Extracto
La amplitud de la expresión de HER2 por los cánceres de ovario humanos primarios sigue siendo controvertido, lo que pone en duda su idoneidad como un antígeno universal en este malignidad. Para abordar estas cuestiones, hemos realizado un extenso análisis de la expresión de HER2 en un amplio panel de tumores primarios, así como líneas celulares de cáncer de ovario humano establecido y de corto plazo. inmunohistoquímica convencional (IHC) análisis de múltiples sitios de tumor en 50 casos de carcinomas de ovario seroso de alto grado reveló sobreexpresión de HER2 en el 29% de los sitios evaluados. Sin embargo, los métodos de detección más sensibles, incluyendo citometría de flujo, análisis de transferencia Western y q-PCR revelaron la expresión de HER2 en todas las células tumorales frescas derivados de ascitis primarios o tumores sólidos, así como todas las líneas celulares de cáncer cultivadas a corto plazo establecidos y. Las células cancerosas expresan generalmente HER2 en niveles superiores a los encontrados en las células normales del epitelio superficial del ovario (OSE). En consecuencia, de ingeniería genética células T humanas que expresan un receptor-HER2 quimérico específico de antígeno (CAR) reconocido y reaccionado contra todas las células de cáncer de ovario establecidas o primarios probados con mínima o ninguna reactividad frente a células de OSE normales. En conclusión, todos los cánceres de ovario humano expresan niveles detectables inmunológicamente de HER2, lo que indica que la medición IHC subestima la verdadera frecuencia de los cánceres de ovario HER2-expresión y puede limitar el acceso del paciente a las terapias clínicamente significativas HER2.
Visto : Lanitis E, Dangaj D, ES Hagemann, Song DG, Mejor A, Sandaltzopoulos R, et al. (2012) Las células primarias de ovario humano cáncer epitelial ampliamente expreso HER2 en los Niveles inmunológicamente detectables. PLoS ONE 7 (11): e49829. doi: 10.1371 /journal.pone.0049829
Editor: Shannon M. Hawkins, Baylor College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 13 Julio, 2012; Aceptado: 17 de octubre de 2012; Publicado: 26 Noviembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Lanitis et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El cáncer ovárico Fondo de Investigación, Fundación contra el cáncer de Ovario Rollman de arena, Institutos nacionales de Salud (1R21CA152540) y el Chase Cancer Center conjunta Fox y Universidad de Pensilvania cáncer ovárico de esporas (P50 CA083638). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la
erbB2
proto-oncogén codifica una proteína transmembrana tirosina quinasa del receptor implicado en el desarrollo y la progresión de muchos tipos de cáncer incluyendo el cáncer de ovario [1], [2]. Desregulada de señalización de HER2 en cáncer de ovario resultados (Ovča) de ya sea la amplificación del gen o la sobreexpresión y conduce a un crecimiento celular más rápido [3], la mejora de la reparación del ADN [4] y el aumento de la formación de colonias [5]. La sobreexpresión de HER2 se asocia con un mayor riesgo de progresión y muerte, especialmente entre las mujeres con FIGO estadio I y II OvCa [6]. Sin embargo, no se ha encontrado correlación entre la presencia de la sobreexpresión de HER2 y la etapa FIGO, lo que sugiere que la activación de la sobreexpresión de HER2 es amplio y puede ocurrir tanto en etapas tempranas y tardías de la enfermedad [7]. Estas cualidades aparecerían para hacer HER2 una molécula atractiva para inmunoterapias específicas en las mujeres con cáncer de ovario HER2 positivo, donde de origen natural CD4
+ y CD8
+ se han observado respuestas de células T [8].
expresión de la proteína HER2 se detecta con mayor frecuencia a través de análisis semi-cuantitativo de IHC en tejidos embebidos en parafina utilizando protocolos establecidos empleadas para la evaluación de pacientes con cáncer de mama considerados para el tratamiento anti-HER2 Herceptin (trastuzumab) [9]. La medida en que HER2 se expresa por OvCas sigue siendo controvertido, ya que la tasa de OvCas HER2 positivos reportados en la literatura oscila entre el 4,9% y el 52,5% [6], [7], [10], [11], [12] , [13], [14], [15]. Sin embargo, en un único estudio realizado por Hellstrom et al., Todas las líneas de células tumorales que se establecieron
in vitro En venta tumor sólido o líquido ascítico expresan HER2 que sugiere una ventaja selectiva de crecimiento de células cancerosas HER2-positivo en la cultura [16 ]. Una línea celular establecida ha demostrado ser sensibles a la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos HER2-dirigida (ADCC), sin embargo, la expresión de HER2 y la sensibilidad ADCC fue no evaluados en células derivadas de ovarios fisiológicas. Además, el análisis de expresión de HER2 de flujo utilizado citometría como el método de detección única y se limitó a un número relativamente pequeño de casos, basándose en gran medida en el cultivo de células in vitro.
