Extracto
El cáncer de vejiga es la enfermedad urológica maligno más frecuente en China. Hidroxicamptotecina (HCPT) es un ADN topoisomerasa I inhibidor, que ha sido utilizado en la quimioterapia para el cáncer de vejiga durante casi 40 años. La investigación anterior ha demostrado que la isoflavona, la genisteína, puede sensibilizar múltiples líneas celulares de cáncer a tratamiento HCPT, tales como la próstata y el cáncer cervical. En este estudio, se investigó si la genisteína podría sensibilizar a las líneas celulares de cáncer de vejiga y células epiteliales de la vejiga Bdec celulares para el tratamiento HCPT, y se investigaron los posibles mecanismos moleculares subyacentes. La genisteína de manera significativa y dependiente de la dosis podría sensibilizar a múltiples líneas celulares de cáncer de vejiga y células Bdec a la apoptosis inducida por HCPT tanto in vitro como in vivo. La genisteína y HCPT sinérgicamente inhibieron el crecimiento de células de la vejiga y la proliferación, y G2 inducida detención del ciclo celular de fase /M y la apoptosis en células de cáncer de vejiga y de células TCCSUP BDEC. El pretratamiento con genisteína sensibilizado BDEC y líneas celulares de cáncer de vejiga al daño del ADN inducido por HCPT por la activación sinérgica de la ataxia telangiectasia mutada (ATM) quinasa. La genisteína atenuó significativamente la capacidad de HCPT para inducir la activación de la anti-apoptótica ruta de NF-kappa B tanto in vitro como in vivo en un modelo de xenoinjerto de cáncer de vejiga, y por lo tanto contrarresta el efecto anti-apoptótico de la ruta de NF-kB. Este estudio indica que la genisteína podría actuar como un agente no tóxico prometedora para mejorar la eficacia de la quimioterapia del cáncer de vejiga HCPT
Visto:. Wang Y, Wang H, Zhang W, Shao C, P Xu, Shi CH, et Alabama. (2013) Las células del cáncer de vejiga genisteína sensibiliza a HCPT tratamiento in vitro e in vivo a través de ATM /NF-kB /IKK Camino apoptosis inducida. PLoS ONE 8 (1): e50175. doi: 10.1371 /journal.pone.0050175
Editor: Aamir Ahmad, Escuela de Medicina de la Universidad Estatal de Wayne, Estados Unidos de América
Recibido: 18 Junio, 2012; Aceptado: 22 Octubre 2012; Publicado: 24 Enero 2013
Derechos de Autor © 2013 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 30901498, Nº 30100185, Nº 81250036, Nº 30973000, Nº 30872583, Nº 81072116) y la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Shaan'xi, China ( 2009JQ4003). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de vejiga es una de las enfermedades más comunes que afectan el sistema urinario. Un total de 44,690 hombres (29,8 por 100.000) y 16.730 mujeres (11,2 por 100.000) fueron diagnosticados en 2006, ocupando el cáncer de vejiga como el cuarto más común masculina y femenina enfermedad maligna más común novena en los Estados Unidos [1]. En contraste, la incidencia de cáncer de vejiga en Asia es mucho menor. En 2009, Zhang et al. informaron que aunque las tasas aumentaron entre 1988 y 2002 (8,22 por 100.000 en 1988-1992, 9,45 por 100.000 en 1993 a 1997 y 9,68 por 100.000 en 1998-2002), la incidencia de cáncer de vejiga en China sigue siendo inferior a la de Estados Unidos [ ,,,0],2]. Del mismo modo, en el este de Asia, se han reportado una baja incidencia de cáncer de vejiga en Corea (14,39 por 100.000), Japón y la India (aproximadamente el 14 por 100.000) [3] - [5]. Además, las enfermedades específicas de las tasas de supervivencia a 5 años de los pacientes con cáncer de vejiga en Asia son más altos que en los países occidentales [6].
