Extracto
La obesidad, y en particular la obesidad visceral, se ha asociado con un mayor riesgo de desarrollar cáncer, así como tasas más altas de la mortalidad tras el diagnóstico. El impacto de la obesidad en las células del estroma derivadas de tejido adiposo (ASC), que contribuyen a la formación de estroma tumoral, es desconocido. Aquí la hipótesis de que la fuente visceral y la obesidad inducida por la dieta (DIO) cambia el fenotipo ASC, contribuyendo a la promoción de tumor efectos de la obesidad. Se encontró que el ASC aislado del subcutánea (SC-ASC) y visceral (V-ASC) del tejido adiposo blanco (WAT) de ratones delgados (Le) y obesidad (OB) exhibieron las células mesenquimales marcadores de superficie expresión similar, y tenía efectos comparables sobre el ovario proliferación de células cancerosas y la migración. ASC derivadas obesidad visceral y proliferaron más lento y exhibió una diferenciación alterada en adipocitos y osteocitos
in vitro
en comparación con ASC derivadas de WAT subcutánea de ratones delgados. Intraperitoneal co-inyección de células de cáncer de ovario con ASC derivadas obesos o visceral, pero no magra SC-ASC, un mayor crecimiento de los tumores intraperitoneales ID8 en comparación con los controles. Obeso y V-ASC aumento de la infiltración del estroma de células inflamatorias, incluyendo las células T CD3 + y F4 /80 + macrófagos. ASC obesidad visceral y derivados, pero no magra SC-ASC, aumento de la expresión de factores quimiotácticos IL-6, MIP-2 y MCP-1 cuando cultivadas con células tumorales. En general, estos resultados demuestran que obesos y V-ASC tienen un fenotipo único, con la proliferación más limitada y capacidad de diferenciación pero una mayor expresión de factores quimiotácticos en respuesta a las células malignas que apoyan la infiltración de células inflamatorias y el crecimiento y la diseminación tumoral apoyo.
Visto: Zhang Y, Nowicka A, Solley TN, Wei C, Parikh A, Corte L, et al. (2015) Las células estromales derivadas de tejido adiposo visceral y obesidad Fomentan el desarrollo de los cánceres ováricos. PLoS ONE 10 (8): e0136361. doi: 10.1371 /journal.pone.0136361
Editor: Sandra Oršulić, el Cedars-Sinai Medical Center, Estados Unidos |
Recibido: 19 de mayo de 2015; Aceptado: 31 de julio de 2015; Publicado: 28 Agosto 2015
Derechos de Autor © 2015 Zhang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Fondo de Investigación del cáncer ovárico (LT /MDACC /01.2011) y la Sociedad Americana del cáncer (RSG-14-159-01 ) para AHK. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la obesidad aumenta el riesgo y /o la mortalidad de muchos tipos de cáncer, incluido el de endometrio, colon, páncreas y ovario [1-5]. El exceso de tejido adiposo visceral blanco (WAT) ha demostrado ser tóxico particularidad, aumentando el riesgo y la mortalidad independiente del índice de masa corporal (IMC) en muchos tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de ovario [5]. Una serie de mecanismos se han identificado a la cuenta para la relación entre la obesidad y cáncer, como la secreción de adipoquinas, resistencia a la insulina, y la aromatización de las hormonas esteroides para aumentar la circulación de estrógenos [6-8]. El tejido adiposo también contiene una población de células tumorales-trópico madre adiposas (ASC) que apoyan la formación de la vasculatura del tumor [9] [10]. Recientemente, se informó que ASC epiplón humano derivado de promover el crecimiento y la vascularización de xenoinjertos de cáncer de endometrio, en comparación con subcutáneamente ASC derivadas [11]. Sin embargo, las diferencias en el enfoque de aislamiento o variabilidad individual pueden haber influido en el fenotipo ASC. Además, los estudios en modelos de xenoinjerto no recapitulan los efectos de células inflamatorias en el microambiente tumoral, que están mejor modelado en un modelo singénico. Epiplón, parte de la grasa visceral, es el sitio más frecuentemente implicados de la metástasis del cáncer de ovario. metástasis omental es un asunto particularmente crítico en el cáncer de ovario, que tiene la más alta tasa de recidiva y la supervivencia más baja entre los cánceres ginecológicos. El mecanismo detrás de esto no es bien conocida. Además, los modelos singénicos de difusión intraperitoneal están bien establecidos en el cáncer de ovario pero no de cáncer endometrial. Por lo tanto, para entender el papel de la ASC de diversas localizaciones anatómicamente: tejido adiposo subcutáneo y visceral, en el cáncer de ovario, se investigó el efecto de la obesidad inducida por dieta (DIO) en estos diferentes ASC y su papel en el crecimiento del tumor en la zona abdominal por utilizando un modelo murino intra-abdominal singénico de cáncer de ovario.
in vitro
y
in vivo
ensayos se utilizaron para analizar ASC aislado del subcutánea (SC-ASC) y WAT visceral (V-ASC) de ratones delgados (Le) y obesidad (OB) para caracterizar los efectos de la obesidad y de depósito adiposo y fenotipo ASC.
