Extracto
La interleucina-17 (IL-17) es frecuente en el tejido tumoral y suprime las respuestas inmunes anti-tumorales eficaces. Sin embargo, el origen del tumor infiltrante aumento de la IL-17 y su contribución a la progresión tumoral en el cáncer gástrico humano siguen siendo poco conocidos. En este estudio, se incluyó a 112 pacientes con cáncer gástrico, la inmunofluorescencia se utilizó para evaluar la colocalización de CD3, CD4, CD56, CD20, CD68, y triptasa de mastocitos (MCT) con IL-17. La inmunohistoquímica se usa para evaluar la distribución de la densidad de microvasos (CD34), CD66b
+, CD68
+, y FoxP3
+ células en diferentes áreas microanatómicos. Valor pronóstico se determinó mediante análisis de Kaplan-Meier y un modelo de regresión de Cox. Los resultados mostraron que las células cebadas, pero no las células T o macrófagos, eran el tipo celular predominante la producción de IL-17 en el cáncer gástrico. Se detectaron correlaciones positivas significativas entre las densidades de mastocitos derivados de células T reguladoras (Tregs) IL-17 y microvasos, neutrófilos, y. Futhermore, se encontró que la mayoría de las células endoteliales vasculares que expresan interleucina-17 receptor (IL-17R). El análisis de Kaplan-Meier reveló que el aumento de intratumorales infiltrado en los mastocitos y la IL-17
+ células, así como MCT
+ IL-17
+ células, se asociaron significativamente con peor supervivencia global. Estos resultados indican que los mastocitos eran la principal fuente de IL-17 en el cáncer gástrico, y intratumoral IL-17 infiltración pueden haber promovido la progresión tumoral mediante la mejora de la angiogénesis en el microambiente tumoral a través del eje de IL-17 /IL-17R. mastocitos IL-17-positivas mostraron un factor pronóstico en el cáncer gástrico, indicando que la inmunoterapia de orientación mastocitos podría ser una estrategia eficaz para controlar intratumoral IL-17 de infiltración, y, en consecuencia invertir la inmunosupresión en el microambiente tumoral, facilitando la inmunoterapia del cáncer.
Visto: Liu X, Jin H, G Zhang, Lin X, C Chen, Sun J, et al. (2014) Las células intratumoral IL-17-Positivo Los mastocitos son la fuente principal de la IL-17 que es predictivo de la supervivencia en pacientes con cáncer gástrico. PLoS ONE 9 (9): e106834. doi: 10.1371 /journal.pone.0106834
Editor: Xin-Yuan Guan, la Universidad de Hong Kong, China
Recibido: 12 de mayo de 2014; Aceptado: August 1, 2014; Publicado: 8 Septiembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Liu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. XSL fue apoyada por la beca de la Fundación Nacional de Ciencias de China (81273254 /H1006), http://www.nsfc.gov. cn /. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Durante las últimas décadas, se ha prestado cada vez más atención al mecanismo (s) de escapar a la vigilancia inmunológica en el microambiente del tumor y, sobre todo, la relación entre la inflamación y la inmunosupresión. Uno de los componentes más importantes del sistema inmune en la inflamación asociada con el cáncer se ha reconocido recientemente como la interleucina-17 (IL-17). IL-17 tiene funciones pleiotrópicos y múltiples objetivos que en su mayoría han sido exploradas en modelos de ratón, pero cada vez más vinculada a las enfermedades humanas [1] - [5]. IL-17 se ha identificado en varios tumores, incluyendo el cáncer de mama [6], cáncer gástrico [7], [8], el cáncer colorrectal [9], inducidos por carcinógenos cáncer de piel [10], colangiocarcinoma intrahepático [11], y hepatocelular carcinoma [12]. IL-17 de producción de células aumentan gradualmente en número en el microambiente tumoral durante el desarrollo del tumor y se correlacionan con una pobre supervivencia en pacientes relacionadas con el cáncer.