El agente quimioterapéutico, hidroxi camptotecina (HCPT), se usa principalmente para el tratamiento de cáncer de vejiga. HCPT induce la apoptosis en células de cáncer de vejiga mediante la formación de un complejo ternario con el ADN y la enzima topoisomerasa I de ADN a través de enlaces de hidrógeno, así, estabilizar el complejo. El complejo estable impide ADN re-ligación y se lleva a la conversión de roturas de ADN de cadena sencilla en-doble filamento se rompe durante la fase S. En este punto, el tenedor de replicación choca con complejos de escisión de ADN, que induce la apoptosis y la detención del ciclo celular [7].
genisteína, una isoflavona bien conocido y estrógeno botánico natural, se ha demostrado que inhibe el crecimiento de células de cáncer, supervivencia, la metástasis y la angiogénesis mediante el aumento de la muerte celular por apoptosis a través de la inducción de varios estímulos que dañan el ADN [8] - [10]. La genisteína se ha demostrado que tienen un efecto inhibidor sobre el crecimiento del cáncer de próstata [11], cáncer de cuello uterino [12], cáncer de mama [13], cáncer de colon [14] y el carcinoma de células renales [15] las células. La genisteína también puede chemosensitize muchos tumores malignos a los efectos de los fármacos tóxicos de ADN. Informes anteriores han indicado que el pretratamiento con 10 a 30 mol /l genisteína puede chemosensitize células de fibroblastos cervicales, de ovario y normales al tratamiento con HCPT mediante la inducción de un mayor grado de inhibición del crecimiento y la apoptosis de células [16]. Sin embargo, si la genisteína puede aumentar el efecto quimioterapéutico del HCPT en células de la vejiga, y su mecanismo molecular de acción en este tipo de tejido, siguen sin estar claros. Por lo tanto, hemos explorado si la genisteína podría chemosensitize células de cáncer de vejiga para HCPT, y se investigaron los posibles mecanismos subyacentes de este efecto.
Materiales y Métodos
1. Las líneas celulares
J82, líneas celulares de cáncer de vejiga SCaBER, y TCCSUP fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.), BFTC905, HT1197, T24, líneas celulares de cáncer de vejiga TSGH-8301 eran de la Centro de China para la Colección de Cultivos Tipo (CCTCC). La línea de células epiteliales de vejiga primario, BDEC, era de Bio Whittaker (San Diego, CA, EE.UU.) y se mantuvieron como cultivos exponencialmente en DMEM suplementado con suero bovino fetal 10% de crecimiento, 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina. La genisteína (Sigma, Shanghai, China) y HCPT (amablemente proporcionado por Sanofi, Shanghai, China) se disolvieron en DMSO para preparar soluciones madre 10 mM. Para los experimentos, las células se incubaron durante 3 días y después se trataron con o sin 10 genisteína mu M y 1 HCPT mu M durante 24 h.
2. inhibición del crecimiento celular por la genisteína y HCPT
Las células se sembraron a una densidad de 5 × 10
3 células /pocillo y se dejó que se unieran durante la noche. El medio de cultivo se reemplazó con medio fresco que contiene genisteína a diferentes concentraciones durante 24 h, y las células se expone después a HCPT para un 72 h adicionales. Para cada tratamiento con agente único, las células se trataron con genisteína durante 96 h y HCPT durante 72 h. El crecimiento celular se analizó utilizando el ensayo MTT.
3. La citometría de flujo para la apoptosis
Se tripsinizaron células adherentes, se volvieron a suspender y se trataron como se ha descrito anteriormente [17]. La citometría de flujo se realizó con luz azul-argón en láser (longitud de onda de excitación, 488 nm; potencia del láser, 200 mW) y la fluorescencia roja de la PI que etiqueta de ADN se registró. Todas las pruebas de la apoptosis se realizaron por duplicado y los resultados mostrados son representativos de al menos tres experimentos.
4. La tinción inmunofluorescente para γ-H2AX y ATM
Para la tinción de γ-H2AX, las células se trataron con diferentes concentraciones de HCPT y genisteína, se retiró el medio en diversos puntos temporales y las células se fijaron en 1% de paraformaldehído por 10 min seguido de 70% de etanol durante 10 min. Después las células se incubaron en 0,1% Triton X en tampón fosfato salino (PBS) durante 10 min, se permeabilizaron en 0,5% de Triton en PBS durante 10 min, se lavaron tres veces en PBS y se bloquearon con 5% de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS por 60 min. Las células fueron incubadas con anticuerpos anti-γ-H2AX (1:2,000; Cell Signaling, Shanghai, China) o anti-ATM (1:300, Señalización Celular, Shanghai, China) en 5% de BSA en PBS a 4 ° C durante la noche, se lavaron cuatro veces en PBS, se incubaron en la oscuridad con un anticuerpo secundario marcado con FITC (1:2,000 para anti-γ-H2AX y 1:300 para anti-ATM) en 5% de BSA durante 1 h, se lavaron 4 veces en PBS, se incubaron en la oscuridad con 1 mg /ml 4 ', 6-diamino-2-fenilindol (DAPI; Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) en PBS durante 5 min, y se monta y coverslipped en Fluoromount G (Biotech Sur, Birmingham, aL , ESTADOS UNIDOS). Los portaobjetos se examinaron en un microscopio de fluorescencia Leica (Wetzlar, Alemania), las imágenes fueron capturados utilizando un microscopio de fluorescencia Nikon (Nikon Eclipse E800) e importados en Nikon ACT-1 (versión 1.12) de software. Las imágenes se combinan en un formato de publicación utilizando el software Adobe Photoshop CS2. Para cada condición de tratamiento, se determinó el número de γ-H2AX o ATM focos en al menos 50 células. Todas las observaciones fueron validados por al menos tres experimentos independientes.
