Extracto
Antecedentes
neuritis páncreas es una característica histopatológica de la neuropatía de páncreas y se correlaciona con abdominales sensación de dolor neuropático en el adenocarcinoma de páncreas (CP) y la pancreatitis crónica (PC). Sin embargo, los subtipos de células inflamatorias que componen la neuritis páncreas y su correlación con el síndrome de dolor neuropático en el CP y CP son todavía desconocidos.
Métodos
Las células inflamatorias dentro de las lesiones pancreáticas neuritis de los pacientes con CaP (n = 20) y CP (n = 20) fueron immunolabeled y colorimétricamente cuantificó con el CD45 marcador de pan-leucocitos, con CD68 (macrófagos), CD8 (linfocitos T citotóxicos), CD4 (células T auxiliares), CD20 (linfocitos B ), NCL-PC (células plasmáticas), elastasa de neutrófilos, GPR2 (eosinófilos), célula anti-mástil triptasa (MC) y correlacionado con la sensación de dolor. subtipos de células cebadas perineurales fueron analizadas por doble inmunomarcación con MC quimasa. Expresión y inmunoreactividad neuronal de la proteasa activada por el receptor tipo 1 (PAR-1) y tipo 2 (PAR-2) fueron analizados en el CP y CP y se correlacionaron con el estado de dolor de los pacientes.
Resultados
En el CP y CP, nervios fueron predominantemente infiltrada por linfocitos T citotóxicos (PCA: 35% de todas las células inflamatorias perineurales, CP: 33%), macrófagos (PCA: 39%, CP: 33%) y MC (PCA: 21%, CP: 27%). En ambas entidades, la sensación de dolor neuropático se asoció con un aumento específico de perineural MC (CaP y sin dolor: 14% vs. CaP con el dolor: 31%; CP sin dolor: 19% vs CP con el dolor: 34%), que no afecta la frecuencia de otros subtipos de células inflamatorias. La gran mayoría de estos MC contenía MC quimasa. PAR-1 y PAR-2 expresión no se correlacionó con la sensación de dolor de los pacientes con CaP y CP.
Conclusión
neuritis pancreático en AP y CP se compone de linfocitos T citotóxicos y los macrófagos, MC. El enriquecimiento específico de MC alrededor de los nervios intrapancreáticos en el dolor neuropático debido a la PCa y CP sugiere la presencia de hipersensibilidad visceral inducida por MC en el páncreas. Por lo tanto, las neuropatías entéricas pancreáticas y parecen compartir un tipo similar de interacción neuro-inmune en la generación de dolor visceral
Visto:. Demir IE, Schorn S, Schremmer-Danninger E, K Wang, Kehl T, Giese NA, et al. (2013) Las células cebadas perineural se enriquecen en concreto pancreático neuritis y dolor neuropático en el cáncer pancreático y la pancreatitis crónica. PLoS ONE 8 (3): e60529. doi: 10.1371 /journal.pone.0060529
Editor: Anthony WI. He aquí, la Universidad China de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 15 de diciembre de 2012; Aceptado: 27 Febrero 2013; Publicado: 28 Marzo 2013
Derechos de Autor © 2013 Demir et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Estos autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la inflamación y el cáncer se entrelazan en la generación, por supuesto y el resultado de tumores malignos humanos. Un subtipo específico y único de la inflamación relacionada con el cáncer se encuentra alrededor de los nervios en los tumores pancreáticos, especialmente en el cáncer de páncreas (CP) y en el tumor de páncreas cabeza inflamatoria asociada a la pancreatitis crónica (PC). De hecho, tanto de estos tumores con frecuencia contienen focales grupos de células inflamatorias alrededor de los nervios intrapancreáticos [1], [2]. En su estudio de microscopio electrónico seminal sobre los nervios de CP, Dale Bockman informó sobre la presencia de un daño severo en tales nervios que se infiltró específicamente por las células inflamatorias [3]. Estudios posteriores hicieron la contribución de decidir en relación con la importancia de esta infiltración de células inmunes neuronal específica denominada
neuritis páncreas Hoteles en pacientes con CaP y CP: El aumento de la frecuencia y la gravedad de la neuritis páncreas han demostrado tener una correlación importante con la gravedad de la sensación de dolor abdominal y alteraciones de plasticidad en el CP y los pacientes con PC [1], [4], [5].
