Extracto
Polycomb represivas Complejo 2 (PRC2) es un regulador epigenético inducida en muchos tipos de cáncer. Se cree que conducir la tumorigénesis mediante la represión de la división, stemness, y /o reguladores de desarrollo. Los cánceres evadir la detección inmunológica, y diversos reguladores inmunes son perturbados en diferentes tumores. No está claro cómo se coordinan tales efectos específicos de la célula. Aquí, se muestra un papel profundo y cáncer-selectivo para PRC2 en la represión de múltiples vías de las citoquinas. Nos encontramos con que reprime PRC2 cientos de IFN estimulados genes (ISGs), citocinas y receptores de citocinas. Este repertorio de destino se amplió de manera significativa en el cáncer de vs células no cancerosas, y es distinto en diferentes tipos de cáncer. por lo tanto PRC2 es un regulador de orden superior del programa inmune en las células cancerosas. La inhibición de PRC2 ya sea con inhibidores de ARNi o EZH2 activa los promotores de los receptores de citoquinas /citoquina marcados con bivalente cromatina H3K27me3 /H3K4me3, y aumenta la capacidad de respuesta a diversas señales inmunes. PRC2 rescates de inhibición de la inducción de genes inmune, incluso en ausencia de SWI /SNF, un supresor de tumor defectuoso en ~ 20% de los cánceres humanos. Esta nueva función PRC2 en las células tumorales podría afectar profundamente el mecanismo de acción y la eficacia de los inhibidores de EZH2 en el tratamiento del cáncer
Visto:. Abou El Hassan M, Huang K, Eswara MBK, Zhao M, L canción, Yu T , et al. (2015) Cancer Cells Hijack PRC2 para modificar múltiple de citocinas Caminos. PLoS ONE 10 (6): e0126466. doi: 10.1371 /journal.pone.0126466
Editor Académico: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Centro de Cáncer & amp; Research Institute, Estados Unidos |
Recibido: 29 Diciembre, 2014; Aceptado: 3 Abril 2015; Publicado: 1 de junio 2015
Derechos de Autor © 2015 Abou El Hassan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están disponibles en la base de datos de GEO, bajo el número de GSE67766. Este es un número Superseries, y dentro de ese conjunto de datos no son archivos individuales para todos los microarrays, Chip-chip, y los datos RNAseq
Financiación:. Este estudio fue apoyado por RB: 703079 Sociedad Canadiense del Cáncer (http: //www.cancer.ca/research), RB: RP 74570 Institutos canadienses de Investigación en Salud (http://www.cihr-irsc.gc.ca/e/193.html), RB: KF12-02 Krembil Fundación (http : //www.krembilfoundation.ca/), JJ: R01GM103893 Institutos nacionales de Salud (EE.UU.) NIH (http://www.nih.gov/)
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no hay existen intereses en competencia.
Introducción
las células cancerosas se emplean diversas estrategias para evadir el sistema inmune, incluyendo la regulación de las citocinas u otros factores secretados /receptores que controlan la respuesta inmune [1]. Cabe destacar que el tipo, la localización y el grado de infiltrado inmune en un tumor (el "Immunoscore") predicen el resultado mejor que una multitud de parámetros de patología-tumorales centrada tradicionalmente utilizados, tales como el grado del tumor [2]. Los factores que controlan la vigilancia inmune varían contextualmente y los detalles son complejos, ya que los agentes que promueven el aclaramiento inmunitario en una situación promueven la supresión inmune en otro (revisado en [3]). Una noción atractivo es que los tumores pueden utilizar un mecanismo común para manipular la expresión de los reguladores inmunes, y que cada tumor sastres esta estrategia para adaptarse a su entorno individual. La interrupción de una red de regulación de nivel superior, tales podría proporcionar una estrategia general para aumentar la detección inmunológica y liquidación de muchos tipos de cáncer. Sin embargo, los mecanismos que controlan la gran cantidad de genes que influyen en la vigilancia inmune no se conocen bien.
Polycomb represivas Complejo 2 (PRC2) es el regulador epigenético que los depósitos de marcas represiva de la histona H3 lisina 27 (H3K27me3) en la cromatina. Dos de sus componentes principales incluyen la subunidad catalítica EZH2, y SUZ12, la proteína andamio necesaria para la estabilidad del complejo [4]. PRC2 es parte de la familia Polycomb de los reguladores que contrarrestan los efectos positivos de la transcripción de miembros de la familia Trithorax durante el desarrollo, tales como el complejo de remodelación de la cromatina SWI /SNF [5]. PRC2, que a menudo se sobreexpresa en el cáncer, se considera que promueve la tumorigénesis a través de la regulación del ciclo celular, la replicación del ADN, la supervivencia, la senescencia y /o stemness [5-7]. Si, y en qué medida PRC2 podría influir en el sistema inmunológico en los tumores no está claro.