5. Western Blot
células de cáncer de vejiga se lisaron en tampón de lisis SDS l 1% 400 (HEPES 50 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, EDTA 10 mM, Nappi 4 mM, Na 2 mM
3Vo
4) durante 5 min en hielo para obtener lisados de células totales. Para recoger la proteína nuclear, las monocapas se lavaron tres veces con tampón de lisis hipotónico helado (HLB, pH 7,5, mM Tris 10 mM, KCl 10 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1, MgCl 2 mM
2), y se recogieron las células y se transfirieron a un homogeneizador (Wheaton Ltd, Millville, NJ, EE.UU.) en 500 l de HLB. Las células se hincharon en HLB de 15 min, se homogeneizó y los núcleos celulares se recogieron por centrifugación y se lisaron en tampón RIPA. El ensayo pull-down se realizó por la inmunoprecipitación de 500 mg de extracto nuclear o citosólico (precleared con Proteína A /G bolas) con el anticuerpo primario y, a continuación 50-100 mg, total o lisado nuclear se resolvió en un dodecil de sodio 7.5 a 12.5% sulfato-poliacrilamida (SDS-PAGE) gel, electro-transfirieron a una membrana Hybond ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, EE.UU.), bloqueado en PBS que contenía 5% de leche sin grasa seca y 0,05% de Tween-20, se incubaron con el anticuerpo primario durante la noche a 4 ° C, y luego se incubaron con anticuerpos secundarios durante 1 h. Las bandas de proteínas se visualizaron utilizando el Sistema Phototope HRP-occidental de detección (Señalización Celular, Beverly, MA, EE.UU.) y la película Kodar (Perkin Elmer, Waltham, MA, EE.UU.) y se escanean y se cuantificó usando ImageJ (http: //rsbweb.nih .gov /ij /). El anti-ATM, anti-fosfo H2AX, anti-fosfo ATM (Ser 1981), anti-IKK, anti-fosfo IKK1 /2, anti-β-actina, anti-GAPDH, anti-fosfo-NEMO (NF-kappa β modulador esencial), los anticuerpos anti-NBS1 (Nijimegen síndrome de rotura 1), anticuerpo anti-caspasa 3 y 9, de PARP anti-fosfo y anti-OCT1 se obtuvieron de señalización celular.
6. siRNA transfección
La transfección de células TCCSUP y Bdec con ATM siRNA (50 nmol /l; Invitrogen) se llevó a cabo utilizando el reactivo Oligofectamine (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante
7.. En los estudios de terapia de tumores in vivo
El experimento fue aprobado por el Comité de Ética de la Cuarta Universidad Médica Militar. las células del cáncer de vejiga fueron pre-mezclado 01:01 con Matrigel (Becton Dickinson, Pekín, China) y por vía subcutánea inoculado (5 × 10
6 células por sitio) en los flancos de 10 semanas de edad ratones desnudos SCID hembra (Departamento los animales de experimentación, la Cuarta Universidad médica Militar, Xian, Shaan'xi, china). El tratamiento farmacológico se inició 22 días después de la inyección de las células tumorales. Los ratones se dividieron al azar (5 ratones /grupo) en cinco grupos. El grupo de control se ha visto comprometida tumores que se trataron con 0,01% de DMSO. Los ratones se trataron por vía oral con el alimento que contenía la genisteína (1 g /kg) y /o la inyección transperitoneal de 3 mg /ml HCPT. El porcentaje de cambio en el tamaño del tumor se calculó mediante la comparación con el valor basal a los 22 días.
8. ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA)
extractos de células nucleares se obtuvieron como se ha descrito anteriormente, y 10 g de extracto nuclear se incubó con purificada
32P marcado con el consenso de NF-kappa B oligonucleótido de doble cadena y 0,25 mg /ml poli (dI-dC) en 5 × tampón de unión [18]. Las muestras se separaron en geles de poliacrilamida al 8%, los geles se secaron, se expusieron a una película de rayos X durante la noche a -80 ° C y se desarrollaron usando un All-Pro Plus procesador de la película de rayos X 100 automatizado (All-Pro Imaging Corporation, Hicksville, NY, EE.UU.).
9. Cuantificación y estadísticos métodos
Los grupos se compararon usando de Student
t-test
;
P
ha values≤0.05 se consideraron estadísticamente significativos.
Resultados
1. Efectos de HCPT y la genisteína sobre la viabilidad de células de cáncer de vejiga
células de la vejiga se trataron con genisteína durante 3 días, y la viabilidad celular se determinó usando el ensayo de MTT. El tratamiento de una variedad de líneas celulares de cáncer de vejiga y células de la vejiga Bdec con genisteína dio como resultado la inhibición de la dosis y dependiente del tiempo de la proliferación celular, lo que demuestra que la genisteína inhibe de forma reproducible el crecimiento de células de cáncer de vejiga. Sin embargo, se observó un efecto sinérgico cuando las células de cáncer de vejiga J82, T24, TSGH8301 y TCCSUP y células de la vejiga Bdec se trataron con diferentes concentraciones de genisteína y HCPT (Fig. 1A). ensayos de MTT indicaron que el efecto sinérgico de la genisteína y HCPT era dependiente de la concentración (Fig. 1B).
A. ensayo de MTT de las líneas celulares de cáncer de vejiga y células Bdec trató con 10 genisteína mu M y /o 1 HCPT mu M; los resultados se expresan como porcentaje de células de control. B. ensayo MTT de las células TCCSUP y Bdec tratados con diferentes concentraciones de HCPT y /o la genisteína para 48 h. C. distribución del ciclo celular de TCCSUP o BDEC trató con 1 HCPT mu M y /o 10 genisteína mu M durante 24 h. D. La apoptosis medida por FACS en TCCSUP, y BDEC trató con 10 M de genisteína y /o 1 HCPT M. Los valores son medias ± SEM de tres experimentos independientes; *
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2. Sinérgica la detención del ciclo celular por HCPT y genisteína
Tanto HCPT (1 m) y la genisteína (10 micras) para un período de 24 horas mostraron una capacidad significativa para detener el ciclo celular (Fig. 1C). En comparación con el vehículo, HCPT causó una detención del ciclo celular tanto en la fase S (control: 57,6%, HCPT: 46,5%, la genisteína: 57,9%, HCPT + genisteína: 31,1% para las células TCCSUP; control: 57,2%, HCPT: 43,1 %, la genisteína: 53,6%, HCPT + genisteína: 29,1% para las células Bdec) y la fase G2-M (control: 21,5%, HCPT: 30,6%, la genisteína: 22,1%, HCPT + genisteína: 41,6% para las células TCCSUP; control de : 21,7%, HCPT: 30,3%, la genisteína: 26,7%, HCPT + genisteína: 36,3% para las células Bdec). Aunque la genisteína (10 M) por sí sola no afectó el ciclo celular de manera significativa en comparación con los controles, la adición de genisteína a las células tratadas con HCPT (1 M) sensibilizado significativamente las células a través de la inducción de HCPT G2 detención del ciclo celular /M.
3. inducción sinérgica de la apoptosis por HCPT y genisteína
Uso de FACS para cuantificar la apoptosis, se observó que 10 mM genisteína y 1 M HCPT sinérgica y dependiente de la dosis induce apoptosis en células de cáncer de vejiga (Fig. 1D). La inducción de la apoptosis fue dependiente de la dosis y directamente correlacionado con una inhibición del crecimiento celular (Fig. 1B, D).