Mecanismos de neuritis páncreas aún no se han dilucidado. En cuanto a los mediadores inflamatorios implicados en neuritis pancreático, interleucina-8 (IL-8), la fractalquina quimioquinas neuronal y su receptor CX3CR1 se ha demostrado que se sobreexpresa en los nervios en el tejido CP, y aumento de la presencia fractalquina endoneural se detectó que se correlaciona con la severidad de neuritis pancreática, la infiltración de macrófagos del tejido y la sensación de dolor [6] - [8].
los subtipos exactos y las características de las células inmunes que infiltran los nervios pancreáticos son todavía desconocidos. En el único estudio relacionado con esta cuestión, Keith et al. demostrado de forma semi-cuantitativa del aumento de la presencia de eosinófilos alrededor de los nervios en CP y la asociación entre la sensación de dolor y el grado de infiltración eosinofílica perineural [9].
Una mejor comprensión de las características del infiltrado de células inflamatorias perineural en el CP y CP es probable que permiten un profundo conocimiento de los mecanismos de neuritis páncreas. Por lo tanto, en el presente estudio, encaminado a proporcionar una caracterización cuantitativa sistemática de grupos de células inflamatorias asociadas con neuritis pancreáticas en el CP y CP. Con este fin, hemos cuantificado los leucocitos peri y endoneurales en el páncreas humano normal (NP), el CP y CP. Además, se investigó la distribución cuantitativa de un gran panel de marcadores de leucocitos de subconjunto en el CaP y el tejido CP, incluyendo CD68 (macrófagos), CD8 (linfocitos T citotóxicos), CD4 (células T auxiliares), CD20 (linfocitos B), NCL-PC (células plasmáticas), elastasa de neutrófilos, proteogylcan 2 /GPR2 (eosinófilos) y anti-células mástil triptasa (MC) y quimasa inflamatorias dentro de las agrupaciones neuronales. Por último, se correlacionó la cantidad de estos subconjuntos de células inflamatorias neuronales, y la expresión de dos receptores potenciales (proteasa activada por los receptores /PAR-1 y PAR-2) para proteasas derivadas-MC a la sensación de dolor neuropático de CaP y pacientes con PC .
Materiales y Métodos
Ética declaración
el estudio fue aprobado por los comités de ética de la Universidad Técnica de Munich, Munich, Alemania y la Universidad de Heidelberg, Alemania.
pacientes y tejidos
muestras de tejido pancreático para inmunohistoquímica fueron recogidos de los pacientes después de la resección pancreática cabeza de cáncer de páncreas (CP, n = 20; macho /hembra = 8/12, edad media = 66 años ) y la pancreatitis crónica (PC, n = 20; hombre /mujer = 13/7, edad media = 51 años). Todos los pacientes fueron informados, y se obtuvo el consentimiento por escrito para la recogida de tejidos. De acuerdo con la clasificación internacional de la UICC (2009), todos los pacientes tenían fase IIb cáncer de páncreas. La etiología de la PC fue alcohólica en todos los pacientes. Debido a frecuencia observada proceso inflamatorio concomitante en los márgenes de resección de muestras de tejido de páncreas, muestras de tejidos pancreáticos normales se obtuvieron de donantes de órganos sanos (NP, n = 10; macho /hembra = 6/4, edad media = 38 años) cada vez que había sin receptor adecuado para el trasplante disponible. La recogida de tejidos fue aprobado por los comités de ética de la Universidad Técnica de Munich, Munich y la Universidad de Heidelberg, Alemania. Las muestras de tejido pancreático resecado se dividieron en partes que se fijaron inmediatamente en paraformaldehído al 4%, seguido de inclusión en parafina, como se describe anteriormente [1], [10]
El dolor abdominal.