Antes, nosotros y otros demostramos que BRG1, el motor que impulsa ATPasa SWI /SNF, es necesaria para la capacidad de respuesta de IFN estimulado genes (ISGs ) [8-11]. En el
CIITA
locus, se encontró que BRG1 coordina la acción de muchos potenciadores distales. Sin embargo, a pesar de ser esenciales en el locus endógeno y una gran reportero kb 190, BRG1 es prescindible para IFN inducción de
CIITA
reporteros cortos, dando lugar a la idea de que puede moderar los efectos de un represor remoto. En un trabajo reciente, paralelo al presente estudio, se demostró que PRC2 y H3K27me3 decoran el
CIITA
locus, tanto en el promotor y entre potenciadores remotas [12]. Extracción PRC2 alivió la necesidad de BRG1, y un promotor a punto remoto -50 kb, tal y como se ha visto con BRG1. Nos preguntamos si este antagonismo entre BRG1 y PRC2 podría extenderse a otros objetivos de IFN. IFN juega un papel vital en la vigilancia inmune [13-20]. 20% de los cánceres humanos carecen funcional SWI /SNF [21], y este defecto o regulación de PRC2 podría proporcionar un mecanismo general de escape inmune en el cáncer. Por otra parte, la focalización de PRC2 a distintos loci podría ayudar a modelar el programa inmune específica requerida en diferentes tipos de cáncer.
A continuación, se muestra que PRC2 tiene un amplio papel en la represión de ISGs, e inesperadamente que también tiene una dramática y el cáncer papel selectivo en la regulación de muchas otras vías de citoquinas. La inhibición de PRC2 con ARNi o inhibidores de moléculas pequeñas EZH2 reactivó la capacidad de respuesta ISG, incluso en las células cancerosas SWI /SNF-deficientes. Por otra parte, un amplio análisis RNAseq reveló que interrumpir PRC2 activa múltiples vías de citoquinas y receptores de citoquinas. Esta función se amplió considerablemente en el cáncer de
vs
. las células no cancerosas, y podrían ser bloqueados por medios farmacéuticos. PRC2 es, pues, un regulador de orden superior de las vías inmunológicas en el cáncer, citoquinas, dirigidas a sus receptores, y los objetivos de abajo, y se adapta este programa según el tipo de cáncer. Las citoquinas tienen efectos pleiotrópicos en la tumorigénesis [3,22], y podrían tener una gran influencia en la eficacia de los inhibidores de EZH2 en el cáncer humano.
Material y Métodos
Cultivo de células y adenovirus
Las células fueron cultivadas como se describe [9] y se trataron con IFN humano (Invitrogen) a una concentración de 0,1 mg /ml. células SW-13 se transdujeron con adenovirus que expresan GFP (Ad-GFP) o proteína de fusión GFP-BRG1 (Ad-BRG1) describe [9]. virus AdBRG1 se valoró de manera que la expresión BRG1 igualada que en células HeLa [9].
ARN interferente pequeño (siRNA)
siSUZ12, siEZH2 y siCtrl se obtuvieron de Qiagen, y siBRM de Thermo Scientific . SW-13 células a 2x10
6 por plato de 10 cm se transfectaron con 50 nM siCtrl, siSUZ12 o siEZH2 solo o con 75 nM siBRM durante 3-4 días utilizando DharmaFECT-1 (Thermo Scientific). Las células se sub-cultivaron a 2x10
plato 6 por 10 cm y se sometieron a un segundo ciclo de la transfección, asegurar una mejor agotamiento H3K27me3. Posteriormente, las células se trataron con 0,1 mg /ml IFN humano durante 6 horas.
Westerns
Westerns se realizaron como se describe [23]. Para los anticuerpos ver Tabla S4.
RT-PCR y matrices de expresión
ARN fue inverso-transcrito y se analizó por PCR cuantitativa. Los valores se normalizaron a beta-actina [9]. Los cebadores están en la Tabla S4. Para arrays de expresión, la calidad del ARN se verificó usando Bioanalyzer (Agilent Inc.), se convirtió en ADNc, seguido de 2
nd síntesis de la cadena y la preparación ARNc usando el kit Ambion (Applied Biosystems). cRNA fue purificado por columna de la calidad comprueba mediante Agilent Bioanalyzer. 1,5 mg se hibrida con Illumina todo el genoma arrays de expresión. AdGFP /BRG1 y muestras siCtrl /siSUZ12 se hibridó con BeadChips-WG6 humano Expresión y HT-humano-12 BeadChips de expresión, respectivamente (Illumina, Inc.). análisis de expresión diferencial se realizó mediante la normalización promedio por el software BeadStudio (Illumina Inc). Tres repeticiones biológica se incluyeron para cada grupo de tratamiento.