4. la activación de ATM NBS1 dependiente es inducida por daño en el ADN
Los resultados descritos en la sección 3.3 indica que la genisteína puede actuar sinérgicamente con HCPT para inducir apoptosis. Como se ha indicado anteriormente, HCPT podría inducir la apoptosis de las células a través de la inducción de roturas de doble cadena (DSB) en el ADN. Por lo tanto, se investigó si este sinergismo de la apoptosis está relacionada con OSD. células TCCSUP fueron tratados con 1 HCPT mu M y /o M 10 genisteína durante 1 h, y la proteína total de cada grupo se extrajo y se sometió a Western blot para la proteína histona cromosómica, γ-H2AX [19]. El Western blot demostró que HCPT y genisteína podría inducir sinérgicamente la fosforilación de H2AX a 1 hora después del tratamiento de drogas, lo que indica que estos fármacos podrían inducir OSD. Además, la fosforilación de H2AX fuerte todavía se podía ver en el grupo co-tratada 24 h después del tratamiento en comparación con las células administradas con sólo las drogas individuales, lo que demuestra un proceso de reparación daño en el ADN retardada (Fig. 2A). Además, 1 HCPT mu M y 10 M genisteína sinérgicamente activa la fosforilación de ATM en la Ser 794 de una manera dependiente de la dosis (Fig. 2B). La distribución espacial de ATM y γ-H2AX después del tratamiento de fármaco se determinó usando un ensayo de inmunofluorescencia multiplexada (Fig. 2C). Significativamente se observaron más ATM y γ-H2AX focos nucleares en las células TCCSUP tratados tanto con HCPT y genisteína durante 30 min en comparación con el control, y las células HCPT- genisteína tratados. Además, el tratamiento con estos dos fármacos aumentó significativamente la co-localización de ATM y γ-H2AX en el núcleo celular. El inhibidor de la ATM, Ku55933, disminuyó significativamente la formación de focos ATM, y de ese modo inhibe la γ-H2AX /ATM co-localización en HCPT- y las células tratadas con genisteína (Fig. 2C). Un ensayo de inmunoprecipitación se realizó para explorar cómo ATM es fosforilada después HCPT y tratamiento genisteína. El tratamiento con genisteína tanto HCPT y activa ATM e indujo una interacción entre la ATM /H2AX y NBS1 /H2AX en células TCCSUP y Bdec. El inhibidor NBS1, mirin, significativamente HCPT- atenuada y /o genisteína inducida por cajero automático o NBS1 y H2AX unión en HCPT- y las células tratadas con genisteína (Fig. 2D).
A. Western blot y la cuantificación de la reparación de daños en el ADN H2AX después del tratamiento previo de 10 M genisteína y /o 10 HCPT M. HP-1α se utilizó como control de carga; los resultados se expresan en relación con el grupo de control a 0 h. blot B. Western y la cuantificación de ATM Ser 1981 fosforilación después de que el pretratamiento de las células con 10 TCCSUP mu M de genisteína y /o 10 HCPT mu M durante 1 h. C. imágenes representativas y la cuantificación de la formación de la fosforilación y focos H2AX ATM 30 min después del tratamiento de las células con 1 TCCSUP HCPT mu M y /o M 10 genisteína; focos discretos de ATM autofosforilación aparecen en los sitios putativos de doble filamento se rompe. D. Identificación de la interacción /H2AX ATM NBS1-dependiente. células TCCSUP y células Bdec fueron tratados con 1 HCPT mu M y /o 10 genisteína mu M durante 1 h con o sin el inhibidor NBS1, mirin, se inmunoprecipitaron con anti-ATM o anticuerpos y los inmunocomplejos se detectaron por transferencia Western anti-NBS1. ATM focos aumentó linealmente con la dosis después de 1 h genisteína y tratamiento HCPT. Los valores son medias ± SEM de tres experimentos independientes; IP: inmunoprecipitación, W: Western-blot. *
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5. la inhibición de ATM regula a la baja NF-kB e induce la apoptosis en células de genisteína y HCPT- tratados
Los niveles de activado, fosforilada ATM se investigaron en las células TCCSUP. células TCCSUP tratados con 1 HCPT mu M durante 1 h mostraron una fuerte fosforilación constitutiva ATM, que podría ser inhibida por ATM siRNA o el pequeño inhibidor de la ATM específica molecular, KU55933 (Fig. 3A). ensayos de inmunoprecipitación indicaron que la ATM siRNA redujo la unión de las células ATM TCCSUP /NEMO; sin embargo, HCPT y genisteína podría aumentar sinérgicamente ATM /de unión (Fig. 3B) NEMO, lo que indica que NEMO juega un papel importante en la supresión de HCPT inducida por la activación de NF-kB. Además, el aumento sinérgico de ATM /NEMO unión en HCPT- y las células tratadas con genisteína fue acompañado por aumento de la expresión I? B? (Fig 3C.) Y la reducción de IKK1 /2 fosforilación (Fig 3D.); a su vez, éstos inducen el aumento de la escisión de la caspasa 3, caspasa 9 y PARP (Fig. 3E).