Desde hace tiempo se considera que la principal fuente celular de IL-17 es CD4
+ linfocitos T (células Th17). Recientemente, muchos estudios dirigidos IL-17 han demostrado que la IL-17 de producción no se limita a los linfocitos Th17, pero también se encuentra en una variedad de células inmunitarias adaptativas y innatas, incluyendo las células γδT, células NKT, células NK, mastocitos, y granulocitos [3], [13].
el cáncer gástrico es uno de los cánceres más comunes y una causa principal de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo [14]. Más de 1 millón de nuevos pacientes son diagnosticados con cáncer gástrico cada año en todo el mundo, el 42,5% de los cuales están en China. estrategias terapéuticas tradicionales, incluyendo la cirugía, la quimioterapia y la radioterapia son los principales tratamientos para el cáncer gástrico. Recientemente, la inmunoterapia de los tumores malignos se ha puesto de relieve [15] - [17]. Sin embargo, la inmunosupresión asociada al tumor es un reto importante para la inmunoterapia, porque debilita la actividad citotóxica de las células T y las células asesinas eficaces naturales. Durante el desarrollo de tumores, la inmunosupresión tumor se asocia comúnmente con la inflamación excesiva e incontrolada en el microentorno del tumor [18]. Es bien conocido que las células inflamatorias se infiltran en múltiples tumores, incluyendo los mastocitos, macrófagos, neutrófilos subtipos, así como los linfocitos T y B, un sello del cáncer asociado a la inflamación [19].
En el estudio actual , se examinaron las fuentes celulares de IL-17, la distribución, la relevancia funcional, y el valor predictivo de las células IL-17 productoras en 112 pacientes con cáncer gástrico. Proporcionamos nuevos conocimientos sobre el mecanismo (s) potencial de la IL-17 en el microambiente del tumor en pacientes con cáncer gástrico mediante la evaluación de la relación entre la IL-17 de producción de células y mediadores inflamatorios. Nuestro objetivo es proporcionar más información que pueda ser útil para el diseño de inmunoterapias de cáncer más eficaces que se dirigen a la IL-17.
Materiales y Métodos
Ética declaración
Antes de la investigación , el consentimiento informado se obtuvo de cada paciente. permiso apropiado fue concedida por el comité de ética del Hospital Afiliado En primer lugar, Facultad de Medicina, Universidad de Zhejiang.
Las muestras de pacientes
En total, se inscribieron 112 pacientes entre febrero de 2009 y marzo de 2010 en nuestro hospital . Los pacientes que cumplieron fueron seleccionados los siguientes criterios: a) diagnosticados de cáncer gástrico en base a la patología; b) recibió la resección eficaz. Los criterios de exclusión fueron pacientes que tenían evidencia de metástasis a distancia, evidencia de enfermedad autoinmune concurrente, el VIH o sífilis y los pacientes que recibieron la terapia contra el cáncer antes de la cirugía. Los criterios de resección efectiva se definieron como la resección sin tumor residual (R0) o tumor residual microscópica (R1) de acuerdo con el 7
ª edición de la American Joint del Comité sobre el Cáncer. Después de la resección curativa, los pacientes recibieron quimioterapia adyuvante basado en 5-fluorouracilo y platino de acuerdo con la clasificación TNM patológico. Los pacientes fueron seguidos con un intervalo de 3-6 meses, incluyendo los ensayos de la sangre periférica para marcadores tumorales y la ecografía y la TC con cada 6 meses, el endoscopio cada 12 meses. Características clínicas de los pacientes se muestran en la Tabla 1.
La inmunohistoquímica e inmunofluorescencia
rutina hematoxilina y eosina tinción se realizó para confirmar el diagnóstico patológico, intratumoral región se define como menos de 2 cm bordeando el margen del tumor de estómago, mientras que la región normal se define como al menos 5 cm que bordean el margen del tumor de estómago.
la inmunohistoquímica
la inmunohistoquímica se realizó tal como se describe en nuestro estudio anterior [20 ]. Los anticuerpos primarios fueron de cabra anti-IL-17 (amp I +; D Systems, UK), ratón anti-CD66b (BD Pharmingen, EE.UU.), de ratón anti-CD68 (Abcam, EE.UU.), de ratón anti-FoxP3 (Abcam, EE.UU.), y ratón anti-CD34 (Beijing Zhongshan puente Golden Biotech, china). Para el control negativo, el anticuerpo primario se reemplazó con solución salina tamponada con fosfato (PBS).