Materiales y Métodos
cultivo de células
ASC se cultivaron en medio esencial α-mínimo (α-MEM) que contiene 20% de FBS, L-glutamina, penicilina y estreptomicina. ID8 células y IG10 fueron generosamente proporcionadas por Katherine Roby [12]. ID8 células y IG10 fueron transfectadas establemente con luciferasa y de tomate rojo genes de luciérnaga con el uso de un método lentiviral [13] (pFULT vector fue proporcionado amablemente por Dr.Jennifer Prescher). Las células cultivadas fueron probados rutinariamente para la viabilidad con exclusión de azul de tripano y mantienen una alta viabilidad (& gt; 95%). Para
in vivo
experimentos, la fracción de minuto de células muertas se eliminó predominantemente por lavado antes de la tripsinización.
El aislamiento de SC-ASC y V-ASC
ASC fueron aisladas de WAT WAT subcutánea y visceral de C57BL /6 ratones hembras alimentadas con una dieta baja en grasa (LFD) o la dieta alta en grasa (HFD) durante 15 semanas. HFD y LFD se adquirieron de la dieta de Investigación INC. WAT subcutánea fue tomada del torso posterior, y WAT visceral fue tomada de retroperitoneal y depósitos gonadales. WAT se sometió a ruptura mecánica, seguido de 0,5 mg /ml de colagenasa tipo I (Worthington Biochemical) y 50 U /ml de dispasa (Becton Dickinson) la digestión de acuerdo con los protocolos publicados [11]. Digerido WAT se centrifugó a 1000 rpm durante 5 minutos. Se eliminó el sobrenadante que contiene adipocitos. El sedimento celular resultante se resuspendió en α-MEM que contiene 20% de FBS y se filtró a través de 100 micras filtro de células (Becton Dickinson) y luego a través de coladores celulares de 40-M.
Caracterización de SC-ASC y V-ASC
Todos los ASC se ampliaron
in vitro
y principios de los a pases se utilizaron para caracterizar con el uso de la citometría de flujo para la expresión de los siguientes marcadores de superficie celular: CD34, CD31, CD45, CD29, CD11b, CD73 , CD90, y CD105 (Becton Dickinson). estudios de la diferenciación de células se realizaron como se describe anteriormente [14]. Para la diferenciación de adipocitos, las células confluentes en 6 pocillos o de 24 pocillos placa se cultivaron en medio de inducción adipogénica, medio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM; Mediatech) suplementado con 10% FBS, 1% de penicilina /estreptomicina, 10 mg /ml de insulina, 500 M 3-isobutil-1-metilxantina (Sigma-Aldrich), 1 mM de dexametasona (Sigma-Aldrich), y 200 mM de indometacina (Sigma-Aldrich). Después las células se mantuvieron en medio de inducción durante 72 horas, el medio se cambió a medio de mantenimiento adipogénico, de Dulbecco Modificado Medio de Eagle suplementado con 10% FBS, 1% de penicilina /estreptomicina, y 10 mg /ml de insulina durante 24 horas. Este procedimiento de mantenimiento 72 horas de inducción y 24 horas se repitió dos veces. Después de que las células de terceros de inducción se colocaron en medio de mantenimiento para un total de 10 días de incubación. medios de mantenimiento se cambió dos veces a la semana. Las células fueron fijadas en formalina al 10% durante 10 min seguido de 60% de isopropanol. Oil Red O (Sigma-Aldrich) tinción se aplicó para visualizar vacuolas lipídicas rojos. Para la diferenciación de los osteoblastos, las células confluentes en placas de 6 pocillos se cultivaron en NH OsteoDiff Medio (Miltenyi) durante 3 semanas, con el medio cambió dos veces por semana. Después de 3 semanas, las células se lavaron 3 veces con PBS y se fijaron con metanol previamente enfriado 100%. Las células se tiñeron con rojo de alizarina S. cinco imágenes representativas de cada pocillo (tres pocillos para cada ASC) fueron tomadas por microscopio Leica DMI6000B y se analizaron por Informar de software: regiones del rojo de alizarina o Oil Red O teñidas se definen en 4-6 imágenes, y el software de reconocimiento se aplica a todas las imágenes. La tinción en píxeles se cuantificó para cada imagen, y el porcentaje de tinción se calculó y se promedió a partir de todas las imágenes para un porcentaje final.