chip qPCR, chip en el chip y chip-ss
Se realizó ADN chip-qPCR como se describe [10,24]. Los anticuerpos y los cebadores están en S3 & amp; S4, respectivamente. Los anticuerpos fueron validados previamente [25] y que verifican además anticuerpos H3K27me3 y H3K79me3 utilizando transferencias de puntos. Para Chip-chip, se amplificó el ADN inmunoprecipitado, etiquetado, y se hibrida a 1M humano arrays promotor de mosaico (Agilent). TileMap se utilizó para definir las regiones con enriquecido significativamente H3K27me3 [26], y las intensidades se normalizaron a los estándares internos. Los picos se clasifican de acuerdo a su valor de los estadísticos de prueba (máxima estadística TileMap-MA: Maxm /P [26]). Métodos para establecer un punto de corte Maxm /P se describen en el texto S1 (métodos complementarios). Para más detalles sobre el análisis de los datos de chip-ss, véase el texto S1 (Métodos complementarias).
RNA-Sequencing
ARN de calidad fue probada usando Bioanalyzer (Agilent). perlas de oligo-dT se utilizaron para aislar poli (A)
+ mRNA, y después de la fragmentación aleatoria ~ 300 pb fragmentos de ARN se utilizaron para preparar bibliotecas de ADNc multiplexados utilizando Illumina TruSeq RNA Kit Preparación de la muestra. secuenciación de alto rendimiento de bibliotecas se ha realizado mediante Illumina HiSeq 2000 en IRVB. La secuenciación lee de cada muestra en formato FASTQ se evaluaron con FASTQC, y la calidad de base por secuencia y por el contenido de GC indicó secuencia de datos de alta calidad. Los datos fueron mapeados en el genoma humano (hg19) usando TopHat 1.4.1 que permite hasta dos desajustes [27]. No único lecturas fueron filtrados. El recuento de lecturas (o ensamblaje) para cada gen se calculó mediante una tubería a base de R personalizado ((http://www.r-project.org). Para más detalles sobre cómo se evaluaron la calidad de los datos y los genes expresados diferencialmente ver el texto S1 (Métodos complementarios y resultados) guía
Conjunto de Análisis de genes de enriquecimiento
Se extrajeron los genes con log
2fold cambio & gt; 0. y probabilidades diferenciales & gt; 0,5 y clasificaron los genes SUZ12 suprimida por la disminución valores de probabilidad diferenciales. Se utilizó la función GSEA Preranked para analizar el enriquecimiento de los genes clasificados en los conjuntos de genes C2 exportados de KEGG versión vía 3.1 con los genes en los conjuntos de genes identificados por HUGO símbolo de genes. seleccionamos vías enriquecidas con alta puntuación enriquecimiento (ES) por un punto de corte de valor nominal P (NOM p-val) & lt; 0,01 y FDR q-val. & lt; 0,05 Para la "interacción receptor de citoquina-citoquina" (CCRI) vía, que además aplicada análisis Leading-Edge GSEA para extraer los miembros de la vía que explican el enriquecimiento. Hemos agrupado los genes con su probabilidad dE través de las seis líneas celulares de cáncer de genes comunes y afectados de manera diferente en diferentes células cancerosas dentro de la misma vía. Se utilizó el mapa KEGG vía de la vía CCRI (http://www.genome.jp/kegg/pathway.html, mapa 04060) para generar esquemas. La agrupación de análisis y visualización se llevaron a cabo con MeV (http://www.tm4.org/mev.html).
Detección de citoquinas
Para SUZ12 desmontables, las células A549 fueron tratados por-dos ciclos como por arriba. Para la inhibición de la droga Ezh2, las células fueron tratadas durante dos ciclos de cuatro días con 2 uM GSK343 o UNC1999. Al final de cada tratamiento, las células se sembraron 3x10 @
4 pocillos /pocillo en 96. Las células se dejaron reposar durante 4 horas y luego las concentraciones indicadas de los diversos estímulos se añadieron (LPS, IFN, IL1β y TNFa). Los sobrenadantes de cultivo se recogieron después de 24 h y se congelaron hasta su uso. ELISA se realizó por duplicado utilizando IL6-, IL8- y kits ELISA CXCL10-Max Deluxe de Biolegend. El análisis múltiplex de citoquinas en los sobrenadantes del cultivo se realizó a través de la matriz humana primaria de citosina /quimiocina matriz de ensayo de 41-Plex de Eva Technologies Corporation, Canadá. Se llevaron a cabo tres experimentos independientes. Se realizó un análisis de Western blot para asegurar SUZ12 derribar y regulación a la baja de H3K27me3 después de cada experimento.