inmunofluorescencia
Por inmunofluorescencia, se utilizaron métodos similares, excepto que la actividad de la peroxidasa endógena fue bloqueada y no la Ab primaria utilizada fue una mezcla de anticuerpos. De cabra anti-IL-17 y de cabra anti-IL-17R (ambos de R & amp; D Systems, USA) fueron utilizados para detectado IL-17
+ células y la expresión de IL-17R. Un panel de anticuerpos reactivos con CD3, CD20, CD34, CD56, c-kit (monoclonal de ratón, todos de Beijing Zhongshan puente Golden Biotech, China), CD4 (monoclonal de ratón, Leica, Alemania), monoclonal CD66 (ratón, BD Pharmingen, se han usado EE.UU.), CD68, FoxP3 y triptasa de mastocitos (MCT) (monoclonal de ratón, todos de Abcam, EE.UU.). Después de la incubación durante la noche a 4 ° C, las secciones se sometieron a incubación con una mezcla de anticuerpos secundarios: Alexa Fluor 488/568-conjugado burro anti-ratón o Cy3 /Alexa Fluor 488 conjugado con burro anti-cabra o Alexa Fluor 488 burro anti-conejo ( todos de Invitrogen, EE.UU.) a 37 ° C durante 1 h. Los portaobjetos se montaron con Vectashield que contiene DAPI (Vector Laboratories, EE.UU.) y se visualizaron utilizando un microscopio de imágenes de fluorescencia (Olympus BX51, Japón) acoplado a una cámara CCD (Nikon DS-Ri1). Las imágenes fueron analizados utilizando el software NIS-Elements 3.2 BR.
Los controles negativos, en los que se usó PBS en lugar de los anticuerpos primarios, se incluyeron para cada marcador.
La cuantificación de parámetros de inmunotinción
Los datos se obtuvieron mediante recuento manual de células con tinción positiva en 10 campos representativos de regiones normales y intratumorales por debajo de 400 × magnificación de alta potencia. Específicamente, se identificaron las células endoteliales vasculares o grupos de células manchadas marrones como microvasos sólo si tenían límites claros con las estructuras adyacentes [21]. Las densidades se determinaron mediante el cálculo de la media del número de células teñidas positivamente por campo microscópico de alta potencia (HPF). Doble tinción se determinó por recuento manual de las células positivas en 10 campos de alta potencia; Se calcularon las proporciones de células por marcador de superficie IL-17 que expresan. Todos los análisis se realizaron por dos observadores independientes, ciegos (GE Z y XK L), y los recuentos promedio de los dos observadores se utilizaron en el siguiente análisis.
El análisis estadístico
Los valores de la mediana de CD34
+, CD66b
+, CD68
+, FoxP3
+, y la triptasa de los mastocitos (MCT
+) e IL-17 fueron utilizados
+ células como corte offs para definir los subgrupos en nuestros resultados. t de Student pruebas se utilizaron para comparar la infiltración de diferentes subconjuntos de células inmunes en el tejido tumoral y el tejido normal correspondiente. Se utilizó la prueba de chi-cuadrado para evaluar la relación entre la IL-17 de producción de células y características clínico-patológicas. Las correlaciones entre la densidad microvascular (CD34), neutrófilos (CD66b), macrófagos (CD68), células T reguladoras (FoxP3), y células IL-17 productoras se evaluaron utilizando el coeficiente de correlación de Pearson o Spearman de. La supervivencia global se define como el intervalo entre la fecha de la cirugía y la fecha de la muerte o el último seguimiento, lo que ocurra antes. estimaciones de la función de supervivencia se calcularon utilizando el método de Kaplan-Meier. Una de riesgos proporcionales de Cox modelo se utilizó para evaluar el efecto de las células sobre la supervivencia global de IL-17 que producen. Una de dos caras valor de p & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando GraphPad Prism (versión 5.00 para Windows;. GraphPad Software, San Diego, CA, EE.UU.) y el SPSS., Software (versión 16.0. SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.)