A. transferencia de Western de la fosforilación de ATM en células TCCSUP trató con 1 HCPT mu M durante 1 h transfectadas con el control no silenciar (NSC) siRNA, ATM siRNA o tratados con el inhibidor de la ATM, Ku55933 (10 M, 2 h). B. La inmunoprecipitación y transferencia de Western de ATM y NEMO en las células transfectadas con TCCSUP NSC siRNA o ATM siRNA, o tratadas con 10 mM Ku55933, 10 mM genisteína y /o 1 HCPT M. IP: inmunoprecipitación, W: Western-blot. C. EMSA blot de la expresión de NF-kB en las células TCCSUP trató con 10 M de genisteína y /o 1 HCPT mu M en presencia de NSC siRNA y ATM siRNA. blot D. Western de NF-kappa B, IKK2, la expresión de I? B? y IKK1 /2 fosforilación en células TCCSUP tratados con 10 M de genisteína y /o 1 HCPT mu M en presencia de NSC siRNA y ATM siRNA, lo que indica que la genisteína y HCPT inducen la fosforilación de IKK1 /2 y aumentar la expresión de I? B a través de cajeros automáticos. blot E. Western de PARP, la caspasa 3 y caspasa 9 de escisión en los lisados de células completas preparados a partir de células TCCSUP trató con 10 micras de genisteína y /o 1 HCPT mu M en presencia de ATM siRNA o Ku55933. Todos los experimentos se repitieron tres veces, y se obtuvieron resultados similares en cada réplica.
6. La genisteína atenúa inducida por HCPT NF-B-activación y apoptosis inducida por tanto, de forma sinérgica in vivo
Para comprobar el efecto inhibidor sinérgico sobre el crecimiento de la genisteína y HCPT en células de cáncer de vejiga, a fin de determinar sus efectos en un modelo de xenoinjerto de SCID los ratones tratados con la línea celular de cáncer de vejiga TCCSUP. La genisteína y HCPT exhiben un efecto inhibidor sinérgico sobre el crecimiento del tumor en xenoinjerto (Fig. 4A). Por otra parte, los tumores tratados con HCPT mostraron la activación de NF-kB, mientras que la genisteína atenuada esta activación (Fig. 4B). Disminución de la activación de las moléculas de aguas abajo IKK1 /2, el aumento de la fosforilación de I? B? Y el aumento de la escisión de la caspasa 3, se observaron la caspasa 9 y PARP en los tumores tratados con genisteína y HCPT (Fig. 4C).
Celular de cáncer de vejiga
TCCSU se permitió que los tumores establecer durante 22 días, a continuación, los animales fueron inyectados por vía intratumoral con 10 M de genisteína y /o 10 HCPT mu M en el día 0 y 7 de tratamiento. Curva de crecimiento de A. TCCSUP xenoinjertos de cáncer de vejiga tratados con genisteína y /o HCPT; el volumen del tumor se expresa en relación con el tamaño del tumor en el inicio del tratamiento. B. ensayo EMSA de expresión de NF-kappa B en los tejidos tumorales de xenoinjertos de cada grupo. El análisis de transferencia Western de C. IKK1 fosforilada /2, IKK2, la expresión de I? B? en los tejidos tumorales de xenoinjertos de cada grupo.
Discusión
La genisteína es considerado como un agente de quimioterapia potencialmente ideal para cáncer de vejiga, como es natural, seguro, con efectos secundarios mínimos y los costes relativamente bajos [20]. Investigaciones anteriores han indicado que la isoflavona de soja, que está presente en grandes cantidades de productos de soja, puede desempeñar un papel importante en la inhibición de la tumorigénesis [21]. También se ha demostrado que induce la apoptosis de las células a través de la disminución de la expresión de la 32 kDa caspasa 3 precursor y el aumento de los niveles de la forma activa escindido de esta caspasa [22]. Zhou et al. informaron de que las isoflavonas de soja y de soja concentrados fitoquímicos podrían inhibir el crecimiento de murino y las líneas celulares de vejiga humanos in vitro e in vivo de una manera dependiente de la dosis [23]. Investigaciones anteriores revelaron que el efecto inhibidor sinérgico de la genisteína y la camptotecina en el cáncer cervical, células de carcinoma de ovario y fibroblastos de ratón dio como resultado de su inhibición de NF-kappa B translocación y la inducción de la detención del ciclo celular G2 /M y la apoptosis [16].