Resultados
El antagonismo de genoma completo entre BRG1 y PRC2 a blancos IFN
SWI /SNF regula ISGs [8-11,28-30], pero la relación funcional con PRC2 es desconocida. Para comparar los objetivos de todo el genoma, las células SW-13 BRG1 deficientes fueron transducidas con vectores adenovirales que expresan BRG1 (Ad-BRG1) o GFP (Ad-GFP), o transfectadas con siCtrl o siSUZ12, deja sin tratamiento o IFN-estimulado durante 6 horas y microarrays utilizado para evaluar los niveles de mRNA. SUZ12 es una subunidad central de PRC2 y sus resultados de pérdida en la degradación de la subunidad enzimática, EZH2 [4]. Nos centramos en los genes a la que AdBRG1 o siSUZ12 indujo la expresión ≥ 2 veces (para un resumen global de datos, ver los gráficos circulares en la figura 1). Una discusión detallada de las clases de datos de genes y se proporciona en S1 texto (véase la primera sección de Resultados complementarias); este último proporciona amplios detalles sobre el grado en que BRG1 y PRC2 regulan basal y la expresión de genes IFN inducido. Sorprendentemente, la reconstitución BRG1 o tratamiento siSUZ12 mejoran la inducción de 87% (95/109) de ISGs, pero afectadas expresión basal de solamente ~ 2% de todos los genes (Fig 1). Por otra parte, de la 2% de todos los genes cuya expresión se vio afectada basal, 14% (48/342) fueron co-regulados por SWI /SNF y PRC2, mientras que 34% (32/95) de ISGs eran co-regulados. El efecto de SWI /SNF y PRC2 en los genes co-regulados era antagonista. tiempo real, análisis de PCR de 52 ISGs confirmó la predominante BRG1-dependencia en esta clase de genes (Fig A en S1 de archivos), y siSUZ12 rescatado de respuesta a 5/7 ISGs BRG1-dependiente, mientras que ISGs o genes de control BRG1 independiente no se vieron afectados (Fig B, Grupo B en S1 archivo). Un segundo SUZ12 siRNA también rescatados ISGs BRG1 dependiente (Fig C en S1 archivo). PRC2 agotamiento inducido marginalmente la proteína relacionada con BRM-BRG1 (Fig B, Grupo A en S1 Archivo). Para evaluar si esta ligera inducción podría explicar la inducción de algunos ISGs derribaron BRM. Este paso adicional tenía ninguna o sólo un ligero efecto sobre rescate de ISGs BRG1 dependiente por siSUZ12 (Figs B, D en S1 File). Rescate de ISG-respuesta también no era debido a la inducción de IFN endógenos, ya que el tratamiento RNAi no tuvo ningún efecto sobre los niveles de fosforilación de STAT1 o proteínas IRF1, ya sea en células SW13 [12], o en múltiples otras líneas celulares (ver a continuación).
Microarrays se realizaron con ARN de las células SW-13 para evaluar el efecto de BRG1-reconstitución o knockdown SUZ12 en la expresión basal de todos los genes (a, 465 genes afectados) o la capacidad de respuesta de IFN (B, 109 ISGs). Los tratamientos se indican en rojo y azul por encima de cada mapa de calor, clases de genes se indican mediante barras de color a la izquierda de cada mapa de calor, y los gráficos de tarta resumen el% de los genes en cada clase (A) (gris = genes afectados A). Una carta adicional a la derecha del mapa de calor en (A) clasifica los genes sobre la base de: 1. la capacidad de respuesta de IFN (ISGs = 12), o GO términos: 2. Desarrollo (n = 118); 3. Señalización celular (n = 64); 4. La migración de células (n = 24). Clase de genes Abreviaturas: expn: Expresión; Br: Brg1, Z: SUZ12; S: Estimulado; R: reprimido; I: El interferón-γ; G:. Génica
Si PRC2 regula directamente ISGs, estos objetivos deben exhibir H3K27me3. En primer lugar, hemos abordado esta cuestión utilizando el chip-qPCR, el establecimiento de puntos de corte para el posterior análisis de todo el genoma. Se estudiaron 30 promotores: 10 ISGs rescatados por siSUZ12 o BRG1, 6 ISGs rescatados por siSUZ12 solamente, 6 ISGs rescatados por BRG1 solamente, 3 ISGs no afectados por siSUZ12 o BRG1, y 5 controles positivos para H3K27me3. IRF1, no afectado por cualquiera de PRC2 o BRG1, carecía H3K27me3 y actuó como línea de base (Fig E en S1 Archivo). H3K27me3 se detectó en 15/16 de los promotores ISG siSUZ12 regulados, pero sólo 4/9 de los ISGs no afectados por siSUZ12 (Fig E, Panel A en S1 File) (p & lt; 0,05, prueba exacta de Fisher), y H3K27me3 fue significativamente superior al del primero (figura E, Grupo B en S1 archivo)
.