resultados
Estudio de la población
características de los pacientes se muestran en la Tabla 1. en total, 78 varones y 34 mujeres se inscribieron. La edad de la población del estudio varió de 33 a 89 (mediana) 60 años. De los 112 pacientes con cáncer gástrico, el estado de infección por H. pylori fue positivo para 65 pacientes, mientras que el 47 fue negativo. 110 pacientes recibieron resección R0 y 2 pacientes recibieron resección R1. clasificación TNM patológico se basaron en los 7
ª edición de la American Joint del Comité sobre el Cáncer: 33 pacientes no tenían metástasis en los ganglios linfáticos, mientras que 21 eran N1, N2 22 eran, y 36 eran N3. 1 paciente pertenecía a Tis, 23 pacientes pertenecían a la etapa I, y 25, 63 pacientes a las etapas II, III, respectivamente. 3 (2,7%) de los pacientes perdidos durante el seguimiento y 39 (34,8%) pacientes murieron durante el período de observación. La mediana de seguimiento fue de 51 meses, que van desde 39 a 57 meses y las tasas de supervivencia global (SG) fueron 83,0% a 1 año, el 71,4% a los 3 años y el 65,7% a los 4 años, respectivamente
. IL-17 se expresa predominantemente por MCT
mastocitos +
muestras al azar de 20 pacientes de la cohorte completa se utilizaron para evaluar la distribución y el fenotipo de las células-17 productoras de IL en la región intratumoral y el correspondiente tejidos normales (fig.1). Encontramos citoplasmático de IL-17 de tinción en células con un fenotipo ovoide, tal como se describe anteriormente [13], y en las células de una forma más irregular. Además, hemos encontrado que las células IL-17 que expresan fueron más frecuentes en los tejidos intratumorales que los tejidos normales. Para identificar los IL-17
+ células en los tejidos intratumorales, hemos realizado experimentos de colocalización y se calculó la proporción de IL-17
+ células en cada subgrupo. En primer lugar, se realizó la colocalización de c-kit, un marcador de células mástil adicional, con la triptasa de mastocitos (MCT), los resultados mostraron que todos MCT
+ células que expresan c-kit (Fig. S1), indicando que MCT podría ser utilizado para mastocitos identificados de forma representativa. En las células del fenotipo ovoide, se seleccionaron una serie de células T, células B y NK marcadores de células: en concreto, CD3, CD4, CD20, CD56 y, y se evaluó su colocalización con IL-17. Sin embargo, se identificaron CD20
+ IL-17
+ y CD56
+ IL-17
+ células, aunque raramente (& lt; 1%; la Figura 2, paneles superior derecha). Se observaron Aunque de vez en cuando CD3
+ IL-17
+ y CD4
+ IL-17
+ células, los porcentajes medios de IL-17
+ células en ambos subgrupos fueron 12,4% ( 2,2 a 34,1%) y 8,4% (0-26,7%; la figura 2, paneles superiores de la izquierda; Tabla 2) a continuación se investigó el fenotipo de la IL-17
+ células de forma irregular; macrófagos se han sugerido como posibles fuentes de producción de IL-17 [22]. En consonancia con esto, hasta el 18,5% de las células IL-17 que producen en los tejidos de cáncer gástrico fueron los macrófagos (Figura 2, panel inferior izquierdo; Tabla 2). Sin embargo, la mayoría de las células IL-17-producir permaneció sin identificar. Para determinar si los mastocitos eran una fuente adicional de la producción de IL-17 en el cáncer gástrico, se realizó colocalización de IL-17 y la triptasa de mastocitos (MCT). Se encontró que la mayoría de la IL-17
+ células colocalized con MCT
+ células. (40-60% de la IL-17
+ células; la figura 2, panel inferior derecho; Tabla 2)
Los cuadrados indican los diferentes ejemplos (de color marrón, que se muestran en 400 × magnificación).
Las secciones se counterstained con DAPI. Marcadores de células CD3 o CD4 (verde) y CD20 marcador de células B (verde), la naturaleza killer (NK) marcador CD56 (verde) y CD68 macrófagos marcador (naranja), así como la triptasa de los mastocitos (MCT) (naranja) se muestran en la 400 × aumentos.