En el estudio actual, las líneas celulares de cáncer de ovario establecidos, primaria líneas de células cultivadas a corto plazo y las células de cáncer de ovario frescas derivados de ascitis y muestras de tumores sólidos se evaluaron para la expresión de HER2 utilizando diversos métodos de detección, incluyendo PCR cuantitativa (q-PCR), análisis de transferencia de Western y citometría de flujo, y los niveles de expresión se compararon con niveles en las células del epitelio superficial del ovario normales correspondientes. Además, los niveles de inmunológicamente activas de HER2 se midieron utilizando células T humanas que fueron diseñados genéticamente para expresar un receptor de antígeno quimérico HER2-específico (CAR). Se evaluaron las células anti-HER2 CAR T por su capacidad de reconocer OvCas HER2-expresión y las células normales. Nuestros resultados demuestran que todas las muestras Ovča expresan HER2, y que este nivel de expresión es suficiente para provocar el reconocimiento inmunológico.
A.
Inmunoticción que muestra la diversidad regional de la expresión de HER2 en papilar seroso de alto grado adenocarcinoma de ovario. los niveles de expresión de HER2 se calificaron en una escala de 0-3 (puntuación de 0 = no detectable, puntuación 3 = fuerte tinción). Aumento original era de 200 ×.
B.
Heatmap ilustración del nivel de expresión de HER2 en 50 casos de carcinoma de ovario primarios y metastásicos, como se anotó mediante tinción IHC.
C
Distribución de frecuencias de los sitios que expresan HER2 en niveles que van desde puntuación de 0 a 3. El número medio de sitios evaluados para los casos con expresión indetectable o detectable HER2 fue similar (4,2 frente a 3,7, respectivamente;.
P
= 0,19). .
D
Distribución de frecuencias de los sitios, ya sea primarios o metastásicos que expresan HER2 en niveles que van desde puntuación de 0 a 3. Una mayor frecuencia de los sitios de tumor primario expresa HER2 (36%; 30/84) en comparación con los sitios de metástasis (24 %; 27/111) y tuvo una puntuación media más alta expresión de HER2 (0,37
vs
0,21,
P
= 0,04).. No se observaron diferencias estadísticamente significativas al comparar los niveles de expresión entre los sitios primarios y metastásicos que expresan HER2 en cualquier nivel (1,03
vs.
0,86,
P
= 0,26).
Los valores P
se calcularon utilizando análisis de la prueba de la t de Student para datos independientes.
Materiales y Métodos
células cancerosas y líneas
Los donantes entró en una Universidad de Pennsylvania Institutional Review Board (IRB): aprobado el protocolo clínico y firmaron un consentimiento informado antes de tumor o la extracción de sangre. Para tumores sólidos o muestras de ovario normales, espécimen fue cortada en RPMI-1640, se lavaron y se centrifugaron (800 rpm, 5 minutos, 15 a 22 ° C), y se resuspendieron en tampón de digestión enzimática (0,2 mg /ml de colagenasa y 30units /DNasa ml en medio RPMI-1640) para la rotación durante la noche a temperatura ambiente. colecciones Ascitis se lavaron y criopreservados antes de estudio. líneas primarias cultivadas a corto plazo fueron amablemente proporcionados por el Dr. Richard Carroll de la Universidad de Pennsylvania [17]. líneas celulares de ovario y cáncer de mama humano establecidas, se compraron las células T humanas línea celular de linfoblastos similar a la CEM y la línea celular 293T (ATCC). IOSE-6 líneas de células normales IOSE-4 y fueron amablemente proporcionados por el Dr. Birrer del Dana-Farber /Harvard Cancer Center [18] y la línea celular 398 fue un regalo del doctor Lin Zhang de la Universidad de Pennsylvania [19]. células 293T y líneas celulares tumorales se mantuvieron en medio completo; RPMI-1640 (Invitrogen) suplementado con 10% (v /v) de FBS inactivado por calor, 2 mM L-glutamina, y 100 mg /ml de penicilina y 100 U /ml de estreptomicina.