todo el genoma chip-chip de revelado ~ 1/5
º de promotores tenido algún H3K27me3 (al menos una bandeja de 1,5 x 100 pb por encima de control). La intensidad media H3K27me3 alcanzó su punto máximo +/- 1 kb en torno a la SAT de todos los genes (Fig F Paneles A, B en S1 de archivos), y los niveles de anti-H3K27me3 correlacionan con la expresión basal (figura F, paneles C, D en S1 de archivos), consistente con otros tipos de células (revisado en [6]). Centrándose en los genes a la que BRG1 y /o siSUZ12 estimularon la expresión, aquellos con los niveles más altos H3K27me3 fueron reprimidos por PRC2 (BRS /CRC & amp; CRC; la figura G, Paneles A-E en S1 Archivo). El nivel medio de H3K27me3 en ISGs fue similar a la observada en todos los genes silenciosos (c.f. Fig 2A y 2F, panel A en S1 File). ~ 40% de ISGs tenía algún H3K27me3 (Fig 2B), que es ~ 2x más de todos los genes (c.f. Fig F, Panel B en S1 File). Como en todos los genes, el nivel y la frecuencia de H3K27me3 correlacionan con la expresión basal (Figura 2C y 2D). Por otra parte, en ISGs basales silenciosas, el nivel y la frecuencia de H3K27me3 fue significativamente mayor en los loci donde siSUZ12 mejorado la capacidad de respuesta de IFN (Figura 2E-2I, ZR-ISGs, s /ZR-ISGs).
Todo el genoma chip -chip de datos se utilizó para evaluar los niveles de H3K27me3 a los promotores del ISG. intensidad de la señal (A) chip-chip de contenedores por cada 100 pb dentro de +/- 5 kb de la SAT de los 109 ISGs definidos en la figura 1B. (B) Porcentaje de H3K27me3 promotores ISG positivos y negativos. (C) la intensidad de señal chip-chip como en (A), pero agrupados de acuerdo a la expresión basal ISG. (D) Histograma del porcentaje de H3K27me3 ISGs positivos y negativos en relación con su expresión génica basal. código (E) Color de ISGs basalmente silenciosas analizados en (F) - (H). (F) de mapa de calor muestra la señal H3K27me3 chip-chip de basales dentro de +/- 1 kb de la SAT de las clases ISG, basales silenciosas indicados. intensidad de la señal (G) chip-chip de contenedores por cada 100 pb dentro de +/- 1 kb de la SAT de ISGs basales silenciosas. plot (H) Violín muestra el nivel de la señal media chip-chip. Los asteriscos indican una diferencia significativa (P & lt; 0,05, Mann Whitney) entre los grupos indicados. (I) Histograma muestra el porcentaje de promotores H3K27me3 positivos en cada clase de ISG indicado. *: Significativamente mayor% de H3K27me3 ISGs positivas entre los grupos indicados (P & lt; 0,05, prueba exacta de Fisher). Clase de genes Abreviaturas: Br: Brg1, Z: SUZ12; S: Estimulado; R: reprimido; I: El interferón-γ; G: Gen
En conjunto, los datos de expresión y de la cromatina vinculante por encima de exponer una extensa papel, antagónica de SWI /SNF y PRC2 en la capacidad de respuesta de IFN
reprime PRC2 Múltiples Vías inmune en.. las células cancerosas
Para evaluar la relevancia general de nuestros hallazgos, se realizó un análisis RNAseq después de la depleción PRC2 en 8 cáncer y 3 líneas celulares derivadas de la no-cáncer (Cancer: A549, adenocarcinoma de pulmón; Panc.04.03 & amp; AsPC1 , los adenocarcinomas de páncreas; PC3, el cáncer de próstata; MCF-7 & amp; MDA-MB-231, cánceres de mama, HeLa, cáncer de cuello uterino; y SW-13, el cáncer de la corteza suprarrenal; no cancerígenos: 184-A1, de mama; HPB-1 de próstata y BEAS-2B de pulmón). Westerns reveló que SUZ12, EZH2 y /o los niveles de H3K27me3 fueron típicamente elevadas en líneas de cáncer en comparación con líneas no cancerosas (Fig H en S1 File). niveles BRG1 /BRM variaron entre el cáncer y no cancerosas líneas con los más bajos en el A549, AsPC1, Panc.04.03 y 184A1 (Fig H en S1 Archivo). los niveles de EZH2 y SUZ12 correlacionados entre sí pero no con H3K27me3 a granel, y los niveles de PRC2 y BRG1 o BRM estaban correlacionados (Fig H, Panel B en S1 File). Estos hallazgos subrayan la importancia de variables de los estudios funcionales para deducir el efecto de PRC2 sobre la expresión génica, porque simplemente la evaluación de niveles del complejo o la marca revela poco sobre su papel en las células cancerosas o no cancerosas.