Distribución de MCT
+ IL-17
+ células y correlación con las características clínico-patológicas
Para confirmar que derivados de células del mástil IL-17 era una importante fuente celular de IL-17 en el microambiente del cáncer gástrico, se realizó inmunofluorescencia doble tinción de intratumoral y los tejidos normales de muestra a partir de los 112 pacientes. La mayoría de la IL-17
+ células doble teñidas fuertemente con MCT (14 a 68,1% de la IL-17 células que expresan) en los tejidos intratumorales (Fig. 3A). Se encontró que se encontraron las densidades de MCT
+ células cebadas y la IL-17
+ células en los tejidos intratumorales ser significativamente mayor que en los tejidos normales (MCT
+
T vs. MCT
+
N, 10,02 ± 4,06 vs. 8,66 ± 3,29, p = 0,0023; IL-17
+
T frente a IL-17
+
N, 8,16 ± 3,89 vs. 7,18 ± 3,48, p = 0,0165; Fig. 3B). Por otra parte, la densidad de MCT
+ IL-17
+ células en tejidos intratumorales fue significativamente más alta que en los tejidos normales (4,55 ± 2,48 vs. 3,93 ± 2,24, p = 0,0154; Fig. 3B).
A. Los mastocitos altamente expresa IL-17 en el cáncer gástrico (fusionada en el panel amarillo, derecha). B. MCT
+ células y 17-IL
+ células, así como MCT
+ IL-17
+ células en los tejidos intratumorales fueron significativas superiores a los de los tejidos normales correspondientes.
Para identificar asociaciones significativas entre las características clínico-patológicos y MCT
+ IL-17
+ células, se utilizó la prueba de chi-cuadrado o la prueba exacta de Fisher (que se muestran en la Tabla 1). Sin embargo, MCT
+ IL-17
+ células en los tejidos intratumorales no se correlacionaron con las características clínicas evaluadas, incluyendo H. pylori estado de infección, el tamaño del tumor, grado de diferenciación y clasificación de TNM.
Aumento intratumoral MCT
+ células, IL-17
+ celular, y MCT
+ IL-17
+ densidades celulares se correlacionaron con la supervivencia global pobres
en el análisis univariado (Tabla 3), el clínico-patológico convencional cuenta con predictivo de mala supervivencia global (SG) fueron los tumores poco diferenciados, y el estadio TNM avanzada. Para un análisis más detallado, números de MCT
+ células, IL-17
+ células, y MCT
+ IL-17
+ células se dividieron en dos grupos: por encima y por debajo de los valores medios. las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier se prepararon utilizando la prueba de log-rank para investigar más a fondo la asociación con el sistema operativo. Los pacientes con un alto número de intratumoral infiltran MCT
+ células y-17 IL
+ células tuvieron una SG más pobres que aquellos con un menor número de MCT
+ células (p = 0,004) y la IL-17
células + (p = 0,014, Fig. 4B). Además, los pacientes con un mayor número de MCT
+ IL-17
+ células tenían una duración más corta de supervivencia que aquellos con un menor número de MCT
+ IL-17
+ células (p = 0,018, Fig. 4C).
(a) La supervivencia global para todos inscrito 112 pacientes (B) de alta intratumoral IL-17
+ células infiltración confiere un alto riesgo significativo de muerte. (C) Los pacientes con alta MCT
+ IL-17
+ células intratumoral tenía una peor supervivencia significativa que los pacientes con bajas de TCM
+ IL-17
+ celular.
Las variables de P & lt; 0,1 en el análisis univariado fueron incluidos en un multivariante de Cox análisis de riesgos proporcionales, se encontró que tanto las células intratumorales MCT-positivos (HR = 2,057; IC del 95%: 1,048-4,037; p = 0,036) y TNM etapa (HR = 3,832; IC del 95%: 1,679-8,745; p = 0,001) fueron factores pronósticos independientes (Tabla 3). Lo que indica que los pacientes con un mayor número de células positivas MCT-intratumorales fueron casi 2,1 veces más probabilidades de morir que aquellos con un menor número de estas células.
