct) según el método descrito anteriormente [11]. Cada ensayo se realizó por triplicado.
Reparación del ADN daños Ensayo
Long PCR para la evaluación de daños en el ADNmt se realizó utilizando el kit GeneAmp XL PCR (Perkin-Elmer, Boston, MA) . larga PCR cuantitativa se realizó en un sistema de Eppendorf Mastercycler PCR (Eppendorf, Hamburgo, Alemania). La prueba de ciclo de PCR se realizó antes de asegurar la PCR en la fase exponencial. La información de la secuencia de los cebadores se enumeran en la Tabla 1. La PCR se inició con una 75 ° C Además de arranque en caliente de la polimerasa y se permite que someterse el siguiente perfil: una desnaturalización inicial de 1 min a 94 ° C seguido de 25 ciclos para fragmentos grandes o 20 ciclos para pequeños fragmentos de 94 ° C de desnaturalización durante 15 segundos y 68 ° C de extensión para 15 min. Una extensión final a 72 ° C se realizó durante 10 min a la realización del perfil. Una alícuota de cada producto de PCR se resolvió en un gel de agarosa al 1% y verticales a electroforesis en TBE durante 4 h. Los geles fueron fotografiados digitalmente y se cuantificaron con FluorChem FC2 (Alpha Innotech corporación). El daño en el ADN se cuantificó mediante la comparación del nivel relativo de la amplificación de los fragmentos grandes de ADN (gen HPRT 10,4 kb) la normalización de este a la amplificación de fragmentos (54-bp c-myc) más pequeños.
Establecimiento de Las células con telómeros más cortos
Las células fueron incubadas con 2 M MST312 (Sigma, EE.UU.) durante 50-70 días en la Dulbecco Modificado Medio Eagle (Gibco, EE.UU.) suplementado con suero bovino fetal al 10%. Las células fueron cultivadas en 5% de CO
2 en el aire humidificado a 37 ° C. El medio con 2 M MST312 se reemplazó cada 3 a 4 días. longitud de los telómeros se determinó mediante QPCR tal como se describe anteriormente. MST312 se retiró del medio de 24 horas antes del procedimiento de radiación.
Ensayo de citotoxicidad
citotoxicidad de MST312 se determinó mediante monitorización en tiempo real de células adherentes por el Sistema de RT-CES (ACEA Biosciences, EE.UU. ). 10000 células se sembraron en cada 360 l bien con 200 l de medio antes de la medición. El medio se sustituyó cada 3 días. La proliferación de células MCF-7 y HeLa se registró cada 2 horas durante 144 horas.
Análisis estadístico
El análisis estadístico se llevó a cabo en las medias de los datos obtenidos a partir de al menos tres experimentos independientes. Los datos se presentan como medias ± SD. Se usó el programa de la prueba t de Student en Microsoft Excel para detectar la significación estadística.
p
. & Lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
NU7026 Tratamiento mejorado de inactivación celular por apoptosis y /o senescencia en células de cáncer de carbono después de iones de irradiación
La radiosensibilidad de las células se examinó mediante ensayo clonogénico. Como se ilustra en la Figura 1, la radiosensibilidad de las células tratadas con NU7026 fue mayor que el control en ambas líneas celulares. El efecto de inactivación celular de la irradiación de iones de carbono era mayor que la de rayos-X. Para investigar más el destino de células después de la irradiación y /o tratamiento NU7026, apoptosis celular y la senescencia se determinaron por anexina /PI tinción doble y ß-galactosidasa tinción histoquímica, respectivamente. La apoptosis en células HeLa MCF-7 y no fue significativamente elevado cuando fueron tratados con la irradiación de iones de carbono o NU7026 solo, pero fue marcadamente mayor por la combinación de la irradiación de iones de carbono y el tratamiento NU7026 (Tabla 2). Células MCF-7 tratadas con NU7026 después de la irradiación de iones de carbono mostraron extensa senescencia celular 30 días después de la irradiación; la irradiación de iones de carbono solo también indujo la senescencia, pero en un grado mucho menor (Figura 2). Las células HeLa fueron sometidos a una pérdida significativa de la población a través de la apoptosis 48 horas después de la irradiación y no pueden sostener la proliferación después.