Las células fueron tratadas con siCtrl o siSUZ12 y se deja sin tratamiento o se expone a concentraciones fisiológicamente relevantes de IFN (0,2 ng /ml), comparable a la secretada por las células NK expuestas a células tumorales [31,32]. SUZ12-agotamiento reduce H3K27me3 en todos los tipos de células, y el aumento de H3K27ac en algunos (HeLa, MDA-MB-231, PC3), pero no afectó subunidades SWI /SNF (Fig I en S1 File). Siguiente ensayos de RNA-Seq se llevaron a cabo para evaluar el efecto de la caída en SUZ12 basal o la expresión génica inducida por IFN (44 ensayos, 4 condiciones x 11 líneas), y los resultados se validaron utilizando análisis de componentes principales y análisis de correlación. El efecto de la derribando SUZ12 en la expresión génica también se confirmó con un siRNA de copia de seguridad contra SUZ12. Para una discusión completa por favor consulte la sección titulada "Validación de datos RNAseq" en S1 Texto (Resultados complementarias), que se refiere a los datos de validación de las figuras J-M en S1 del archivo, y en la Tabla S2.
De acuerdo con un amplio papel para PRC2 en ISGs ISGs, reprimidos-SUZ12 (ZR-ISGs) se observaron a través de múltiples líneas celulares (figura 3, figura N en S1 archivo, S2 Tabla). Entre las dos categorías más abundantes ISG (ZR-ISGs y ISGs no afectada por SUZ12 (N-ISGs)), hubo diferencias específicas de las células en números absolutos de ZR-ISGs (rango de 13 a 152, con una media 70, la mediana 43), pero siSUZ12 mejorada inducción de entre 13% y 77% (media del 45%, la mediana 43%) en 7/8 líneas celulares (figura 3). Estos valores son conservadores, ya que había otras clases de genes menor abundancia más complejas en las que SUZ12 afectado expresión ISG (S1 Tabla). La mayor parte N-ISGs (68%) y ZR-ISGs (72%) eran específicos para cada tipo de células (Fig O en S1 de archivos), lo que indica que, además de un conjunto básico, cada línea induce un cóctel ISG distinta. Esto es consistente con la naturaleza específica del contexto de la vigilancia inmune [3], y con la cromatina de células específicas de la unión por PRC2 [33]; de hecho, de los genes reprimidos por SUZ12 solo (CRC-N), el 77% eran exclusivas de una línea celular (Fig O en S1 Archivo). Además, la fracción de ZR-ISGs fue menor en los no-cáncer en comparación con líneas de cáncer, con las tres líneas que no tienen cáncer nº 7
ª, 8
º y 11
lugar entre los 11 líneas evaluadas ( S1 tabla).
Heatmaps muestran el efecto de los cuatro tratamientos (columnas 1-4, clave en la tabla a derecha) sobre la expresión de ISG en un panel de pulmón, páncreas, mama, cuello del útero, cáncer de células de la corteza suprarrenal y la próstata líneas. Las células fueron transfectadas con siCtrl o siSUZ12 y dejaron sin tratar o estimuladas con IFN durante 6 horas. ISGs se clasifican en ISGs reprimidos-SUZ12 (Zr-ISGs, amarillo) y ISGs que no están regulados por PRC2 (N-ISGs, verde). El porcentaje de Zr-ISGs y N-ISGs se muestran en los diagramas de sectores por encima de cada mapa de calor, y el número total de ISGs por línea se indica debajo de cada mapa de calor.
A continuación, nos dirigimos a los efectos de agotamiento PRC2 sobre la expresión génica basal. Nuestro análisis de microarrays en células de carcinoma suprarrenal SW13 no reveló un efecto importante sobre los genes inmunes hasta que nos trataron con IFN (Figura 1), pero se preguntó si podría haber un efecto más prominente en la expresión basal de las vías inmunológicas en otros tipos de cáncer. Para descifrar las principales vías afectadas, se utilizó conjunto de genes de enriquecimiento de análisis (GSEA) [34]. Sorprendentemente, siSUZ12 indujo la expresión basal de múltiples componentes inmunológicos en 6/8 líneas de cáncer, de los cuales la "interacción del receptor de citoquinas /citoquina" (CCRI) conjunto de genes se vio afectada en todas las líneas 6 (figuras 4 y 5), y en 4 líneas la clase CCRI fue el conjunto de genes parte superior o en segunda posición (* P en la figura S1 en el archivo). Estos resultados fueron validados por múltiples genes con dos siRNAs contra SUZ12 (S2 Tabla). Entre las seis líneas de cáncer en los que se indujo el conjunto de genes CCRI, el 61% de los genes son regulados hasta específicamente en 1 o 2 de las líneas celulares (Fig Q en S1 Archivo). Por lo tanto, no sólo regula PRC2 ISGs, pero su efecto sobre el sistema inmune en células de cáncer se extiende a numerosas citoquinas y receptores de citoquinas, y similar a ISGs, que afecta a diferentes genes CCRI en contextos de cáncer distintos.