En todo pacientes con CaP y CP, el estado individual del dolor (Pain vs ausencia de dolor) y la puntuación individual del dolor (intensidad del dolor y la frecuencia) se registraron prospectivamente antes de la operación, tal como se describe anteriormente [2]. La intensidad del dolor se clasificó mediante el uso de una escala corta: 0 = ninguno, 1 = leve, 2 = moderado y 3 = dolor fuerte. la frecuencia del dolor se clasificó como 3 = día, 2 = semanal y 1 = mensual. Para calcular la gravedad del dolor, la intensidad del dolor y la frecuencia del dolor de cada individuo se multiplicaron. De acuerdo con la puntuación final el dolor, los pacientes fueron divididos en tres subgrupos: Dolor I (0), que representan el grupo de pacientes sin dolor, dolor II (1-3) de los pacientes que sufrían de dolor leve y dolor III (4-9), con dolor moderado a severo
la inmunohistoquímica & amp.; inmunofluorescencia doble etiquetado
Consecutivas 3 micras secciones de muestras NP, PCA y la CP incluidos en parafina se analizaron para el pan-neuronal proteína marcadora producto génico 9,5 (PGP 9.5) y para inflamatorias marcadores de superficie celular incluyendo grupo de diferenciación 45 (CD45) como marcador pan-leucocitos, CD8 como marcador de linfocitos T citotóxicos, CD4 para etiquetar los linfocitos T helper, CD68 como marcador de los macrófagos, la elastasa de neutrófilos (NE) para granulocitos neutrófilos, CD20 para los linfocitos B, NCL-PC para el plasma células, GPR2 para eosinófilos y células anti-mástil triptasa (MC) y quimasa anti-MC para identificar las células cebadas. El tipo de la proteasa activada por receptor 1 (PAR-1) y tipo 2 (PAR-2) se immunolabeled en secciones consecutivas adicionales. Las secciones se incubaron con los anticuerpos primarios a las diluciones indicadas durante la noche en una cámara húmeda a 4 ° C (Tabla 1). Los controles negativos se incubaron con el mismo IgG o de subclases de anticuerpos IgM no inmunizados. diluciones de anticuerpos primarios se realizaron con suero de cabra normal. Todos los antígenos fueron detectados a través de la Dako Envision System-HRP (Hamburgo, Alemania) o por Alexa Fluor
® 488 y 594 anticuerpos (Invitrogen, Alemania) para la especie a juego. DAB se utilizó como cromógeno. La imagen digital se realizó con el sistema de Keyence Biorevo BZ-9000 (Keyence, Neu-Isenburg, Alemania).
Análisis cuantitativo de la distribución de células inflamatorias alrededor de los nervios
Con el fin de determinar la cantidad de subtipos de células inflamatorias alrededor de los nervios intrapancreáticos, el área inmunote~nido ocupado por cada subtipo de células dentro de las agrupaciones de células inflamatorias neuronales se midió mediante el software ImageJ (1.36b ImageJ, Wayne Rasband). Para este propósito, de cada sección de un paciente, entre tres y cinco nervios que demuestran neuritis páncreas fueron identificados primero y, posteriormente, fotografiado con la ayuda de una sección consecutiva PGP9.5 manchados y una sección consecutiva hematoxilina-eosina-manchado. neuritis pancreático se histológicamente definido e identificado como "un grupo de células inflamatorias neural que está en contacto con el perineuro y /o endoneurium y claramente se pueden delineados del tejido general de infiltrado de células inflamatorias restante". Después de la conversión de la imagen RGB para una imagen de 8 bits, la función de umbral se utiliza para definir una fase con la ayuda de un umbral pre-establecido que solamente las etiquetas de la zona ocupada por las células inflamatorias neuronales immunostained, y el software determina automáticamente la absoluta y por área ciento de esta fase en cada imagen, como también se describe anteriormente [10]. Las áreas absolutas medidas en cada imagen de la inmunorreactividad de CD8, CD4, CD68, CD20, NCL-PC, GPR2, NE, anti-MC-triptasa y -chymase se relacionaron a la de CD45 como el marcador pan-leucocitario para determinar la distribución de subconjuntos de células inflamatorias en la población de células neuritis páncreas. La toma de fotografías y el análisis cuantitativo posterior se llevaron a cabo por tres observadores (SS, IED y ESD) cegados a los datos clínicos y de inmunohistoquímica, como se describe anteriormente [1].
En tiempo real cuantitativa Light Cycler®-polimerasa-cadena- la reacción (QRT-PCR)
la extracción de ARNm a partir de tejido pancreático se preparó usando TissueLyser II y el RNeasy plus kit (Qiagen /Hilden) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Posteriormente, se determinó la cantidad y la pureza de ARN usando Nanodrop ND1000 (Peqlab /Erlangen). la síntesis de ADNc de primera cadena se realizó con el kit Transcriptor-First-Strand cDNA Synthesis (Roche /Mannheim) según las instrucciones del fabricante. La expresión de la proteasa activada por receptor de tipo 1 (PAR-1, GeneBank, GeneID: 2149), activado por proteasa-receptor de tipo 2 (PAR-2, GeneBank, GeneID: 2150) y del gen de mantenimiento de referencia ciclofilina B (CypB , GenBank, GeneID: 5479) se midieron con la Roche LightCycler-480 kit de real-Time PCR System y LightCycler-480 SYBR Green I Maestro. De acuerdo con el método Pfaffl [11], la expresión relativa se basa en la desviación punto de cruce medio entre las 3 muestras normalizadas a la desviación punto de cruce medio para el gen de referencia, después de la corrección de la eficiencia de las reacciones de PCR. La expresión relativa de PAR-1 y PAR-2 en las muestras se normalizó al nivel en el páncreas humano normal (NP). Todos los cebadores se obtuvieron de Sigma-Aldrich.