qPCR ensayo
mRNA de la Ob /Le deriva SC- se aisló ASC o V-ASC en diferentes días durante la inducción de la adipogénesis utilizando TRIzol y se convierten en cDNA utilizando superíndices III Reverse Transcriptase (Invitrogen). Cuantitativa análisis de RT-PCR se realizó sobre la base de cebadores TaqMan /PCR Universal Master Mix (Invitrogen) usando la plataforma ABI 7900 estación de trabajo y el software SDS 2.4 (Applied Biosystems, Grand Island, NY, EE.UU.) y se utilizó 2 ^ -delta Ct valor para el análisis [15]
ensayo de proliferación
luciferasa-etiquetados ID8 y se sembraron IG10 células a una densidad de 500 células por pocillo en un BD Falcon placa de 96 pocillos solo o en 1: 1. cocultivo con ASC principios de pases. Después de 24 horas, la expresión de luciferasa se midió en 0,15 mg /ml de D-luciferina. Después de 1 hora de incubación a 37 ° C, la luminiscencia se midió con un espectrofotómetro (FLUOstar Omega, BMG Labtech). a continuación, se sustituyó el medio, y las mediciones se repitieron cada dos días hasta que las células alcanzaron la confluencia.
Migración de ensayo
medio condicionado (CM) desde la primera a pases subcutánea o visceral de ASC WAT obesa o delgada se recogida de una placa de 6 pocillos que se sembró con 300.000 células por pocillo con medio libre de suero durante 48 horas. migración ID8 y IG10 se analizó en CM ASC en un transwell 24 pocillos (Corning Inc.) con poros de 8 micras. CM se colocó en la parte inferior de la transwell y ID8 en la parte superior de la transwell. Cada CM se ensayó por triplicado. Se midió el número de células que habían migrado a la parte inferior de la transwell después de 8 horas mediante la tinción de las membranas con un Hema 3 Stat Pack (Thermo Fisher Scientific) y luego retirar mecánicamente las células residuales sobre la membrana superior. Las células unidas a la parte inferior de la membrana se disociaron de la membrana utilizando 2% deoxycholicacid. La densidad óptica de la suspensión resultante se detecta mediante un lector de placas de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) (BioTek Instruments) a 590 nm en una placa de 96 pocillos [16].
ensayo de formación de esferoide
Un total de 40.000 temprana a pases ASC o células de cáncer de ovario se sembraron en 2 ml de medio de ensayo esferoide (MEM con 0,1 mg /ml de gentamicina, 1% de penicilina /estreptomicina, 10 ml de B27, 10 g de FGF, y 10 g de EGF de Gibco) en placas de unión lento durante 5 días y se recoge como spheriod medio condicionado (CM-esferoide). culturas esferoides se iniciaron mediante la siembra de 100 células de cáncer o ASC en 100 ul de medio que consiste en 50% ASC o de células de cáncer esferoide-CM y medio de ensayo esferoide regular de 50% en placas de 96 pocillos. Catorce días después, se añadieron 7,5 l de MTT (bromuro de Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolio) a cada pocillo. Esferas se contaron manualmente con un diámetro de al menos 50 um para excluir células individuales o escombros. Cada muestra se repitió en 8 pozos.
ensayos de Luminex
El esferoide CM descrito anteriormente se analizó para la angiogénesis /crecimiento o citoquinas /quimioquinas panel de factores incluyendo la IL-6, SDF-1, MCP 1, TNF-a, IL-10, MIP-1a, 1b, MIP-2, y VEGF con Luminex 100 mediante el uso de un kit de MAP MILLIPLEX (EMD Millipore Corp, Billerica, MA, EE.UU.). Los datos fueron procesados por el software administrador de Bioplex.