A
.
ErbB2
niveles de mRNA en líneas celulares de cáncer de ovario por q-PCR.
ERBB2
niveles de ARNm de líneas celulares de cáncer de ovario son en relación con la de las células CEM-ErbB2 negativo. Todas las líneas celulares de cáncer de ovario expresan
ErbB2
ARNm. B-actina se utilizó como un control del gen endógeno. Los resultados representan la media ± DE de pocillos por triplicado. La media relativa
ErbB2
la expresión del ARNm entre establecidos y líneas celulares OvCa a corto plazo no fue estadísticamente diferente (
P
= 0,45).
P
valor se calculó utilizando análisis de la prueba de la t de Student para datos independientes.
B Opiniones La detección de la expresión de proteínas HER2 superficie (histogramas llenos) por las líneas celulares de cáncer de ovario humano por citometría de flujo.; anticuerpo de control de isotipo (histogramas abiertos).
C.
Western blot de la expresión de proteínas HER2 en las líneas celulares que expresan cantidades representativas diferenciales de HER2. proteína HER2 se expresa a niveles variables en todas las líneas celulares de ovario ensayados. B-actina se utilizó como control.
La inmunohistoquímica
Se obtuvo la aprobación de la junta de revisión institucional. Se recuperaron los registros de 50 pacientes consecutivos con cáncer metastásico de ovario seroso papilar (FIGO estadio IIB y superior) sometidos a resección primaria en nuestra institución entre 2005 y 2008. Las láminas fueron revisados y anotados y se seleccionaron los bloques de tejido incluidos en parafina para la construcción de un microarray de tejido de tumores primarios y metastásicos. 206 el total de depósitos tumorales (sitios primarios y metástasis) estuvieron representados en la matriz. Una media de 3,7 sitios fueron incluidos por paciente. Los sitios metastásicos más comunes incluyen omento, peritoneo (por ejemplo, callejón sin salida), serosa uterina, y la pared del intestino. Para cada bloque, los núcleos por triplicado 0,6 mm de tumor se colocaron sobre un microarray de tejido. 5 micras secciones de parafina se tiñeron con el anticuerpo HER2 anti-humano de conejo (Dako) de acuerdo con protocolos estándar. la expresión de HER2 en cada núcleo fue anotado por microscopía de luz a 200 × magnificación utilizando una escala semicuantitativa que va de 0 a 3. Núcleos que muestran menos del 10% del tumor no se anotó. Para cada sitio del tumor, el marcador final fue la media de las puntuaciones de todos los núcleos evaluables.
PCR cuantitativa
Se aisló el ARN usando ARN kit fácil (Qiagen). cDNA se generó a partir de 1 ug de ARN utilizando perlas (GE Healthcare) la primera cadena de Ready-To-Go. PCR en tiempo real se realizó por triplicado utilizando cebadores de Applied Biosystems para
ErbB2
y B-actina.
ErbB2
niveles de mRNA en las células cancerosas se normalizaron a B-actina, y en comparación con los de la CEM, y se presentan como pliegue
ErbB2
nivel de ARNm. adquisición y análisis de datos se realizó de acuerdo las instrucciones de Applied Biosystems.
Un
.
ErbB2
cuantificación de ARNm en células de cáncer de ascitis primaria CD45-agotado. Skov-3 y CEM se utilizaron como línea celular que expresa HER2-positivo y negativo controla respectivamente. Las barras representan la media ± SD de valores de tres pozos.
B Opiniones.
ErbB2
cuantificación de ARNm en células de tumores sólidos primarios CD45-agotado. No hubo diferencias significativas en la media de
se observó ErbB2
nivel de ARNm entre ascitis y tumores sólidos (
P
= 0,46).
C.
Expresión de HER2 superficie (histogramas sólidos) por el representante Ber EP4
+ CD45
- ascitis cerradas y las células cancerosas derivadas de tumores sólidos controlados por citometría de flujo; anticuerpo de control de isotipo (histogramas abiertos). No se observó ninguna diferencia significativa en el nivel de la proteína HER2 entre ascitis o tumores sólidos células derivadas (
P
= 0,95).
D.
Western blot de la expresión de proteínas HER2 en lisados de tumores sólidos a granel. B-actina se utilizó como control del gen endógeno. OVCAR-3 y CEM se utilizaron como controles positivos y negativos para la expresión de HER2. Los valores de p se calcularon utilizando análisis de la prueba de la t de Student para datos independientes.