La cuantificación de inmunoreactividad neuronal para PAR-1 y PAR-2
En cada sección, la inmunoreactividad neuronal media de PAR-1 y PAR-2 se determinado mediante colorimetría basada en ImageJ, como también se muestra anteriormente [10]. En pocas palabras, los nervios inmunomarcadas con neuritis páncreas de cada sección con CaP o CP se photomicrographed y se someten a la función de umbral del software después de la conversión en una imagen de 8 bits. El área por ciento inmunotinción en cada nervio se determinó por el software después de fijar un umbral definido en los nervios como regiones de interés para cada tinción (es decir PAR-1 y PAR-2) y correspondió a la inmunorreactividad neural. La inmunorreactividad media de cada paciente se calculó determinando la immunoreactivitiy neuronal promedio de todos los nervios con neuritis páncreas en cada paciente.
El análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó utilizando el software GraphPad Prism 5 (La Jolla, CA, EE.UU.). Para comparaciones múltiples y debido a la interdependencia de las áreas de subconjuntos de células medidos y porcentajes dentro de una población dada la neuritis, la prueba de Friedman seguido por test post hoc de Dunn fue utilizado. En particular, se aplicó esta prueba para la comparación de las áreas inmunorreactivas de subconjuntos de células inflamatorias, y también para la comparación de su porción relativa (por ciento) en cada población neuritis. Para el análisis de PAR-1 y PAR-2 en la expresión entre NP, CP y CP, y de la correlación de la invasión de los nervios con la infiltración de células perineural mástil, se utilizó Kruskal-Wallis test en conjunción con la prueba post hoc de Dunn. Para la comparación de inmunorreactividades de cada subtipo de células inflamatorias y de PAR-1 y PAR-2-neuro inmunorreactividades y los niveles de expresión entre los pacientes con dolor y los pacientes sin dolor, se aplicó de Mann-Whitney U Test. Para estos análisis de dolor de dos grupos, la prueba t no pareada se utilizó, además de confirmar las diferencias observadas. Para el análisis de subconjuntos de células cebadas que implica frecuencia de co-localización triptasa-quimasa, se utilizó la prueba exacta de Fisher. Los resultados se expresan como mediana (mínimo, máximo), excepto para los datos de la expresión de ARNm que fueron presentados como media ± error estándar de la media (SEM). Dos lados valores de p se calculan siempre, y un efecto se consideró estadísticamente significativo en un
p-valor ≤ 0,05
.
Resultados
nervios intrapancreática en el CP y CP son predominantemente infiltrados por linfocitos T citotóxicos, macrófagos y mastocitos
Como el objetivo principal del presente estudio, se cuantificó la cantidad de leucocitos y subpoblaciones de leucocitos en la neuritis páncreas. Para este propósito, el área ocupada por cada subtipo de leucocitos se cuantificó mediante análisis colorimétrico y se expresa en m
2. En el CP, la población de células inmunes neuritis páncreas se compone principalmente de CD68
+ macrófagos [39.87% (10,15; 64,88) de todas las células inflamatorias perineurales, 2545 m
2 (665,9; 22012)], seguido por CD8
+ linfocitos T citotóxicos [33.20% (21,06; 54,11), 2623 m
2 (586,5; 21092)] y mastocitos [MC, 14,46% (0,28; 52,10), 1.106 micras
2 (21.51; 16.090), la Figura 1A-C]. Es importante destacar que todas las otras grandes poblaciones de células inflamatorias estaban presentes en cantidades detectables casi [CD20
+ Linfocitos B: 0,79% (0,10; 13,84) y 76,84 m
2 (3.06; 2598); CD4
+ T helper: 1,61% (0,39; 28,45) y 83,03 m
2 (13.55; 2962); NCL-PC
+ células plasmáticas: 1,87% (0,01; 10,54) y 140,9 m
2 (0,31; 986,9); GPR2
+ eosinófilos: 0,49% (0,10; 19,77) y 38,71 m
2 (9,93; 888,8); Figura 1A-C)]. La distribución por ciento de las subpoblaciones de leucocitos en neuritis pancreático en el CaP se representa en la Figura 1C.