Ya sea que la genisteína podría sensibilizar a las células de la vejiga para el tratamiento de la camptotecina no se ha estudiado previamente. En este estudio, se encontró que la genisteína y la HCPT para inhibir el crecimiento de varias líneas celulares de cáncer de vejiga y la línea de células epiteliales de vejiga primaria BDEC (Fig. 1A). La genisteína y HCPT sinérgicamente y la supervivencia celular inhibida de forma dependiente de la dosis (Fig. 1B), G2 inducida /detención del ciclo celular M (Fig. 1C) y la apoptosis (Fig. 1D) en la línea celular de cáncer de vejiga y la vejiga TCCSUP BDEC células epiteliales. Con respecto al mecanismo subyacente, la inducción de la dependiente de la dosis el daño del ADN sinérgico por genisteína y HCPT y su efecto inhibidor sobre el proceso de reparación de daños de ADN se observó para hasta 24 h, en comparación con la genisteína o tratamiento HCPT solo (Fig. 2A) . Como se informó anteriormente, tanto HCPT [24] y la genisteína [25] podría inhibir directamente la ADN topoisomerasa I. Se postula que la inducción de daño en el ADN por HCPT y la genisteína es debido a su inhibición de la topoisomerasa de ADN y por lo tanto, sus efectos sobre la formación de el tenedor de replicación, lo que requiere una mayor investigación.
a continuación, se investigaron los efectos de señalización corriente abajo de daño en el ADN inducido por genistein- y HCPT para determinar la forma en la inducción sinérgica de la fosforilación de ATM está relacionado con su efecto pro-apoptótica. quinasa ATM es un regulador clave que se activa por el daño del ADN [26]. Se ha informado de que se correlaciona estrechamente con la apoptosis celular en múltiples células de cáncer. Zuco et al. informó de que el derivado de camptotecina, ST1968, puede inducir la apoptosis a través de la activación de ATM [27]. Kawakami et al. informó de que la doxorrubicina puede inducir la apoptosis en células de adenocarcinoma de pulmón A549 por la activación de ATM [28]. En este estudio, se encontró que un tratamiento combinado con genisteína y HCPT sinérgicamente inducida por la fosforilación de ATM Ser 1981 (Fig. 2B) en los sitios de daño en el ADN. En las células tratadas con genisteína y HCPT, la inhibición de ATM por su inhibidor específico, Ku55933, inhibió la fosforilación de ATM y H2AX, y por lo tanto inhibe su co-localización (Fig. 2C).
NBS1 se ha demostrado siendo el elemento clave de la MRE11 /RAD50 /NBS1 complejo, que forma inmediatamente después de que se forme ADN OSD para reclutar proteínas relacionadas con la reparación de los sitios de ADN dañado [29]. ATM y NBS1 tanto se unen a H2AX, un andamio de proteínas en los sitios de daño en el ADN. Como se ha descrito anteriormente [30], encontramos que la capacidad de la genisteína y HCPT para inducir sinérgicamente daño del ADN en las células de cáncer de vejiga a través de la activación de ATM fue dependiente de NBS1, como el inhibidor de mirin NBS1 abrogada específicamente HCPT- y vinculante genisteína inducida ATM /H2AX y NBS1 /H2AX de unión (Fig. 2D). Estos resultados indicaron que el sinérgico DNA efecto dañino de estos dos fármacos se debe a su inhibición de la ATM, que es NBS1-dependiente. La fosforilación de ATM podría activar NF-kappa B a través de NEMO [31], lo que conduce a la activación y expresión de una variedad de genes pro-proliferativos y anti-apoptóticos, protegiendo así las células cancerosas de la apoptosis. NEMO se cree que es una subunidad de unión polyubiquitin, que recluta a los andamios IKK poliubiquitina lineales o K63 vinculados a que se forman como consecuencia de eventos de señalización de los receptores de iniciada [32]. Por lo tanto, después del tratamiento con fármacos tóxicos de ADN, tales como HCPT, DSB inducida por la activación de ATM y la ruta de NF-kappa B aguas abajo se activa a través de NEMO (Fig. 3B). Sin embargo, la ruta de NF-kappa B se ha demostrado que protege las células de la apoptosis de células, lo que podría, en parte, atenuar los efectos tóxicos de HCPT. En nuestra investigación, el tratamiento genisteína podría inactivar la ruta de NF-KB en el cáncer de vejiga y células epiteliales. En resumen, tras el tratamiento HCPT, el daño del ADN puede inducir la fosforilación de ATM, que activa la ruta de NF-KB para proteger las células de la apoptosis. Sin embargo, la capacidad de la proteasa múltiplo de genisteína ayuda a derogar inducida por HCPT activación de NF-kappa B [33]. La caída de ATM bloqueó completamente la capacidad de HCPT y genisteína para inducir la activación de NEMO /IKK (Fig. 3D) y se inhibe la escisión de la caspasa 3, caspasa 9 y PARP (Fig. 3E). Esto indicó que la ATM juega un papel central en HCPT- y la apoptosis inducida por la genisteína.