Citometría de Flujo
ratón anti-humano CD3, CD4, CD8, CD45, CD69, CD107a y CD107b mAb (
BD Biosciences)
fueron utilizados para el análisis fenotípico. 7-AAD se utilizó para la tinción de viabilidad. expresión en la superficie HER2 se evaluó usando conjugado con biotina anti-HER2 Affibody (Abcam) seguido de estreptavidina marcado con PE. expresión en la superficie CAR anti-HER2 se evaluó utilizando quimera HER2 Fc humana recombinante seguido por conjugado con PE anti-huIgG. Adquisición y análisis se ha realizado mediante un BD FACS CANTO II con el software DIVA.
A.
ErbB2
mRNA cuantificación en las células normales de OSE (398, IOSE-4, IOSE -6 y 1744) por Q-PCR. SKOV-3 y CEM se utilizaron como HER2 positivo y negativo líneas celulares que expresan respectivamente. Las barras muestran la media ± desviación estándar de valor de pocillos por triplicado.
B Opiniones expresión de la proteína HER2 en superficie (histogramas sólidos) por las células epiteliales de ovario normales por citometría de flujo.; anticuerpo de control de isotipo (histogramas abiertos).
C-D.
Comparación de la
ErbB2
ARNm y proteínas entre los niveles de ascitis de cáncer de ovario, tumores sólidos y células normales de OSE. (
C
) gráficos de dispersión vertical de los
ErbB2
ARNm en la ascitis, tumores sólidos y OSE normales determinados por Q-PCR. La media de cada grupo se indica por la línea horizontal.
P = 0,0498
al comparar
ErbB2
mRNA en ascitis vs células normales de OSE;
P = 0,0210
al comparar
ErbB2
mRNA en tumores sólidos frente a las células normales de OSE. (
D
) gráficos de dispersión vertical de los niveles de proteína en la ascitis, tumores sólidos y OSE normal determinado por citometría de flujo. La media de cada grupo se indica por la línea horizontal
P = 0,0616
al comparar la proteína HER2 en la ascitis vs OSE células normales;
P = 0,1749
al comparar la proteína HER2 en los tumores sólidos frente a las células normales de OSE.
Los valores P
se calcularon utilizando análisis de la prueba de la t de Student para datos independientes.
Western Blot
Las monocapas celulares se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se lisaron en tampón RIPA (50 mM Tris-HCl (pH 7,0), 1,0% de ácido desoxicólico NP-40, 0,1%, 30 mM Na
3Vo mM PMSF
4, 1). Los lisados fueron aprobados por centrifugación y se cuantificaron usando un equipo de Nanoorange (Invitrogen). proteína total 15 ug por carril se resolvió por electroforesis en dodecilsulfato de sodio en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) en gradiente de pre-cast (4-15%) geles (Bio-Rad) a 120 V durante 60 minutos. La proteína se transfirió del gel a membrana de transferencia Immobilon-P durante 30 minutos, bloqueó durante la noche con 5% de leche /PBST y se transfirió usando 1 ug /ml de ratón HER2 mAb anti-humano (clon 3B5, biociencias BD). Las membranas se lavaron 3 veces con PBST y se transfirieron con anticuerpo secundario anti-ratón conjugado con HRP durante 1 h a temperatura ambiente. B-actina se detectó utilizando anti-humano B-actina-HRP (1:30,000). Las membranas se incubaron con ECL Plus (GE Healthcare) durante 5 minutos y se expusieron a películas de 15-30 seg.
Un
. Representación esquemática del constructo quimérico anti-HER2 Receptor de Antígeno (CAR) que contiene el dominio citosólico CD3 solo (C6.5-z). C6.5, anti-HER2 scFv; VL, cadena ligera variable; L, Enlazador; VH, cadena pesada variable; TM, región transmembrana. la expresión del coche C6.5 scFv (histogramas grises) se detectó en humanos CD4
+ y CD8 +
- células cerradas T usando la proteína humana recombinante quimérico HER2-Fc 10 días después de la transducción, en comparación con las células T no transducidas (histogramas abiertos ). Porcentaje de transducción CAR se indica.
B.