(A) neuritis pancreático fue identificado por medio de una sección a contratinción con hematoxilina-que fue immunolabeled con el PGP9 marcador pan-neuronal. 5 o por medio de un hematoyxlin-eosina (H & amp; E) sección teñidas. Las células inflamatorias que componen neuritis páncreas fueron identificados por medio de inmunomarcaje con el CD45 marcador de pan-leucocitos, con CD68 (macrófagos), CD8 (linfocitos T citotóxicos), CD4 (células T auxiliares), CD20 (linfocitos B), NCL- PC (células plasmáticas), elastasa de neutrófilos, GPR2 (eosinófilos), anti-triptasa de mastocitos (MC-T) y correlacionado con la sensación de dolor. (B-C) En el CP, los macrófagos CD68 +, CD8
+ citotóxicos linfocitos T y los mastocitos (MC) dominan la población de células inflamatorias de los nervios. "N" significa el nervio identificado. Entre tres y cinco nervios con neuritis páncreas fueron analizados de cada paciente. Todas las imágenes a 200 aumentos. Las barras de escala indican 50 micras.
En CP, la distribución de los subtipos de células perineurales inflamatoria que se parecía mucho en el CaP. También en este caso, CD8
+ citotóxicos linfocitos T [34,17% (12,27; 78,97) y 2064 micras
2 (142,7; 11334)], CD68
+ macrófagos [34.40% (1.562; 54,22) y 1852 micras
2 (126,9; 11667)] y mastocitos [24.16% (1,78; 56,63) y 2339 micras
2 (221,1; 10155)] eran más prevalentes en las lesiones pancreáticas neuritis (Figura 2A-C). Los subtipos de células inflamatorias restantes se detectaron sólo ocasionalmente alrededor de los nervios intrapancreáticos [CD20
+ Linfocitos B: 0,57% (0,07; 3,19) y 21,93 m
2 (1,27; 293,9); CD4
+ T helper: 0,56% (0,16; 6,22) y 27,77 m
2 (5,38; 1325); NCL-PC
+ células plasmáticas: 1,20% (0,05; 17,44) y 121,3 m
2 (2,08; 474,3); GPR2
+ eosinófilos: 0,61% (0,13; 6,24) y 23,33 m
2 (2.41; 1384); La figura 2A-C]. La distribución por ciento de las subpoblaciones de leucocitos en neuritis pancreático en CP se representa en la Figura 2C.
En la pancreatitis crónica, neuritis pancreático mostró una composición similar a cáncer de páncreas, que comprende macrófagos CD68 +, CD8
+ linfocitos T citotóxicos y mastocitos (MC). "N" significa el nervio identificado. Entre tres y cinco nervios con neuritis páncreas fueron analizados de cada paciente. Todas las imágenes a 200 aumentos. Las barras de escala indican 50 micras.