Las células fueron incubadas con 10 NU7026 M durante 3 horas antes de la irradiación.
mejorada radiosensibilidad era independiente del daño del ADN de reparación de la capacidad
DNA-PKcs es necesario para la vía NHEJ de reparación del ADN, que vuelve a unirse DSBs. Puesto que la capacidad de reparación del ADN está estrechamente ligada a la radiosensibilidad, NU7026, un inhibidor específico de DNA-PKcs, posiblemente, podría mejorar la radiosensibilidad al interferir con la reparación de DSB mediadas por NHEJ. Sin embargo, no se detectó una pérdida significativa de la capacidad de reparación del ADN en ambas células tratadas con 10 mM NU7026 después de 1 Gy de irradiación de iones de carbono. Además, PLDR no restauró la inactivación celular de células de ADN-PKcs inhibidos como se mide por la fracción de supervivencia, lo que indica que el ADN-PKcs puede afectar a la radiosensibilidad través de una vía alternativa independiente de su papel en la reparación del daño de ADN (Figura 3).
A. La fracción de supervivencia de las células irradiadas después de la recuperación de 24 horas; B. La cinética de reparación de daños en el ADN después de la irradiación de 1 Gy de iones de carbono con /sin tratamiento NU7026, medida por la amplificación PCR larga relación.
DNA-PKcs inhibición resultó en una reducción longitud de los telómeros se aceleró después de Carbono -ion irradiación
longitud de los telómeros es un factor crítico en el inicio de la senescencia celular. Para investigar si la senescencia inducida por la radiación se debe a la reducción de la longitud del telómero, PCR en tiempo real se utiliza para determinar la cuantificación relativa de la longitud del telómero. Como se muestra en la Figura 4, MCF-7 células cultivadas con NU7026 no mostraron pérdida de telómeros significativa; Sin embargo, la longitud de los telómeros en las células irradiadas de iones de carbono disminuyó gradualmente dentro de los 30 días. En particular, la longitud del telómero en las células tratadas con la combinación de NU7026 y la irradiación de iones de carbono disminuyó más severamente. Esto aceleró la pérdida de telómeros podría explicar el aumento de la senescencia observada en las células de los 30 días después de la irradiación.
MCF-7 células fueron incubadas con NU7026 10 mM. *: P & lt; 0,01 versus control;
#:. P & lt; 0,01 frente a 1 Gy de irradiación de iones de carbono
Los telómeros cortos causados Celluar La inactivación de carbono después de iones de irradiación
Para determinar si acortamiento de los telómeros fue la causa de inactivación celular después de la irradiación de iones de carbono, las células MCF-7 y HeLa con telómeros más cortos se establecieron a través de la incubación continua con la MST312 inhibidor de la telomerasa. Un ensayo de citotoxicidad demostró que 2 M MST312 no dio lugar a la detención del crecimiento significativa en comparación con el control (Figura 5A-B). Se detectó un acortamiento significativo de la longitud de los telómeros en las células MCF-7 después de 50 días y en células HeLa después de 30 días de incubación continua con MST312 (Figura 5C). (Figura 5B). ß-galactosidasa tinción histoquímica reveló que mientras la senescencia de menor importancia se detectó en células MCF-7 después de 50 días de co-incubación con MST312 (Figura 5C), 1 Gy de irradiación de iones de carbono inducido por senescencia extensa en estas células (Figura 5D). radiación Carbon-ion inducida alto nivel de apoptosis en las células HeLa con telómeros más cortos (Tabla 2).
monitorización en tiempo real de crecimiento y proliferación de células MCF-7 y HeLa en presencia de MST312 usando el RT -CES plataforma. B. longitud de los telómeros relativa en las células MCF-7 y HeLa después de incubación prolongada MST312. C. La senescencia de las células MCF-7 a 50 días después de la incubación MST312; D. senescencia de las células MCF-7 con telómeros más cortos de 5 días después de 1 Gy de irradiación de iones de carbono.