in vivo se llevaron a cabo estudios
Los experimentos con animales de acuerdo con el MD Anderson Institucional Cuidado de Animales y el protocolo aprobado por el Comité de Uso (120914932). Todos los ratones fueron alojados y tratados de acuerdo con las normas institucionales. Ratón cepas C57BL /6 fueron de Jackson Lab. Para DIO inducción [17], HFD D12492 (60 kcal% de grasa) y LFD D12450B (10 kcal% de grasa) de las dietas de investigación se utilizaron. Todos los ratones en nuestros experimentos se les dio 2-4% de isoflurano para anestesiar y la profundidad de la anestesia se controló mediante la frecuencia respiratoria y la ausencia de reflejo de retirada de pellizco de la almohadilla plantar. Para evaluar el efecto de la obesidad sobre el cáncer de un total de 10
se inyectaron 6 luciferasa que expresan ID8 en 200 l de PBS por vía intraperitoneal (IP) en ratones HFD o LFD, y los tumores se dejaron crecer durante 10 semanas la obesidad para el crecimiento tumoral. Con el fin de investigar más a fondo los diferentes efectos de ASC derivadas visceral y ASC subcutáneos derivados sobre el cáncer, ratones delgados 6 semanas de edad se anestesiaron como anteriormente y se inyectaron por vía intraperitoneal con 1 × 10
6 células ID8 luciferasa que expresan y 1 x 10
6 primeros pasajes del SC-ASC o V-ASC de ratones obesos o apoyarse en el abdomen (5 ratones por grupo). señales de luciferasa se midieron para determinar el tamaño del tumor por IVIS Imaging serie sistema 200 (Xenogen Corporation) dos veces a la semana después de 4 días, y las imágenes se analizaron utilizando el software Image estar (Caliper Life Sciences). En torno al día 50, los ratones fueron sacrificados por sobredosis de la inhalación de isoflurano, se recogieron ascitis y nódulos tumorales cerca del estómago fueron recuperados de los ratones sacrificados. La ascitis se centrifugaron, y la lisis de glóbulos rojos (eBioscience) se utilizó para eliminar las células rojas de la sangre en los sedimentos celulares; esto fue seguido por 10 ml de a-MEM con 20% de FBS para la neutralización. Las células de ascitis se almacenaron a -80 ° C y posteriormente se analizaron por citometría de flujo para la composición celular. Inmunofluorescencia en secciones de tejido incluidas en parafina fijadas con formalina se llevó a cabo después de la recuperación de antígenos, lavando con 0,2% Triton X-100, y el bloqueo en libre de suero La proteína Block (DAKO); esto fue seguido de la incubación con anticuerpos primarios (4 ° C, 12 horas) y anticuerpos secundarios (temperatura ambiente, 1 hora) en PBS que contenía 0,05% de Tween-20. Los anticuerpos primarios utilizados fueron los siguientes: conejo anti-Ki-67 (Thermo Scientific, 1: 200), biotinilado GSL I-isolectina B
4 para la tinción de los vasos del tumor (Vector, 1:50), rata anti-F4 /80 (Abcam, 1: 100), de rata anti-CD3 (Abcam, 1: 100), y el conejo anti-perilipin (Cell Signaling Technology, 1: 100). burro secundaria Alexa 488-conjugado (1: 150) IgG fue de Invitrogen, Cy3-conjugado (1: 300) IgG era de Jackson ImmunoResearch, y estreptavidina-Cy3 (1:20) fue de Invitrogen. Los núcleos se tiñeron con Hoechst 33258 (Invitrogen).
microTC Scan en ratones SC-WAT y V-WAT
Para determinar el volumen de tejido adiposo visceral y subcutáneo, se utilizó MATLAB (Mathworks, Natick, MA) para crear un programa interno. exploraciones fueron adquiridas mediante MicroCT (escáner) y llevados al (kVp, mA, FOV, grosor de corte). Las imágenes de TC para cada ratón fueron importados como una serie de imágenes DICOM. La región de interés (ROI) para la determinación de volumen adiposo se limitó al abdomen. Por consiguiente, los límites superior e inferior de la ROI se definen a partir de la parte inferior del diafragma a la cara superior de la cabeza femoral. A continuación, dibujamos manualmente contornos elípticos dentro de la musculatura abdominal se extiende posteriormente al cuerpo vertebral para que el tejido adiposo visceral se mantuvo dentro de la elipse y el tejido adiposo subcutáneo estaba fuera de la elipse. Las elipses se dibujan en la parte superior, el cuartil superior, medio, el cuartil inferior, y las rebanadas inferiores del retorno de la inversión. Durante este proceso, se determinó la localización óptima y el tamaño de la elipse con el fin de separar el tejido adiposo visceral y de los tejidos adiposo subcutáneo tanto como sea posible. Entonces, el programa interpola linealmente estos contornos para el resto de las rodajas, separando eficazmente el retorno de la inversión en 2 regiones. El área encerrada por la elipse contenía la cavidad abdominal, que incluía el tejido adiposo visceral y órganos. La zona exterior de la elipse contenía el tejido adiposo subcutáneo.