Para confirmar los efectos sinérgicos de HCPT y la genisteína, hemos realizado experimentos in vivo de xenoinjertos. En los xenoinjertos de células TCCSUP cultivados en ratones SCID, el tratamiento combinado con HCTP y genisteína sinérgicamente inhibieron el crecimiento tumoral (Fig. 4A). Este evento molecular intracelular es de acuerdo con los hallazgos descubiertos anteriormente en células de la vejiga. HCPT fue mostrado para activar NF-kappa B, que fue contrarrestado por la genisteína en ratones SCID (Fig. 4B). Co-tratamiento con estos dos fármacos activa sinérgicamente ATM e inhibió I? B (Fig. 4C).
Esta investigación indica que la isoflavona, la genisteína, puede fortalecer de manera significativa los efectos del agente de la quimioterapia del cáncer de vejiga, HCPT, tanto en vivo e in vivo. Los sinérgicos efectos pro-apoptóticos de estos dos fármacos inducen más DSB y retrasan el proceso de reparación de daños en el ADN mediante la activación de la vía ATM /NBS1 /NEMO /IKK. Sin embargo, algunos aspectos de este mecanismo aún no se han dilucidado. En primer lugar, sigue siendo desconocida en cuanto a si la OSD sinérgico efecto de HCPT y genisteína inducir produce a través de la interferencia con el tenedor de replicación y toposoimerase I. En segundo lugar, todavía no está claro cómo se retrasa el proceso de la reparación de DSB, si esto es a través de la inhibición de la homóloga recombinación, o la inhibición de extremos no homólogos de unión. En tercer lugar, el papel de la inhibición sinérgica de la activación de NBS-1 por HCPT y la genisteína en la malformación del complejo MRN requiere más exploración. Al final, la genisteína es un estrógeno botánico bien conocido, y el estrógeno se ha demostrado que se expresa en cáncer de vejiga de células transicionales, y se correlaciona negativamente con el grado del tumor [34]. Si el efecto de los estrógenos de la genisteína se correlaciona con el efecto inhibidor del crecimiento sinérgico aún no se han explorado en el futuro.
En conclusión, este estudio demuestra que la genisteína puede sensibilizar líneas celulares de cáncer de vejiga a HCTP, lo que lleva a una dosis sinérgica la inhibición dependiente de la proliferación y la inducción de la detención del ciclo celular y la apoptosis. La genisteína y HCTP inducen roturas de la doble hebra de ADN, lo que conduce a la activación sinérgica de ATM, atenúa NEMO /NF-kB /IKK /transducción de señales de la caspasa, y por lo tanto induce la apoptosis tanto in vitro como in vivo. La genisteína también podría contrarrestar la activación de NF-kB inducida por HCPT, y así atenuar el efecto anti-apoptótica de la ruta de NF-kB, tal como se resume en la figura. 5. Estos resultados indican que, aunque los mecanismos subyacentes requieren mayor exploración, la administración combinada de HCTP y genisteína podría ser un enfoque prometedor para el tratamiento de cáncer de vejiga humana.
ATM es fosforilada en sitios de ADN de doble hebra rompe por NBS1 en presencia de la fosforilación de H2AX. Activado ATM es transportado al citoplasma, y activa NEMO, que fosforila IKK1 /2. IKK1 /2 se conecta y ubiquitinizes I? B, que conduce a la degradación de I? B. Esto estimula la liberación y transporte de NF-kB al núcleo, donde se une al ADN, se activa la caspasa división e inicia la apoptosis.
Reconocimientos
Agradecemos a la doctora Claudia Buehnemann ( Universidad de Oxford, Reino Unido) por su excelente asistencia técnica.