El dolor neuropático en el CaP se asocia con un aumento de la infiltración de mastocitos específicamente alrededor de los nervios intrapancreáticos
Uno de los principales objetivos de este estudio fue comparar la distribución de las subpoblaciones de leucocitos antes mencionados entre los pacientes con CaP con y sin dolor abdominal. En cuanto a la cantidad total de leucocitos en los infiltrados de células inflamatorias neuronales, los pacientes con CaP con dolor no demostraron ninguna diferencia en el tamaño de la población de células inflamatorias por los nervios [7574 m
2 (3121; 36358)], en comparación con CaP los pacientes sin dolor [7320 m
2 (1155; 33793)]. El análisis de los subtipos de células inflamatorias reveló que hubo un cambio en la distribución de un único subconjunto de células inflamatorias en los pacientes con CaP con el dolor: La cantidad de mastocitos perineurales se aumentó específicamente entre los pacientes con CaP con el dolor [PCAP, 30,96% (10,75; 52.10) y 3081 m
2 (21.51; 16090)] que entre los pacientes sin dolor [PCAN, 13,41% (6,64; 26,29) y 777,6 m
2 (69.93; 3228),
p
& lt; 0.05 Figura 3A-C]. Todos los otros subtipos de células inflamatorias no demostraron ninguna variación significativa con el estado de dolor de los pacientes con CaP [CD8
+ linfocitos T citotóxicos en PCAP: 32,22% (22,62; 42,07) y 2.802 m
2 (116; 10933) vs . 39,57% (21,06; 54,11) y 2.208 m
2 (586,5; 21092) en PCAN; CD68
+ macrófagos: 38,74% (21,21; 64,88) y 2628 micras
2 (1214; 22012) en el PCAP vs. 40.99% (10.15; 53.00) y 2.486 m
2 (665,9; 8097) en PCAN; CD20
+ Linfocitos B: 0,77% (0,23; 5,11) y 70,64 m
2 (3,36; 2,598) en el PCAP frente a 1,1% (0,10; 13,84) y 83,04 m
2 (3,06; 418,8) en PCAN; CD4
+ células T helper: 1,42% (0,39; 15,13) y 82,62 m
2 (30,62; 562,9) en el PCAP vs. 1,79% (0,41; 28,45) y 83,03 m
2 (13.55; 2962 ) en PCAN; NCL-PC
+ células plasmáticas: 2,08% (0,01; 8,61) y 245,4 m
2 (0,31; 986,9) en el PCAP vs. 1,46% (0,20; 10,54) y 69,83 m
2 (9,50; 597,9) en PCAN; GPR2
+ eosinófilos: 0,50% (0,14; 19,77) y 48,98 m
2 (10.75; 888.8) en el PCAP y 0,53% (0,10; 2,44) y 26,99 m
2 (9,93; 156.6) en PCAN ; Figura 3A-C). La distribución por ciento de las subpoblaciones de leucocitos en la neuritis pancreática en pacientes con CaP frente sin dolor se representa en la figura 3C.
Estado del dolor de los pacientes con CaP no afectó a la distribución relativa de la mayoría de los subconjuntos de células inflamatorias en el CP perineurales , pero no fue hasta los mastocitos, que se enriquecieron en concreto alrededor de los nervios intrapancreáticos de pacientes con CaP con dolor en comparación con los pacientes sin dolor. "N" significa el nervio identificado. Entre tres y cinco nervios con neuritis páncreas fueron analizados de cada paciente. Todas las imágenes a 200 aumentos. Las barras de escala indican 50 micras.
El dolor neuropático en CP se caracteriza por aumento de la infiltración de mastocitos perineural y la supresión de los linfocitos T citotóxicos perineurales en la neuritis páncreas
A pesar de que la neuritis páncreas fue descrito por primera vez en CP por algunos estudios pioneros [5], [9], la influencia del dolor en la distribución de los subconjuntos de células inflamatorias en la neuritis páncreas CP-asociado son ampliamente desconocidas. Cuando se comparó la cantidad de leucocitos alrededor de los nervios intrapancreáticos en pacientes con CP vs sin dolor, había una cantidad interesante de pequeñas células inflamatorias perineurales entre los pacientes con dolor CP [(CPP, área de CD45-inmunorreactiva perineural mediana: 4333 m
2 (1118; 10375)] que entre los pacientes con PC sin dolor [(PCN, área de CD45-inmunorreactiva perineural mediana:. 9831 m
2 (1687; 25685)] Este encogimiento de la célula inflamatoria perineural infiltrarse en el CPP fue acompañado por una aumento específico en la proporción relativa de los mastocitos en esta proporción de células inflamatorias [CPP: 36,93% (10,92; 56,63) vs. CPN: 20,25% (1,78; 37,22)], pero no en las cantidades absolutas de células cebadas perineural [CPP: 1546 m
2 (455,8; 3129) vs. PCN:. 2833 m
2 (221,1; 7396)] por otra parte, tanto la absoluta y la cantidad relativa de células CD8
+ linfocitos T se redujo en CP dolorosa [CPP: 22,35% (12,27; 78,97) y 768,6 m
2 (142,7; 11334) vs. PCN: 37,32% (28,31; 48,09) y 3628 m
2 (653,0; 7365)]. No hubo grandes alteraciones adicionales en las cantidades relativas o absolutas de otros subtipos de células inflamatorias entre los pacientes con PC con el dolor [CD68
+ macrófagos: 34.40% (5,57; 54,22) y 1409 micras
2 (546,8; 4811) en CPP vs. 34,29% (1,56; 51,03) y 3129 m
2 (126,9; 6613) en CPN; CD20
+ Linfocitos B: 0,50% (0,07; 1,65) y 7,07 m
2 (1,27; 40,86) de la PPC vs 0,76% (0,08; 3,19) y 61,42 m
2 (2,57; 293,9) en CPN; CD4
+ células T helper: 0,50% (0,16; 4,10) y 14,47 m
2 (5,38; 208.3) de la PPC frente a 0,87% (0,28; 6,22) y 46,73 m
2 (21,97; 351,2 ) en CPN; NCL-PC
+ células plasmáticas: 1,06% (0,05; 6,32) y 49,05 m
2 (2,08; 264.0) de la PPC vs 2,38% (0,45; 17,44) y 151,5 m
2 (8,58; 474,3) en CPN; GPR2
+ eosinófilos: 0,42% (0,15; 5,48) y 16,22 m
2 (2,41; 174.1) en el CPP y el 0,94% (0,13; 6,24) y 39,42 m
2 (3.34; 1384) en el PCN ; La figura 4A-C)]. La distribución por ciento de las subpoblaciones de leucocitos en la neuritis pancreática en pacientes con CP frente sin dolor se representa en la figura 4C.