Finalmente, el programa calcula el volumen de tejido adiposo contando automáticamente el número de voxels correspondientes al tejido adiposo, y multiplicando por el volumen de cada voxel. adiposo subcutáneo consistía en tejidos entre - 50 y 150 unidades Houncefield (HU) y adiposo visceral consistía en tejidos entre -50 y 200 HU. Se seleccionaron los rangos basados en el análisis visual de la distribución HU de los tejidos adiposos.
La adquisición de imágenes y análisis de datos
Las imágenes fueron adquiridas por el Sistema Automatizado Vectra multiespectral de imágenes (Perkin Elmer) y se analizaron mediante Informe software: regiones de interés se definieron en 4-6 imágenes y el software de reconocimiento se utilizó para clasificar todas las imágenes. Fluorescencia de interés en píxeles se cuantificó para las diferentes categorías de tumores de cada imagen, y el porcentaje de la fluorescencia de la categoría de tumor diana se calculó y se promedió a partir de todas las imágenes de un tumor para un porcentaje final. Al menos 10 imágenes por diapositiva se cuantificaron. Tres tumores se analizaron a partir de cada uno de los grupos experimentales ID8. Se llevó a cabo el análisis estadístico con la prueba de Mann-Whitney, de dos colas.
La citometría de flujo
ASC o células del tumor o la ascitis se resuspendieron en PBS suplementado con 2% de FBS (10
6 células /100 l /reacción de tinción). 1 g de cada anticuerpo se añadió a la suspensión celular y se incubaron a 4 ° C durante 30 minutos. poblaciones de células marcadas se analizaron entonces mediante Gallios citómetro de flujo (Beckman Coulter) LSRII (BD Bioscience) con Kaluza o software FlowJo. toma de la muestra fue acompañada con el uso del control sin mancha, solo color manchado, y controles de isotipo para determinar la adecuada tensiones, compensaciones, y la colocación de puertas para la adquisición de datos. células de ascitis fueron pre-gated para excluir los desechos, grupos de células, contaminando células polimorfonucleares, células rojas de la sangre, y las células muertas basándose en la tinción DAPI. composiciones celulares se analizaron basan en Texas Red (canal Rojo Texas) y los siguientes clones de IgG: APC-anti-CD34 (RAM34), PE-Cy7-anti-CD31 (MEC 13.3), APC-Cy7-CD45 (30-F11) o Texas Red, PE-Cy7-anti-CD11b, y APC-F4 /80, y los controles de isotipo correspondientes (BD Biosciences). Isotipos y las posiciones de hematopoyético previamente caracterizado y poblaciones endoteliales en las parcelas [18,19] se utilizaron para establecer los puntos de corte de compuerta.
análisis estadísticos
Para el análisis de los
in vivo
los datos, el tamaño del tumor medido como la intensidad de luminiscencia fue transformada por los logaritmos de base 10 para aproximarse a la normalidad para el modelo lineal. Se utilizó un modelo de efectos mixtos lineal con medidas repetidas para evaluar las diferencias entre los grupos (Le-V-ASC, Le-SC-ASC, Ob-V-ASC, Ob-SC-ASC, y ID8 solamente) a través de múltiples puntos de tiempo. Nuestro modelo final incluyó el efecto fijo de grupo (5 grupos), y el día (la interacción entre el grupo y el día no fue significativa), efecto aleatorio de los ratones anidados dentro del grupo, y medidas repetidas con el fin de auto-primera estructura de covarianza regresiva. Se examinó la normalidad de los residuos por parcela normal de cuantil-cuantil (parcela Q-Q) [20]. El análisis de la
in vitro
datos se realizó utilizando SAS 9.3 (Gary, NC). Los resultados in vitro se informaron como medias +/- error estándar de la media.
valores de P fueron obtenidos mediante la prueba de Mann-Whitney de dos colas. Se utilizó la prueba de log-rank para comparar el tiempo de detección de la enfermedad mediante el uso de imágenes de la luciferasa.