características inmunohistoquímicas y la asociación entre los TCM
+ IL-17
+ densidad celular y las variables inmunoquímicos
IL-17 es un factor pro-inflamatoria conocida, que puede promover el crecimiento del tumor mediante el fomento de la angiogénesis y neutrófilos de reclutamiento, así como el reclutamiento de otros tipos de células inflamatorias e inmunes. Para explorar el mecanismo potencial (s) de acumulación de IL-17 en el microambiente del tumor con un mal pronóstico. Se realizó inmunohistoquímica para diversos mediadores de la inflamación, especialmente, la densidad de los microvasos, neutrófilos, macrófagos y las células T reguladoras en toda la población de estudio (
n
= 112). campos representativos de CD34
+ microvasos, CD66b
+ neutrófilos, CD68
+ macrófagos, y FoxP3
+ linfocitos T reguladores en intratumoral y el tejido normal se muestran en la Fig. 5A. Las densidades de intratumorales CD34
+ microvasos (p = 0,0030), CD66b
+ neutrófilos (p & lt; 0,0001), CD68
+ macrófagos (p & lt; 0,0001) y FoxP3
+ linfocitos T reguladores (p & lt ; 0,0001) fueron significativamente superiores a los de los tejidos normales (figura 5B)
a... campos representativos de CD34
+ microvasos (A1), CD66b
+ neutrófilos (A2), CD68
+ macrófagos (A3) y FoxP3
+ linfocitos T reguladores (A4) en intratumoral y el tejido normal ( marrón, que se muestra a 400 aumentos). número de células B. absolutos de CD34
+ microvasos (B1), CD66b
+ neutrófilos (B2), CD68
+ macrófagos (B3) y FoxP3
+ linfocitos (B4) por campo de gran aumento en intratumoral y el tejido normal fueron analizados. Las líneas horizontales representan la media ± error estándar de valor del grupo. Los valores de p se calcularon mediante la prueba t de muestras pareadas para CD34
+ microvasos y FoxP3
+ linfocitos, mientras que se utilizó el test Hombre-Whitney para CD66b
+ neutrófilos y CD68 análisis
+ macrófagos.
a continuación, se analizó la correlación entre MVD intratumoral, la densidad de neutrófilos, macrófagos densidad, densidad de las células T reguladoras, y la densidad de IL-17
+, en particular MCT
+ IL-17
+ células. Los resultados mostraron una correlación significativa entre MVD y la IL-17
+ células (r = 0,4040, p = 0,0001), aunque significativos, pero débil, no se encontraron correlaciones entre la IL-17
+ células y neutrófilos (r = 0,2135, p = 0,0238) y células t reguladoras (r = 0,2963, p = 0,0017) (datos no mostrados). Sin embargo, además se analizó la correlación entre los TCM
+ IL-17
+ células y los mediadores de la inflamación. Se encontró una correlación significativa entre los TCM fuerte
+ IL-17
+ células y MVD (r = 0,4396, p & lt; 0,0001). Sin embargo, las correlaciones entre MCT
+ IL-17
+ células y neutrófilos (r = 0,2578, p = 0,0061) y células T reguladoras (r = 0,2898, p = 0,0021) fueron similares a la de IL-17
+ células (como se muestra en la figura 6).
(a) CD34
+ densidad microvascular. (B) CD66b
+ neutrófilos. (C) CD68
+ macrófagos. (D) FoxP3
+ linfocitos. Los valores de p se determinaron mediante el coeficiente de correlación de Pearson para CD34
+ microvasos y FoxP3
+ linfocitos, mientras que se utilizó el coeficiente de correlación de Spearman para CD66b
+ neutrófilos CD68 y análisis
+ macrófagos.
colocalización entre IL-17R y diversas células inflamatorias e inmunes
con el fin de explorar el mecanismo (s) en virtud de la relación estrechamente entre las células productoras de IL-17 y MVD, así como otra inflamatoria e inmune Células. Hemos realizado experimentos de colocalización para evaluar la expresión de IL-17R en vasculares células endoteliales, neutrófilos, macrófagos y células T reguladoras (seleccionados al azar, n = 20). Nuestros resultados mostraron que la mayoría de las células endoteliales vasculares que expresan IL-17R (6-58% de las células endoteliales vasculares; Fig.7) en los tejidos intratumorales. De acuerdo con nuestra hipótesis, apenas se detectaron neutrófilos y células T reguladoras que expresan IL-17R. Curiosamente, encontramos la expresión de IL-17R en la superficie de las células tumorales. (Fig. S2).