Células T transducidas anti-HER2 CAR producen IFN-γ específicamente después de la estimulación con líneas celulares de cáncer de ovario humano. CAR transducidas o no transducidas células T se cultivaron solo (ninguno) o estimulados durante la noche con HER2 humana
+ establecido y líneas de ovario a corto plazo o de células de cáncer HER2
- líneas de control CEM y MDA468. IFN-γ se cuantificó a partir de sobrenadantes libres de células mediante ELISA. células
C.
anti-HER2 CAR T secretan IFN-γ después de la estimulación por HER2
+ ascitis primarios (izquierda) o células de tumor sólido de ovario (en el centro). Se detectaron cantidades mínimas de IFN-γ después de la estimulación con las células epiteliales de ovario normales superficie 398, IOSE-4, IOSE-6 o 1744 (derecha). Las concentraciones de citocinas (pg /ml) se presentan como la media ± SEM de los pocillos por triplicado.
anti-HER2 CAR construcción
productos de PCR que contenían el scFv C6.5Y100KA HER2 [20] fueron amablemente proporcionados por Silvana Canevari (Instituto Nazionale dei Tumori, Italia) y después se clonó en el vector pCR2.1-TOPO usando el TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen). La secuencia de ADN scFv C6.5 [21] se desarrolló a partir del plásmido anterior usando dirigida a sitio QuikChange Multi Kit de mutagénesis (Stratagene). El plásmido final se utilizó como molde para la amplificación por PCR de un fragmento de 795-bp C6.5 scFv utilizando los siguientes cebadores: 5'-GCGGGATCCATGGCCCAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGGGGCA-3 '(BamHI está subrayado) y 5'-GCGGCTAGCCGCACCTAGGACGGTCAGCTTGGTCCCTCCGCC-3' (NheI está subrayado ). El producto de PCR resultante se digirió con BamHI y NheI y se ligó en los pCLPS vector de expresión lentiviral de auto-inactivación de tercera generación que contienen una secuencia CAR de señalización CD3, con la expresión del transgen dirigida por el promotor CMV. El constructo resultante se designó pCLPS-C6.5-z.
C6.5 CAR células T desgranulan y expresan marcadores de activación de células T en respuesta a la estimulación-HER2 específico. C6.5 células T CAR se cultivaron sin células diana (ninguno) o con los objetivos de HER2-negativo o -positivo establecido y celulares de tumores primarios indicados o células normales de OSE durante 5 horas mientras era manchada por un anti-CD107a, el anticuerpo conjugado con b FITC. Después de que el período de incubación, las células T se tiñeron para CD8 y CD69 y se analizaron por citometría de flujo.
recombinante Lentivirus Producción
-alto título vectores lentivirales de replicación defectuosa se produjeron y se concentraron como descrito anteriormente [22]. Brevemente, las células 293T se transfectaron con 7 ug pVSV-G plásmido, 18 ug plásmido pRSV.REV, el plásmido 18 ug pMDLg /p.RRE, y 15 ug transferencia pCLPS-C6.5-z plásmido usando expreso En (Open Biosystems). sobrenadante viral se cosechó a los 24 hy 48 h después de la transfección. Las partículas virales se concentraron por ultracentrifugación durante 3 horas a 25.000 rpm con un rotor Beckman SW28 (Beckman Coulter) y se resuspendieron en 0,4 ml de RPMI.
transducción de la célula T
células T humanas primarias adquirió de la humana Inmunología núcleo de la Universidad de Pensilvania se aislaron de donantes voluntarios sanos después de leucoféresis por selección negativa. Todas las muestras se recogieron bajo un protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad, y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de cada donante. Las células T se estimularon en medio completo con anti-CD3 y perlas recubiertas anti-CD28 mAb (Invitrogen) y transducidas con lentivirus CAR codifica recombinante a una MOI de ~5-10 como se describe [22].
liberación de citoquinas Los ensayos
1 × 10
5 células T fueron co-cultivadas con 1 × 10
5 células diana por pocillo por triplicado en placas de 96 pocillos de fondo redondo en un volumen final de 200 ul de medio completo. Después de 20~24 hr, los sobrenadantes libres de células se analizaron para la presencia de IFN-γ usando un Kit ELISA (Biolegend) o matriz de citoquinas Bead (BD Biosciences), según las instrucciones del fabricante.
desgranulación Ensayo
ensayo se realizó como se describe [23] con modificaciones menores. 1 × 10
5 T células fueron co-cultivadas con 1 × 10
5 células diana en 100 ul de medios por pocillo en una placa de 96 pocillos por triplicado. Los cultivos de control contenían células T solo. Anti-CD107a y CD107b anti-Ab (10 ul /pocillo) o IgG1 conjugado con FITC (BD Biosciences), y 1 ul /muestra de monensina (BD Biosciences) se añadieron a la cultura y se incubaron durante 5 horas a 37 ° C. Las células se lavaron dos veces con PBS, se tiñeron para la expresión de CAR, CD8 y CD69 y se analizaron por citometría de flujo como se describe anteriormente.