Resultados
La obesidad aumenta el crecimiento de los cánceres de ovario ID8
Para determinar si la obesidad tiene un efecto directo sobre el crecimiento de cáncer de ovario de murino, se utilizó un modelo murino singénico de cáncer de ovario en ratones C57BL /6 ratones que son propensos a DIO. C57BL /6 ratones hembras fueron alimentados con una dieta alta en grasas (60% de kcal de grasa) o una dieta baja en grasa (20% de kcal de grasa). Después de 4 meses, los ratones alimentados con una dieta alta en grasas tenían casi el doble del peso corporal de los ratones alimentados con la dieta baja en grasa (Figura 1A) (peso corporal, 37,6 g vs. 22,6 g media). Para determinar si los ratones con DIO habían aumentado WAT visceral, así como WAT subcutánea, el volumen de WAT visceral se midió con exploraciones microCT. Los ratones con DIO contenía más de un volumen de 16,7 veces más alto de grasa visceral y 6,5 veces mayor volumen de grasa subcutánea que ratones delgados (Figura 1B). Los ratones fueron luego isografted con 1 x 10
6 ID8 células del cáncer ovárico luciferasa de luciérnaga que expresan por vía intraperitoneal. A los 11 días, la actividad luciferasa fue significativamente mayor en los ratones con DIO que en ratones delgados (Fig 1C y 1D), lo que demuestra que la obesidad inducida por la dieta acelera los tumores de ovario ID8.
A, se alimentaron ratones C57BL /6 una HFD o LFD por 4 meses. N = 10 por grupo. Los ratones que fueron alimentados con una HFD tenía mayor peso corporal que los ratones que fueron alimentados con una LFD (peso corporal, 37,6 g vs. 22,6 g media). B, tomografías computarizadas de HFD o ratones LFD (HFD: significa WAT visceral: 7,2 cm
3 y significa SC WAT 6,6 cm
3; LFD: significa WAT visceral: 0,4 cm
3 y la media de SC WAT 1.0 cm
3) HU y distribución de la grasa visceral y subcutánea de ratones HFD o LFD. asteriscos amarillos indican la grasa visceral, y asterisco rojo indica la grasa subcutánea. líneas verticales rojas denotan los valles superior e inferior que definen el intervalo HU correspondiente al tejido adiposo. Las barras de error, SEM. ***,
P Hotel & lt; 0,001 (Estudiante
t
prueba). C ratones, Representante HFD y LFD con señales de luciferasa de tumores. Los ratones fueron i.p. isografted con 1 x 10
6 células tumorales que expresan luciferasa ID8. Los tumores se midieron por la detección de señales de luciferasa dentro de lado abdominal de los ratones. D, la obesidad inducida por la dieta acelera ID8 tumores ováricos. El crecimiento tumoral en ratones HFD y LFD por 11 días.
El aislamiento y la caracterización de ASC a partir adiposo subcutáneo y visceral de los ratones delgados y obesos
Para determinar si los efectos de la obesidad se mediada por ASC , hemos aislado y caracterizado SC-ASC y V-ASC de ratones libres de tumor alimentados con una HFD o LFD, como se describe anteriormente. ASC se aisló de acuerdo con protocolos publicados previamente [11]. Morfológicamente, SC-ASC y ASC-V a partir de ratones obesos o magra exhiben un fenotipo mesenquimal similar (Figura 2A). la expresión de marcadores de superficie celular se caracterizó por triplicado con citometría de flujo después las células se hicieron pasar 3 veces (Fig S1 y el cuadro S1). Todo ASC fueron negativas para CD31 endotelial marcador, marcador de monocitos CD11b, CD45 y marcador de linaje hematopoyético. mesenquimales marcador, CD29 se expresa en todas las líneas 4 ASC, mientras que los marcadores mesenquimales CD90 y 105 estaban presentes en la mayoría de SC-ASC y Le-V-ASC, pero menos frecuente en Ob-V-ASC. Estos resultados demuestran que no había evidencia de contaminación con células mesenquimales no del linaje de los tejidos adiposos y que SC y Le-V-ASC tenía la expresión de marcadores de superficie celular similar. Ob-V-ASC se observó a tener menos expresión de CD90 y 105, que son característicos de MSC. A continuación, para determinar si SC-ASC y V-ASC a partir de ratones obesos o magras mantienen la misma tasa de crecimiento, se realizaron ensayos de proliferación celular. Magra SC-ASC (Le-SC-ASC) proliferaron más rápidamente que la ASC de otras fuentes (
P Hotel & gt; 0,05, Fig S2).