Resumen de GSEA análisis de genes inducidos diferencialmente por siSUZ12 en relación con siCtrl en 6 cáncer y líneas celulares derivadas no cancerosas 4. Las líneas celulares incluidos en el mapa de calor se indican a la derecha; una señal significativa se indica en gris. vías biológicas similares se agrupan, y resaltan con un color distinto a la derecha, y su nombre de la clase general, se indica a la izquierda.
A. Mapa de calor de los genes inducidos de manera significativa por CCRI siSUZ12 (Probabilidad diferencial & gt; 0,9) en 11 líneas celulares (verde no cáncer, cáncer azul). Para los nombres de líneas celulares correspondientes a cada número See (F). estrellas azules en esto y paneles posteriores indican líneas celulares en las que la vía CCRI fue significativamente enriquecido de acuerdo con GSEA. BE Heatmaps de subconjuntos de los datos en (A), separadas por tipo de tejido: B. mama (184 no canceroso
vs
MCF7 y MDA-MB-231 de cáncer.), C. de pulmón (BEAS-2B no : cáncer
vs
. cáncer A549), D. próstata (HBP-1 no canceroso
vs
. PC-3 cáncer), y E. Otras líneas celulares de cáncer de páncreas 4 (Panc .04.03 y AsPC1), cuello uterino (HeLa) y la corteza suprarrenal SW-13) origen (. F. La frecuencia de los genes del CCRI inducido a través de los 271 genes CCRI en cada línea celular.
En marcado contraste con líneas de cáncer, siSUZ12 no enriquecer para conjuntos de genes inmunes en diferentes al cáncer de mama, de próstata y de pulmón líneas (Fig 4, Fig Q en S1 File). Para ampliar este análisis, se utilizó GSEA para analizar los datos publicados de RNAseq SUZ12-desmontables en las células HEK-293T humanos [35]. Estos son células no cancerosas derivadas de origen neural que expresan oncogenes virales, pero se transformaron
in vitro
, independiente del sistema inmune [36]. GSEA reveló que PRC2 agotamiento no afectó significativamente CCRI u otras rutas inmunes (Fig 4). Por lo tanto, PRC2 alteró significativamente en vías CCRI 6/8 líneas celulares de cáncer, pero 0/4 contextos que no tienen cáncer. el agotamiento PRC2 hasta reguladas algunos genes CCRI en líneas celulares derivadas de no cancerosas, pero menos que en las células cancerosas, insuficiente para alcanzar significación en GSEA, y los genes afectados eran distintos en el cáncer vs líneas no cancerosas de la concordancia de los tejidos (Figura 5) . Estos datos indican un papel amplio para PRC2 en la regulación del sistema inmunológico, que se altera y se expandió de manera significativa en el cáncer.
SUZ12 Derribo Induce Los genes con promotores bivalentes
Para definir si la represión mediada por PRC2 inducida por los genes siSUZ12, especialmente la subclase CCRI, es directa, que minó H3K27me3 chip-ss datos disponibles para las células de cáncer de pulmón A549, y la comparamos con nuestros datos RNAseq +/- siSUZ12 (figura 6A). En paralelo, se comparó la distribución H3K4me3, que marca promotores activos o contrapesado. agrupamiento no supervisado identificó 10 patrones H3K27me3 /H3K4Me3 distintas. siSUZ12 genes más altamente inducidos, incluyendo el subconjunto CCRI estaban en grupos de 1-4, con una amplia cobertura promotor H3K27me3 (figura 6A-6D). Sin embargo, la mayoría de los genes con alta promotor H3K27me3 no respondieron a siSUZ12 (figura 6A), lo que subraya la importancia de medir el efecto sobre la expresión génica. Cabe destacar que la media de la señal H3K4me3 fue considerablemente mayor siSUZ12 través de los genes sensibles, incluyendo el subconjunto CCRI, en comparación con los genes que se vieron afectados por siSUZ12 o 1000 conjuntos de genes al azar (Figura 6E). De este modo, los genes que están inducida después de la interrupción PRC2 tienen un bivalente firma H3K27me3 /H3K4me3, y los genes inducidos CCRI-siSUZ12 son típicos de este grupo.