Discusión
Una de las diferencias importantes entre alta y baja LET-LET la radiación es que la radiación de alta LET produce más densamente distribuidas y los centros de las DSB que baja radiación LET. Se ha sugerido que sería más difícil para el sistema de reparación del ADN celular para reparar el daño del ADN agrupado [12], [13]. Hay dos principales mecanismos de reparación del OSD en células de mamíferos: NHEJ y la recombinación homóloga (HR). Se cree que NHEJ es la vía dominante la reparación de DSB en células de mamífero [14] - [17]. Sin embargo, se informó de fragmentos cortos de ADN inducida por irradiación de iones pesados de inhibir el proceso de NHEJ [18]. Por otra parte, de iones pesados de irradiación inducida DSBs complejos que se cree que ser reparados por HR [19]. Por lo tanto, el efecto inhibidor adicional de NHEJ podría haber impuesto un efecto limitado en la reparación de la irradiación inducida por daño en el ADN de iones de carbono en nuestro experimento. La inhibición de la DNA-PKcs ralentizó la cinética de la reparación del ADN en nuestro estudio y puede haber sido debido a la cinética de reparación del ADN más lentas de HR, en comparación con el proceso de NHEJ. A medida que el daño del ADN fue finalmente reparado dentro de 24 horas después de la irradiación, la radiosensibilidad reforzada podría haber sido causado por otros factores, como el acortamiento de los telómeros crítico. et.at. Drissi informaron que los telómeros cortos inducen estructura de la cromatina cambios que limitan el acceso de ATM activado para sus objetivos de abajo en la cromatina, lo que puede explicar el aumento de la sensibilidad a la radiación observada con el acortamiento de los telómeros [20]. La irrelevancia de NHEJ de reparación de radiosensibilidad también fue evidente en nuestros datos PLDR, lo que demuestra que a pesar de que la mayor parte del daño en el ADN fue reparado después de 24 horas de incubación, la inhibición de DNA-PKcs aún podría conducir a la supervivencia celular inferior.
Sabatino sugirió et.al que los telómeros acortar después de la irradiación puede representar un importante mediador entre exposición a la radiación, la formación de ROS y el daño vascular [21]. El marcado aumento en la radiosensibilidad consecuencia de la inhibición de ADN-PKcs podría haber sido causado por la otra función de DNA-PKcs, que actúa como una proteína de unión de los telómeros [22]. DNA-PKcs abrogación puede dar lugar a un ritmo más rápido de la degradación de los telómeros debido a su interacción con la telomerasa en el mantenimiento de los telómeros [23]. Los estudios han demostrado que el ADN-PKcs también estaba implicado en la protección del extremo de los telómeros. Las características de la disfunción de los telómeros con la inhibición de DNA-PKcs ha sido ampliamente estudiado por Bailey SM et.al. [24], [25]. Estos autores demostraron que los telómeros no niveladas con DNA-PKcs se detectan y procesan de manera inapropiada como DSB, participando así en ionizante eventos de fusión telómero-DSB inducidos por la radiación.
Como un componente crítico en los telómeros extremo tapado [26], la inhibición de ADN-PKcs puede perturbar el correcto acceso de la telomerasa a los telómeros, lo que se traduce en un acortamiento de los telómeros. Como la mayoría de las células cancerosas albergan telómeros más cortos que las células normales, sus telómeros son más propensos a ser reducido a una longitud crítica si la telomerasa es disfuncional. En el presente estudio, se aceleró acortamiento de los telómeros se detectó en las células después de la irradiación de iones de carbono en ADN-PKcs inhibida en células MCF-7, acompañado por una amplia senescencia celular. No podemos detectar acortamiento de los telómeros en las células HeLa después de carbono-ion con la inhibición de DNA-PKcs, debido a su incapacidad para la proliferación continua. La apoptosis significativa en las células HeLa podría estar mediado por la respuesta de daño del ADN. Sin embargo, el ensayo de damge ADN reveló que el daño del ADN fue reparado de manera eficiente dentro de las 24 horas después de la irradiación. Desde DNA-PKcs no sólo participaron en la reparación del ADN de doble soporte, sino que también actúan como un elemento crucial para el final del telómero tapado, es por lo tanto posible que la respuesta al daño del ADN fue inducida por los telómeros disfuncionales. Con el establecimiento de HeLa y células MCF-7 albergaban los telómeros más cortos, se confirmó que la disfunción de los telómeros podría contribuir a la inactivación celular de las células cancerosas después de la irradiación de iones de carbono. Estos resultados proporcionan evidencia de que la inhibición de DNA-PKcs puede resultar en radiosensibilización debido a su papel fundamental en el extremo de los telómeros tapado.
En conclusión, se encontró que NU7026 sensibilizado significativamente las células MCF-7 y HeLa a la irradiación de iones de carbono. Este aumento de la radiosensibilidad fue poco probable causado por la reparación de daños en el ADN incompleto, pero por la disfunción de los telómeros. Nuestros resultados proporcionan evidencia que sugiere que la orientación de la proteína de protección terminal de los telómeros podría ser una manera eficaz de tratar el cáncer de mama.
Reconocimientos
Los autores desean agradecer Programa de Cooperación Exterior de la Academia China de Ciencias, Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia y la Nacional de Programa Cooperativo de Investigación. Los autores también agradecen a la Sra H. Arai y Sra. M. Nakajima por su asistencia técnica durante todo el estudio.