Discusión
escape inmune juega un papel clave en la génesis y desarrollo del cáncer. Los mediadores y efectores celulares del sistema inmune son componentes importantes de un entorno tumoral inmunosupresor. El papel de la interleucina-17, como un factor pro-inflamatoria, ha atraído la atención recientemente en el cáncer, enfermedades autoinmunes, y enfermedades de inmunodeficiencia. CD4
+ células Th17 fueron siempre piensa que es la única fuente celular de IL-17 en el microambiente tumoral humana [23]. Sin embargo, cada vez más pruebas ha demostrado que diversos tipos de células pueden producir IL-17 [3], [24]. Los mastocitos, un importante componente celular del sistema inmune innato, se han reconocido como un importante fuente celular de IL-17. De hecho, se pueden producir y /o secretar una variedad de citocinas y quimiocinas que contribuyen a la defensa y la inflamación inmune, incluyendo el reclutamiento de leucocitos y la proliferación celular vascular. Recientemente, se ha demostrado que los mastocitos se infiltran en el microambiente tumoral a través de la vía de señalización SCF /c-kit, que conduce a la exacerbación de la inflamación y la inmunosupresión [25]. Mástil de células derivadas de IL-17 se ha investigado en varias enfermedades autoinmunes, como la artritis reumatoide [13], psoriasis [26], y espondiloartritis [27], en el que mastocitos eran una fuente celular principal de IL-17, y mostró una fuerte correlación con la patogénesis y la progresión de la enfermedad. Sin embargo, la fuente de la mayor nivel de IL-17 infiltrantes de tumor y la contribución a la progresión del tumor, así como el mecanismo (s) subyacente, se mantuvo poco conocidos.
En este estudio, se observó que las células IL-17 que expresan en muestras de cáncer gástrico humano exhibieron dos fenotipos. Algunos tenían un fenotipo relativamente regular, formas ovoides /plasmocitoide, pero algunos tenían formas más irregulares. Además, encontramos que la IL-17
+ linfocitos representaban sólo ~ 10% de las células IL-17 que expresan, en contraste con estudios previos en microambientes de tumores humanos [7], [23]. Recientemente, Bo Wang et al. [28] encontró que los mastocitos, pero no las células T o macrófagos, eran el tipo predominante que expresa IL-17 en tejidos de carcinoma de células escamosas de esófago. Curiosamente, también se encontró que la mayoría de IL-17
+ células colocalized con MCT
+ células (14 a 68,1% de 17-IL
+ células), lo que indica que los mastocitos eran la fuente celular predominante de IL-17 en los cánceres gástricos humanos. Varios estudios han demostrado que la IL-17 afecta la vigilancia inmune y promueve la angiogénesis y la carcinogénesis en los tumores [1], [29], lo que sugiere que el entorno de inflamación impulsado por los niveles de IL-17 endógena puede contribuir a la progresión del tumor. Nuestros hallazgos sugieren que el nivel de las células IL-17 que expresan fue mayor en muestras de tejido tumoral que las correspondientes muestras de tejido normal y que derivados de mastocitos IL-17 fue más abundante en cánceres gástricos humanos. El análisis de Kaplan-Meier reveló que intratumorales IL-17
+ células y MCT intratumoral
+ IL-17
+ células se correlacionó con una peor supervivencia en pacientes con cáncer gástrico humano.
El mecanismo preciso (s) subyacente a la asociación entre el aumento de los niveles de IL-17 en la progresión microambiente del tumor y el tumor (s) permanecen poco claros. Un estudio informó que la IL-17 a promover el desarrollo de tumores a través del reclutamiento de células mieloides supresoras derivadas (MDSCs), tales como CD11b
+ Gr1
+ células, al ambiente del tumor [30]. Mientras tanto, varios estudios han demostrado que la IL-17 puede mejorar el crecimiento de células endoteliales vasculares e influir en el progreso angiogénico mediante el aumento de la secreción de citoquinas, tales como TNF-α, IL-8, y VEGF [29], [31], incluyendo un estudio que informó red paracrina mediada por IL-17 promueve la resistencia tumor a la terapia anti-angiogénica [32]. En consonancia con esto, nuestros resultados indican una correlación significativa entre MVD y la IL-17
+ células. Ha sido bien establecido que los mastocitos podrían estimular la proliferación vascular [33], en nuestro estudio, hemos encontrado una correlación más significativa entre MVD y MCT
+ IL-17