Chromium Ensayo de liberación de
se realizaron ensayos de liberación de Cr51 como se describe [24]. Las células diana se marcaron con 100 uCi
51Cr a 37 ° C durante 1,5 horas. Las células diana se lavaron tres veces en PBS, se resuspendieron en medio de cultivo a 1 × 10
5 células viables /ml y 100 ul por pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo en V. Las células efectoras se lavaron dos veces en medio de cultivo y se añadieron a los pocillos a las relaciones dadas. Las placas se centrifugaron rápidamente a resolver las células, y se incubaron a 37 ° C en un CO 5%
2 incubadora durante 18 horas después de cuyo tiempo se recogieron los sobrenadantes, se transfirió a un lumar-placa (Packard) y se contaron usando un 1450 Microbeta contador de centelleo líquido (Perkin-Elmer). Espontánea
liberación de 51Cr se evaluó en las células diana incubadas con medio solo. Maximal liberación
51Cr se midió en las células diana incubadas con SDS a una concentración final de 2% (v /v). El porcentaje de lisis específica se calculó como (experimental - lisis espontánea /máxima - lisis espontánea) multiplicado por 100.
Análisis estadístico
GraphPad Prism 4.0 (GraphPad Software) fue utilizado para los cálculos estadísticos.
P Hotel & lt; 0,05 se consideraron significativos valores. Los valores R cuadrado (R
2) se calcularon utilizando regresión lineal a través de Microsoft Excel.
Resultados
Detección inmunohistoquímica de la expresión de HER2 en cáncer de ovario
expresión de HER2 se evaluado en 50 casos de carcinomas de alto grado seroso de ovario mediante el análisis de inmunohistoquímica (IHC) en un microarray tisular (TMA). Los casos individuales variaron con respecto al número de sitios de tumor disponibles para el análisis. Todos los casos que figura al menos un sitio de la lesión primaria, mientras que la mayoría de los casos (96%) tenían tanto primario como metastásico ≥1 sitio disponible. Para muchas muestras, hubo ≥ 2 (62%) o ≥ 3 (42%) sitios metastásicos disponibles en el TMA. De acuerdo con IHC puntuación, HER2 se expresó en varios niveles entre los 50 casos que van desde indetectable (puntuación 0) a una fuerte tinción (puntuación 3+; Figura 1A). la expresión de HER2 positivo en cualquier nivel se detectó en 26 casos (52%), mientras que no HER2 fue detectable en cualquier sitio en 24 casos (Figura 1B). De los 26 casos que expresan HER2 en uno o más sitios, sólo el 6 (23%) expresa HER2 en todos los sitios por IHC; estos casos fueron ponderados hacia una mayor expresión de HER2. La mayoría de los casos que expresan HER2 en cualquier sitio (20/26) mostraron expresión discordante (detectable frente indetectable) en uno o más sitios de tumor. El número medio de sitios evaluados fue similar entre los 26 casos con detectable HER2 y los 24 casos sin HER2 detectable (4.2 vs. 3.7, respectivamente; medio de cultivo
P
= 0,19). La heterogeneidad en el patrón de expresión de la proteína HER2 entre los diferentes sitios en casos individuales estuvo presente con varios patrones: detectable en todos (6/50); detectable en primaria, pero indetectable en metastásico del tumor (8/50); detectable en metastásico, pero indetectable en primaria tumor (5/50); detectables en al menos uno principal y otro sitios metastásicos (7/50). De 195 sitios de tumor evaluados, 138 (71%) no mostraron expresión de HER2 detectable (Figura 1C). Cincuenta y siete (29%) tenían la expresión de HER2 positivo; 25% (49/195) con un & gt; 0≤1 puntuación de HER2; 2,5% (5/195) con un & gt; 1≤2 puntuación de HER2; y el 1,5% (3/195) con un & gt; puntuación 2≤3 HER2. Una mayor frecuencia de los sitios de tumor primario se expresa HER2 (36%; 30/84) en comparación con los sitios de metástasis (24%; 27/111) y tenía una puntuación media más alta expresión de HER2 (0,37
vs
0,21,
P
= 0,04; Figura 1D). Entre los sitios primarios y metastásicos que expresan HER2 en cualquier nivel, no hubo diferencia estadísticamente significativa en el nivel de expresión (1.03
vs.