Al igual que en el CP, también en CP, los pacientes con dolor demostró una mayor cantidad relativa de los mastocitos (MC ) alrededor de los nervios intrapancreáticos que los pacientes sin dolor. Por otra parte, este aumento en la cantidad de perineural MC fue acompañado por una disminución de las cantidades de citotóxicos CD8
+ T linfocitos alrededor de los nervios intrapancreáticos. "N" significa el nervio identificado. Entre tres y cinco nervios con neuritis páncreas fueron analizados de cada paciente. Todas las imágenes a 200 aumentos. Las barras de escala indican 50 micras.
infiltración de mastocitos perineural no se correlaciona con la invasión de los nervios en el cáncer de páncreas
invasión neural (NI) es una de las características histopatológicas de CaP y se encuentra en hasta el 100% de CaP especímenes [12]. Como hemos observado un aumento específico de la cantidad de MC perineural en CaP dolorosa, una importante cuestión que se plantea en este punto es si la infiltración perineural MC también se correlaciona con la invasión tumoral mejorada de los nervios. Para este propósito, se clasificó la gravedad de la NI en el CaP especímenes en tres categorías ( "0 /sin invasión", "I /invasión perineural" y "II invasión /endo-neuronal" [1]) y se correlacionó la gravedad de NI a la cantidad relativa de perineural MC. En este caso, no hubo correlación entre perineural MC infiltración y aumento de la gravedad de la NI en el CaP [sin invasión /Grado 0: 15,73% (3,08; 65,16), la invasión perineural /Grado I: 14,79% (0,34; 51,71) y endo invasión neural /Grado II:. 37,67% (17,65; 60,05),
p = 0,08
, Figura 5]
nervios intrapancreática en los tejidos de CaP se evaluaron para determinar la presencia de invasión neural (NI) y se clasificó en la nI grados "0 /sin invasión", "invasión 1 /perineural" y "2 /endo-invasión neural). En nuestra cohorte, las cantidades relativas de los mastocitos perineurales no difirieron entre los diversos grados de NI en PCa humana. Los resultados se presentan como mediana (mínimo; máximo)
Expresión y inmunoreactividad neuronal de PAR-1 y PAR-2 en el CP y CP
Las neuronas pueden sensibilizarse por la acción de. trombina a la proteasa activada por receptor de tipo 1 (PAR-1) o de las proteasas derivadas de MC (tales como la triptasa) en el momento de la proteasa activada por receptor de tipo 2 (PAR-2) [13]. Como observamos cantidades de mastocitos significativamente elevados alrededor de los nervios intrapancreáticos en el CP y CP, también cuantificamos los niveles de PAR-1 y PAR-2 en estos tejidos y, además, en los nervios intrapancreáticos. Aquí, la comparación de la expresión de ARNm de PAR-1 y PAR-2 en NP, PCa y CP no mostró ninguna diferencia importante en los niveles de estos receptores (Figura 6A). Del mismo modo, cuando los pacientes con CaP y CP fueron estratificados en el "sin dolor" y grupos "dolor", los niveles de mRNA de estos receptores no fueron diferentes entre los grupos (Figura 6B-C). Cuando las inmunorreactividades neurales de estos receptores se compararon entre los pacientes con y sin dolor, los pacientes con CaP con dolor tendían a mostrar un poco mayor inmunoreactividad para PAR-1 [3.272% (0,20; 9,44)] que aquellos sin dolor [1.22% (0.14; 5,57), la Figura 6D]. Sin embargo, no hubo diferencia en el PAR-2 inmunoreactividad en pacientes con CaP con el dolor [11.06% (4,45; 17,23)] frente a sin dolor [11.90% (1,843; 28,64), (Figura 6D)]. Del mismo modo, el estado de dolor de los pacientes CP no tuvo influencia en la inmunorreactividad neural para PAR-1 o PAR-2 en nuestra cohorte (Figura 6E)
.