+ células, lo que demuestra que se trata de IL-17 de producción mastocitos tienen un efecto más fuerte en la promoción de la angiogénesis. Además, se encontró que la mayoría de las células endoteliales vasculares que expresan IL-17R, más interesante, encontramos que las células de cáncer gástrico fueron positivas para IL-17R. Estudios previos han informado de que la expresión de IL-17R se asocia con la malignidad del tumor [34], [35]. La combinación de estos resultados, IL-17 infiltración puede haber promovido la progresión tumoral mediante la mejora de la angiogénesis en el microambiente tumoral a través del eje de IL-17 /IL-17R, la función en las células endoteliales vasculares y células tumorales. Otro posible mecanismo se encuentra en el reclutamiento de células inflamatorias de IL-17, tales como neutrófilos y macrófagos. Se ha demostrado que la IL-17 promueve la progresión tumoral a través de efectos directos sobre el reclutamiento de neutrófilos [36], [37]. En nuestro estudio, intratumoral IL-17
+ células y MCT
+ IL-17
+ células ambos mostraron correlaciones débiles, pero significativos, con el número de neutrófilos intratumorales, mientras que los macrófagos intratumorales mostraron ninguna importancia. Aunque, apenas se encontraron neutrófilos que expresan IL-17R. Mástil derivados de la IL-17 podría jugar un papel clave en el reclutamiento de neutrófilos por quimiocinas CXC, como CCL2, tal como se describe anteriormente [38]. La evidencia de diversos tipos de cáncer demuestra que la proporción de células T reguladoras (Tregs) se aumenta en el tejido tumoral en pacientes con múltiples tumores malignos [39], [40]. Se ha informado de que Tregs reclutamiento tenía un papel clave en el establecimiento de un microambiente tumoral VEGF-rico y el aumento de la angiogénesis del tumor [41]. estudio previo ha informado de la función reguladora de los mastocitos en que interactúan con CD4 convencional
+ células T para generar IL-10 la producción de células T reguladoras por el eje de ICOSL /ICOS [42]. Ganeshan et al. [43] informó de que las células T reguladoras en realidad mejorar, en lugar de inhibir, la producción de células cebadas de la IL-6, una citoquina pleiotrópica, que se ha demostrado que desempeñan un papel fundamental en la regulación del equilibrio entre las células IL-17-productoras y FoxP3
+ las células T reguladoras. Por lo tanto, pueden existir correlaciones intensas entre células T reguladoras e IL-17 que producen las células cebadas. En nuestro estudio, la correlación entre la IL-17
+ células Treg y era débil, pero significativa, así como el MCT
+ IL-17
+ células. Estos resultados demostraron que la IL-17 de producción de los mastocitos podría inducir la diferenciación y la acumulación de células T reguladoras secretando varios de citocinas y quimiocinas, que deben ser estudiada posteriormente.
Para nuestro conocimiento, este es el primer informe de la fenotipo y distribución de intratumorales células IL-17-producir y su relevancia clínica, y en particular el valor pronóstico de derivado de células intratumoral mástil IL-17 en el cáncer gástrico. Nuestros datos demuestran que la mayoría de las células IL-17 fueron productoras de mastocitos, mientras que la IL-17
+ linfocitos eran raros. Por otra parte, se encontró que intratumorales IL-17
+ células y MCT intratumoral
+ IL-17
+ células se correlacionaron con una peor supervivencia. Sin embargo, el mecanismo (s) de la infiltración de mastocitos en el microambiente tumoral y el mecanismo específico entre la sobreexpresión de IL-17 y las células inflamatorias e inmunes siguen siendo en gran medida desconocido. Además, la función distintiva de almacenado y aún necesitaba secretora de IL-17 que se ilustra. Por lo tanto, los estudios prospectivos que se centran en la contratación de los mastocitos y la producción de IL-17 en el microambiente del tumor de estómago son necesarios para evaluar el valor predictivo de más.
Apoyo a la figura Información hotels, IL-17 derivada de mastocitos intratumoral S1.
colocalización entre c-kit y triptasa de mastocitos (MCT)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0106834.s001 gratis (TIF)
figura S2.
colocalización entre la IL-17R (verde) y los neutrófilos, macrófagos, células T reguladoras (naranja): perfil del DOI:. 10.1371 /journal.pone.0106834.s002 gratis (TIF)
Reconocimientos
agradecemos a Lin Zhou, Haiyang Xie y Xiaowen Feng en el Laboratorio clave de la generación combinada de múltiples trasplante de órganos, Ministerio de Salud Pública, primer hospital Afiliado de la Facultad de Medicina de la Universidad de Zhejiang de apoyo técnico para inmunohistoquímica e inmunofluorescencia.