A, Morfología de las células adherentes que muestra similitud de SC-ASC y ASC-V a partir de ratones obesos y delgados. Barra de escala, 1μm. B, La adipogénesis de SC-ASC y V-ASC. Las células diferenciadas se tiñeron con aceite rojo-O y se cuantificaron por porcentaje de píxeles de aceite de color rojo-O en las imágenes. Las barras de error, SEM. **,
P Hotel & lt; 0,01 (prueba de Mann-Whitney). Barra de escala, 100μm.C, osteogénesis de SC-ASC y V-ASC. Las células diferenciadas se tiñeron con barras de error rojo de alizarina S., SEM. **,
P Hotel & lt; 0,01 (prueba de Mann-Whitney). Barra de escala, 100μm. D, el análisis cuantitativo de RT-PCR de los niveles de mRNA de los genes de Contrastes de la diferenciación de adipocitos y la lipólisis normalizó a la expresión de ARN 18S en ASC indicado al inicio del estudio y 14 días después de la inducción de la adipogénesis. barra de error:. SEM
in vitro
ASC diferenciación
Para determinar si SC-ASC y ASC-V de potencia múltiple ratones muestran obesa o delgada
in vitro
, se realizaron los adipocitos y de linaje osteocitos ensayos de diferenciación como se informó anteriormente (Fig 2B y 2C) [11]. la cuantificación de los adipocitos se basó en Oil Red O tinción de gotas de lípidos después de la inducción de la adipogénesis. SC-ASC forma más gotas de lípidos Oil Red O-positivas que V-ASC. (Figura 2B,
P Hotel & lt; 0,01). La osteogénesis se detectó con el uso de tinción con rojo de alizarina para detectar la fosfatasa alcalina, indicativo de la diferenciación osteoblástica (Fig 2C). La osteogénesis fue más vigoroso para SC-ASC que para V-ASC (
P Hotel & lt; 0,01) con una tendencia hacia la obesidad menoscabar potencial de diferenciación osteogénica. En conjunto, estos hallazgos sugieren que la SC-ASC tienen una mayor potencia múltiple de V-ASC y que son obesos ASC WAT derivados tienen potencial de diferenciación más limitada que la magra ASC WAT-derivada.
Con el fin de determinar si la fuente de tejido y la obesidad programación impactado adipogénica, la expresión de los adipocitos (adipsina, la leptina, GLUT4), la lipólisis (ATGL) y la adipogénesis clave en la regulación del factor de transcripción (PPAR-γ) fueron perfilados en ASC al inicio del estudio y después de 14 días de la inducción de los adipocitos (figura 2D). Se encontró que Le-SC-ASC se sometió a inducción de 30 veces del gen adipogensis de regulación crítico, PPAR-γ después de la inducción de los adipocitos, a diferencia de ASC de otras fuentes. El nivel de PPAR-γ seguía siendo alta después de la diferenciación en el grupo Ob-V-ASC, pero contenía pocas manchas de aceite-rojo-O (Figura 2C). Esto puede ser debido a un aumento de la lipólisis, que se refleja en los niveles más altos de expresión ATGL en Ob-V-ASC. genes de adipocitos incluyendo adipsina, la leptina y GLUT4 se expresaron en niveles mucho más altos en Le-SC-ASC, en consonancia con nuestra observación de que SC-ASC diferenciado más robusta en adipocitos. ATGL gen que regula la lipólisis fue mayor en los obesos ASC derivadas visceral.
in vitro
análisis de ASC y cáncer de ovario co-cultivos
Para determinar si ASC tiene un efecto mitogénico directo en las células malignas, se analizó la proliferación de líneas celulares derivadas de cáncer de ovario y ID8 GI10 C57
ex vivo. células ID8 y IG10 luciferasa-marcadas se co-cultivaron con o sin ASC. la proliferación celular tumoral se controló con el uso de formación de imágenes de la luciferasa. ASC de todas las fuentes tenía un efecto pro-proliferativa modesto sobre ID8 y IG10 células (s3a y S3 B) Fig. Para determinar si ASC afecta el potencial invasivo de células de cáncer de ovario, se realizó un
ex vivo
migración a través de ensayo Boyden Cámara Transwell. ASC de todas las fuentes, en comparación con las células de ovario solo, el aumento de la migración de células de ovario (
P Hotel & lt; 0,01). (Fig S3C y S3D)
células de cáncer de ovario malignos agregada y forma esferoide estructuras -como en fluido de ascitis que puede facilitar la metástasis omental [21]. Hemos informado anteriormente de que el MSC derivadas de médula ósea mejorar la formación de esferoides de cáncer de mama [22]. Cuando ASC fueron cultivadas como esferoides en 100 células sembradas por pocillo sin células tumorales, Ob-V-ASC forma significativamente más esferas que ASC de todas las demás (Figura 3A). Para determinar el efecto de la ASC en la formación de esferoides de cáncer de ovario, y las células ID8 IG10 se cultivaron como esferoides con o sin ASC esferoide-CM. ID8 células formadas significativamente más esferoides en todo ASC-CM-esferoide de células ID8 solos (Figura 3C,
P Hotel & lt; 0,05). IG10 células formaron esferoides significativamente más cuando se cultivan con Ob-V-ASC esferoide-CM (figura 3B y 3D). En resumen, la obesidad y la fuente de tejido parecen afectar a la formación de esferoides ASC, y el apoyo de IG10 esferoides celulares derivadas de cáncer de ovario.