(A) Expresión de PAR-1 y PAR-2 era comparación entre lo normal páncreas humano (NP), CP y tejidos con CaP mediante QRT-PCR y no fue diferente entre estas tres entidades. La expresión se normalizó primero en el gen de mantenimiento ciclofilina B y luego a NP. (B) En el CP, los niveles tisulares de PAR-1 y PAR-2 no difirió entre los pacientes con dolor versus pacientes sin dolor. (C) Del mismo modo, también en CP, no hubo diferencia en los niveles de mRNA de tejido de PAR-1 y PAR-2 en pacientes sin dolor versus con dolor. (D) se analizaron los nervios intrapancreática en el CP para la inmunorreactividad de PAR-1 y PAR-2 y correlacionada con el estado de dolor de los pacientes. Aquí, la sensación de dolor no se asoció con diferencias en la inmunorreactividad de los nervios intrapancreáticos de PAR-1 o PAR-2. (E) En analogía con CaP, también en CP, los pacientes con dolor exhibió inmunorreactividades similares en los nervios de PAR-1 y PAR-2 ya que los pacientes sin dolor.
Dolor neuropático asociado a células cebadas en perineural CP y CP son MC
TC de tipo mastocitos
en los seres humanos, MC se pueden clasificar en función de su contenido de mediador en dos categorías:
mastocitos de tipo T MC que contienen heparina y triptasa, y MC
mastocitos de tipo TC que contienen adicionalmente la enzima proteolítica "quimasa" [14]. Para determinar el fenotipo de los mastocitos frecuente en el CP, CP y NP, se realizó inmunofluorescencia etiquetado doble en tejidos pancreáticos contra la triptasa de los mastocitos y quimasa de mastocitos. En NP, mastocitos eran casi no detectables en absoluto alrededor de los nervios intrapancreáticos. En todos los pacientes NP que fueron incluidos en el análisis, sólo se pudieron encontrar tres nervios que mostraron una estrecha asociación espacial con células inflamatorias. La doble inmunomarcaje de estas células cebadas mostró que todas estas células contenían tanto triptasa y quimasa [100% (100; 100)], clasificando así como MC
mastocitos de tipo TC (Figura 7A). Por otra parte, tanto en el CaP y CP, MC
mastocitos de tipo TC fueron de nuevo el fenotipo de los mastocitos perineural predominante (81,7 ± 4,9% y 77,0 ± 4,0%, respectivamente), pero las dos entidades de la enfermedad, además, contenían perineural MC
tipo T (triptasa solamente) (18,3 ± 4,9% y 23,7 ± 4,0%, respectivamente). El análisis de subgrupos teniendo en cuenta el estado de dolor de los pacientes mostró una distribución similar de perineural MC
TC y MC
mastocitos de tipo T en pacientes con CaP con dolor (MC
TC: 85,6 ± 6,4% y MC
T: 14,4 ± 6,4%) en comparación con aquellos sin dolor (MC
TC: 77,4 ± 7,4% y MC
T: 22,6 ± 7,4%, Figura 6A). Por el contrario, los pacientes con PC con dolor mostraron una proporción significativamente mayor de perineural MC
de tipo TC mastocitos (MC
TC: 86,9 ± 4,4% y MC
T: 13,1 ± 4,3%,
p
& lt; 0,0001) que los pacientes con PC sin dolor (MC
TC: 62,9 ± 6,4% y MC
. T: 37,1 ± 6,4%; Figura 6A)
(A) tejido pancreático humano muestras de NP, el CP y CP fueron doble immunolabeled para perineural MC-triptasa (rojo) y MC-quimasa (verde). En las tres entidades, la gran mayoría de perineural MC demostró inmunorreactividad doble (amarillo en el overlay) para MC-triptasa y -chymase. En CP, no fueron significativamente mayores cantidades relativas de MC de doble inmunorreactiva entre los pacientes con dolor que en aquellos sin dolor. Las barras blancas indican escala de 100 micras.