Los datos de chip-ss de las células A549 se utilizó para evaluar las marcas de la cromatina en siSUZ12 genes inducidos. A. Sin supervisión K-means clustering se llevó a cabo en las señales H3K27me3 y H3K4Me3, y se representa como mapas de calor en todo el TSS (para más detalles ver "análisis de datos chip-ss en S1 texto, métodos complementarios). Las 10 agrupaciones resultantes (ID Cluster (CID) 1-10) se representan en la orden de cambio promedio log2Fold en la expresión génica después del tratamiento siSUZ12 como se muestra en los gráficos de puntos a la derecha. En el gráfico de puntos, todos los genes (izquierda) o genes CCRI (derecha) muestran el cambio log2Fold para cada gen; puntos rojos indican los genes inducidos de manera significativa por siSUZ12 (probabilidad diferencial & gt; 0,9). La expresión basal se muestra en el extremo derecho (Gris claro: bajo; gris: medio; gris oscuro: alta). B. Muestra grupos de genes revelados en el panel A. Proporción de todos los genes inducidos por siSUZ12 (rojo) en los CID 1-4 o 5-10 (como se muestra en los gráficos de puntos en A). C. Proporción de la vía de los genes inducidos por el CCRI siSUZ12 (rojo) en los CID 1-4 (línea roja) o 5-10 (esquema azul). D. señal media H3K27me3 chip en torno a la SAT para los grupos indicados de genes (clave hacia la derecha; ZR-Genes: todos los genes reprimidos; SUZ12 N-Genes: no afectados por siSUZ12; CCRI-ZR: CCRI genes que son reprimidos-SUZ12 ; N-CCRI: genes CCRI no afectadas por SUZ12; Rand: 1000 conjuntos de genes al azar, n = mediana de los otros cuatro conjuntos de genes). E. Lo mismo que (D) a excepción de las señales H3K4me3 chip en los CID 1-4 (es decir, aquellos con alta H3K27me3).
Inhibidores de moléculas pequeñas EZH2 Aumenta múltiple inmune Rutas
Nuestros datos aumentar la posibilidad de que los fármacos que inhiben PRC2 pueden impulsar la vía de activación inmune en las células cancerosas. Cuando cuatro líneas celulares de cáncer se trataron con 2 M de GSK343 [37] o UNC1999 [38], cualquiera de los fármacos redujeron marcadamente los niveles de H3K27me3 (Fig R en S1 File). RT-PCR análisis reveló que de 8 ISGs SUZ12-reprimidos (ZR-ISGs) en las líneas de 4 células (32 casos) UNC1999 aumentada de IFN-respuesta en 30 casos (94%) y GSK343 lo hizo en 15 (50%) (Fig S en S1 File). El tratamiento no tuvo efecto sobre los no ISGs como
PITX2
o
HPRT
o en el mRNA o los niveles de proteína de IRF1, un ISG PRC2-independiente (Figs R, S en S1 File). UNC1999 mRNAs en un grado mayor que GSK343 inducida pesar de los efectos aparentemente similares en los niveles de H3K27me3 granel. Esto puede reflejar diferencias sutiles en la cinética y /o la cantidad total de agotamiento H3K27me3 en potenciadores o promotores específicos, que no se reveló mediante análisis de Western del total H3K27me3. Independientemente, estos datos muestran que los inhibidores de la EZH2, como siSUZ12, aumentan la inducción de ARNm ISGs PRC2-reprimido.
Por último, se evaluó si la inhibición PRC2 aumenta la inducción de citoquinas en respuesta a otras señales inmunes y si estos efectos se observan en el nivel de proteína. Para ello, se trataron las células de cáncer de pulmón A549 con TNFa, IL1β,
E
.
coli
lipopolisacárido (LPS), así como IFN, y la secreción de las citoquinas evaluadas CXCL10, IL6 y IL8 . A diferencia de la inducción de mRNA, la inhibición PRC2 solo no aumentó los niveles de proteína, pero cuando las células fueron expuestas a una de las cuatro señales inmunes, siSUZ12 o UNC1999 aumentada de citoquinas proteína de inducción (Fig 7A-7C, Fig T en S1 Archivo, S2 Tabla). Estos datos están en línea con la bien establecida la regulación, post-transcripcional de la producción de citoquinas para prevenir reacciones inmunológicas adversas, tales como la inflamación crónica. Por ejemplo, además de la transcripción de genes (dentro del control directo de PRC2), las citoquinas son también fuertemente regulados a nivel de la estabilidad del ARNm y /o traducción a través de motivos tales como el elemento AU-Rich (ARE), Constitutiva Decay Elemento (CDE ), Codificación Región Determinante de la Inestabilidad (CRD) y varios otros [39]. Nuestros resultados sugieren que PRC2 regula el componente de la transcripción, pero no el control post-transcripcional, que requiere una señal adicional desde el sistema inmune.