Las células se sembraron a una densidad de 100 células en 100 ul totales en placas de 96 pocillos y se cultivaron durante 14 dias. Las células fueron teñidas con MTT, y esferoides se contaron manualmente. Cada experimento se realizó por triplicado. A, Cuantificación de esferoide ASC en un medio regular. B, La comparación de la formación de esferoides GI10 en varios ASC esferoide-CM. Imágenes representativas muestran un aumento de 10x. Barra de escala, 100μm. C, ensayo de esferoide Cuantificación de ID8 en diferentes ASC esferoide-CM. (Se muestran la media ± SEM, ***,
P Hotel & lt; 0,001, Student
t
prueba, dos de cola.). D, ensayo de esferoide Cuantificación de GI10 en varios ASC esferoide-CM. (Se muestran la media ± SEM, *,
P Hotel & lt; 0,05; **,
P Hotel & lt; 0,01, ***,
P Hotel & lt; 0,001, Estudiante
t
prueba, dos colas).
Efecto de la ASC derivadas WAT obesos y apoyarse en
el crecimiento in vivo Red de cáncer de ovario
Para investigar la
in vivo
efectos de la fuente de tejido y la obesidad en ASC en el cáncer de ovario, ASC fueron co-inyectados con células tumorales que expresan luciferasa ID8 en magra hembra C57BL /6 ratones por vía intraperitoneal (1: 1 ratio, 10
6 /cada uno). El crecimiento tumoral se controló con imágenes de la luciferasa. Se detectaron niveles más altos de actividad de luciferasa en ratones inyectados con Ob-SC-ASC, Le-V-ASC y Ob-V-ASV, en comparación con los ratones inyectados con células ID8 solos (Tabla 1 y Fig 4A-4D). El crecimiento del tumor en ratones inyectados con Le-SC-ASC fue similar al crecimiento del tumor en ratones que recibieron células ID8 solo. Ob-SC-ASC promovió el crecimiento del tumor hizo más de Le-SC-ASC (
P = 0,049
). Ob-SC-ASC y ob-V-ASC tuvieron efectos similares promotores de tumores (
P
= 0,84). Además, los tumores en ratones inyectados con Le-SC-ASC fueron detectados más tarde que eran tumores en ratones inyectados con ASC de otras fuentes (
P
= 0,024, Fig 4C).
ASC eran coinjected con células tumorales ID8 luciferasa que expresan en ratones C57BL /6 por vía intraperitoneal (1: 1 ratio, 10
6 /cada uno). N = 5 por grupo. Una, la comparación de la carga tumoral medida por la expresión de luciferasa en el lado abdominal entre los grupos de Le-SC-ASC Ob-SC-ASC y. barra de error: 90% intervalo de confianza. B, La comparación de la carga tumoral medida por la expresión de luciferasa en el lado abdominal entre los grupos de Le-V-ASC Ob-V-ASC y. barra de error: 90% intervalo de confianza. C, la comparación de la iniciación del tumor entre los grupos. D, la luciferasa medida de señal del lado abdominal en los ratones en el día 46.
Efecto de la ASC en el microambiente tumoral
Para determinar el efecto de la ASC en in vivo proliferación de células tumorales, se cuantificó el número de células Ki-67-positivas dentro de los tumores ID8 con el uso de inmunofluorescencia (Figs 5A y S4). El número de píxeles positivos que representan la frecuencia de células para Ki-67 fue mayor en los tumores ASC inyectado pero no eran diferentes entre los grupos obesos y delgados (Fig 5A y 5B). Los tumores de grupo Ob-SC-ASC contenían ligeramente mayores señales de Ki67 que grupo Ob-V-ASC (P & lt; 0,05) (Fig 5A y 5B). Habíamos demostrado anteriormente que la ASC apoyar la formación de la vasculatura en xenoinjertos de endometrio [11]. Para determinar si estos efectos de ASC en la vascularización del tumor son modificados por la obesidad y la fuente de tejido, secciones de tumor se tiñeron con GSL B4 I-isolectina, que se une específicamente a las células endoteliales (Fig 5A). Vascularización fue mayor en todos los tumores ASC inyectada en comparación con los tumores ID8 a solas con un número significativamente mayor de los buques en los co-inyección de Ob-SC-ASC de Le-V-ASC o Ob-V-ASC (
P
& lt; 0,01, figura 5B)
El análisis de inmunofluorescencia de los tumores recogidos en el día 49 después de los ratones fueron sacrificados..