0,86,
P
= 0,26). En conclusión, IHC permite la detección de la expresión de HER2 en el 29% de todos los sitios y aproximadamente la mitad de todos los casos probados Ovča avanzadas.
HER2 se expresa por todas las líneas celulares cáncer de ovario
El relativamente baja sensibilidad de análisis IHC puede influir en la detección de proteínas de baja abundancia y por lo tanto falsificar la verdadera frecuencia de cánceres que expresan HER2. Para evaluar mejor la expresión de HER2 en OvCa, 12 establecieron y se midieron 7 líneas celulares Ovča a corto plazo para
ERBB2
niveles de mRNA por Q-PCR, y en comparación con la detectada a partir de CEM, una célula T humana de linfoblastos como línea celular que carece de la expresión de HER2 [25]. Todas las líneas celulares expresaron Ovča
erbB2
mRNA, aunque a diferentes niveles (Figura 2A). El aumento de
erbB2
la expresión de ARNm, con respecto al control CEM, varió de 63- a 6614 veces en líneas establecidas y de 40 a 1088 veces en líneas celulares primarios a corto plazo. Media relativa
ErbB2
la expresión del ARNm entre establecida (815 veces) y líneas celulares Ovča a corto plazo (372 veces) no fue estadísticamente diferentes entre sí (
P
= 0,45).
ErbB2
ARNm no se detectó en la línea de control CEM, pero era detectable en niveles bajos en la línea de control del cáncer de mama, MDA468, que expresa
ErbB2
ARNm pero no superficie de la proteína HER2 [25] .
expresión de la proteína HER2 se examinó en líneas celulares establecidas y tumor primario a corto plazo mediante la tinción de las células no permeabilizadas con una alta sensibilidad anti-HER2 Affibody [25], un alto ligando de afinidad contra el dominio extracelular de HER2 , seguido por análisis de citometría de flujo. Histogramas representativos muestran establecieron líneas celulares que expresan altos niveles de Ovča, intermedio o bajo la superficie de la proteína HER2, y líneas celulares de control negativo sin expresión de HER2 detectable (Figura 2B). Todo establecida (n = 12) y corto plazo (n = 7) líneas celulares Ovča probados mostraron expresión en la superficie proteína HER2 (Tabla 1). La mayoría de las células en establecida (97,7 ± 1,3%) y las líneas de corto plazo (88,9 ± 4,8%) expresaron proteína HER2, con un porcentaje mayor en las líneas establecidas (
P
= 0,03) (Tabla 1). La media de los niveles de proteína HER2 medidos por la intensidad específica de fluorescencia media (MFI) mostraron una tendencia hacia ser mayor en las líneas celulares establecidas (1906 ± 1221 FIU; unidades de intensidad de fluorescencia) en comparación con líneas celulares a corto plazo (594 ± 165 UIF), pero no fueron significativamente diferentes (
P
= 0,43) (Tabla 1), consistente con los resultados de ARNm. proteína HER2 y
ErbB2
los niveles de expresión de ARNm de todas las líneas celulares Ovča se correlacionaron significativamente (r
2 = 0,83; calculado mediante regresión lineal). expresión de la proteína celular HER2 se confirmó mediante análisis de transferencia Western (muestras representativas mostrados; Figura 2C).
Amplio HER2 Expresión en Primaria cáncer de ovario muestras
Desde
in vitro Francia culture puede enriquecer selectivamente para las células que expresan HER2 Ovča [16], se midió la expresión de HER2 en las células tumorales no cultivadas derivadas directamente de ascitis Ovča peritoneales primarios o tumores sólidos recién resecados. Las células tumorales de ascitis o en muestras de tumores sólidos fueron enriquecidos por el agotamiento magnético de CD45
+ leucocitos y se evaluaron con respecto
ErbB2
niveles de mRNA a través de Q-PCR (Figura 3A, B). probaron todas las células tumorales sin cultura primaria (n = 22) expresaron
ErbB2
mRNA en niveles que van desde 35 a 1225 veces más altas que las células CEM. No hubo diferencias significativas en la media de
ErbB2
se observó entre el nivel de ARNm ascitis y tumores sólidos (477
v
s 583, respectivamente;.
P
= 0,46). Flujo realizado citometría usando Affibody anti-HER2 mostró que las células no permeabilizadas tumorales (BerEp4
+ CD45
-) en todas las ascitis primaria (n = 22) y muestras de tumores sólidos (n = 10) expresa la proteína HER2 superficie, aunque a niveles variables, de acuerdo con la detección de
erbB2
mRNA por Q-PCR (Tabla 2; datos representativos se muestran en la Figura 3C). No se observó ninguna diferencia significativa en el nivel de la proteína HER2 entre ascitis o tumores sólidos células derivadas (7209 ± 1197 UIF
vs
7407 ± 2531 UIF, respectivamente;.
P
= 0,95), de acuerdo con resultados de ARNm. Western blot realizado en lisados tumorales completas también mostró expresión ubicua de HER2 en tumores sólidos primarios (muestras representativas se muestran en la Figura 3D).
Expresión de HER2 detectable en ováricos normales células epiteliales
Tres de ovario inmortalizado líneas de células del epitelio de superficie (OSE) y una muestra de células no cultivadas primarias (1744) derivados de ovarios normales se ensayaron para la expresión de HER2. Todos OSE células normales expresan niveles bajos de
ErbB2
ARNm que varió de 35 veces a 217 veces mayores que las células CEM de control (128 ± 5.5; Figura 4A). La citometría de flujo (Figura 4B) y análisis de transferencia Western (no mostrada) indicaron que todas las células normales de OSE expresan niveles detectables todavía bajos de proteína HER2. líneas celulares IOSE-4 IOSE-6 y se expresaron los niveles de proteína más altos que la línea 398 y 1744 muestra de ovario normal, de acuerdo con los resultados de ARNm.
A continuación se compararon los niveles
ErbB2
ARNm y proteínas en OSE células normales, ascitis malignos primarios y células tumorales derivadas de tumores sólidos (figuras 4C-D). Ascitis y muestras de tumores sólidos expresan generalmente mayores niveles de
ErbB2
ARNm y proteínas en comparación con las células de OSE, aunque un solapamiento en el nivel de expresión existía entre los grupos. tumores sólidos y ascitis expresaron significativamente más
ErbB2
ARNm de células de OSE (ascitis, 483 ± 319 veces,
P = 0,0498
; tumor sólido, 583 ± 330 veces,
P
= 0,0210; OSE, 128 ± 93 veces). los niveles de proteína HER2 tendían a ser más altas en la ascitis (5825 ± 1202 veces) y muestras de tumores sólidos (7407 ± 2531 veces) en comparación a OSE normal (1.429 ± 111 veces), pero a una baja significación estadística (ascitis
. v
s OSE
P = 0,0616
;. sólido
vs
OSE
P = 0,1749
). La variación en la HER2 niveles de expresión en muestras de OSE era limitado, lo que permite una discriminación confiable de muestras tumorales que sobreexpresan HER2. En comparación, el 75% (9/12) de la ascitis y el 90% (9/10) de tumores sólidos expresan niveles más altos de HER2 en comparación con OSE, y 91% (20/22) de la ascitis y el 80% (8/10) bueno los tumores tenían niveles más altos de proteína HER2 que las células normales de OSE.
células T-HER2 específica reconocen a todas las líneas celulares de carcinoma de ovario
receptores de antígenos quiméricos (CAR) se combinan la especificidad del anticuerpo para un antígeno de superficie con el efector la actividad de los linfocitos T [26]. Las células T que expresan CAR-HER2 específicos pueden ejercer
in vitro
actividad antitumoral potente, dependiente de la dosis frente a células diana HER2-positivo [20], [25]. Para investigar el grado en que la expresión de HER2 amplio por OvCa confiere sensibilidad a la inmunoterapia específica para HER2, las células T del donante humano fueron modificados genéticamente para expresar un automóvil anti-HER2 (C6.5) [27], la reorientación de ese modo contra HER2 superficie, y probado para la actividad específica contra OvCas. El constructo C6.5 CAR está compuesta por el scFv C6.5 ligado a una región de bisagra y transmembrana CD8a, seguido de un CD3 intracelular dominio de señalización (C6.5-z; Figura 5A). células primarias humanas CD4
+ y CD8
+ T fueron transducidas eficientemente con el coche usando vectores de lentivirus con eficiencias de transducción de forma reproducible & gt; 60% (Figura 5A). En co-cultivo, las células anti-HER2 CAR T dé la respuesta a la estimulación por todos los establecidos (n = 10) o de corto plazo (n = 4) células Ovča humanos, pero no en contra de la CEM y líneas de células MDA-468 carecen de expresión de HER2 (Figura 5B).