Extracto
Objetivos
El tejido adiposo contiene una población de células madre adiposas multipotentes (ASC) que forma el estroma tumoral y puede promover la progresión tumoral. Dada la alta tasa de metástasis del cáncer de ovario a la adiposo omental, la hipótesis de que la ASC-omental derivada puede contribuir al crecimiento de cáncer de ovario y difusión.
Materiales y Métodos
aislado ASC del epiplón de tres pacientes con cáncer de ovario, con (O-ASC4, O-ASC5) y sin (O-ASC1) la metástasis del epiplón. BM-MSC, SQ-ASC, O-ASC se caracterizaron con arrays de expresión génica y análisis metabólico. Del estroma ovárico efectos sobre las células de proliferación células cancerosas, la quimio-resistencia y resistencia a la radiación se evaluó usando ensayos de co-cultivo con líneas celulares de cáncer de ovario humano marcado con luciferasa. Transwell ensayos de migración se realizaron con medios condicionados a partir de O-ASC y líneas celulares de control. Las células fueron inyectadas SKOV3 intraperitionally con o sin junta ASC1 para realizar un seguimiento
in vivo
injerto.
Resultados
O-ASC promovió significativamente
en
in vitro
la proliferación, la migración y la quimioterapia respuesta a la radiación de líneas celulares de cáncer de ovario. O-ASC4 había más efectos sobre la migración y la quimioterapia en respuesta OVCA 429 y 433 células que OVCA O-ASC1 marcada. El análisis de datos de microarrays revelado que O-ASC4 y O-ASC5 tienen perfiles de expresión génica similares, en contraste con O-ASC1, que era más similar a BM-MSC y ASC subcutáneos en la agrupación jerárquica. O-ASC Humanos se detectaron en el estroma de xenoinjertos murinos de cáncer de ovario humano, pero no los ovarios no involucrados.
Conclusiones
ASC derivadas del epiplón humano puede promover el cáncer de ovario proliferación, la migración, la quimio-resistencia y resistencia a la radiación
in vitro
. Por otra parte, clínica O-ASC aísla demostrar los efectos heterogéneos sobre el cáncer de ovario
in vitro
Visto:. Nowicka A, Marini FC, Solley TN, Elizondo PB, Zhang Y, Sharp HJ, et Alabama. (2013) de origen humano Omental células madre adiposas Aumentar cáncer ovárico proliferación, migración y quimiorresistencia. PLoS ONE 8 (12): e81859. doi: 10.1371 /journal.pone.0081859
Editor: Pranela Rameshwar, Rutgers - Escuela de Medicina de Nueva Jersey, Estados Unidos de América
Recibido: 9 Agosto, 2013; Aceptado: 16 de octubre de 2013; Publicado: Diciembre 2, 2013
Derechos de Autor © 2013 Nowicka et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de investigación de la Universidad de Texas MDAnderson Centro del cáncer del NCI Programas especializados de investigación de Excelencia (SPORE) en el Premio de investigación del Desarrollo del cáncer de Ovario (DRP) (Grant No. CA83639) [http://www.mdanderson.org/Departments/ovarianspore /] y las subvenciones R01CA133057 de los Institutos nacionales de Salud [www.nih.gov]. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Tenga en cuenta que un co-autor, PBE, se emplea actualmente en Asuragen Inc. en Austin, Texas. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
El cáncer de ovario es el cáncer ginecológico más letal, dando como resultado 16.000 muertes por año en el Estados Unidos [1]. La mortalidad y la morbilidad del cáncer de ovario es debido a una alta tasa de difusión intraperitoneal y el desarrollo de tumores resistentes a la quimioterapia a pesar de la enfermedad inicialmente responder a la quimioterapia.
difusión intraperitoneal de cáncer de ovario con frecuencia resulta en la formación de metástasis en el epiplón, el tejido graso bien vascularizado e inervado que se encuentra sobre el intestino. La razón por la cual el epiplón es el "suelo" preferible que las células del cáncer de ovario metastásico sigue siendo desconocido. La respuesta de la metástasis del cáncer de ovario en el epiplón a la quimioterapia es un predictor independiente de la mortalidad por cáncer de ovario, lo que sugiere que las interacciones entre el cáncer de ovario y el microambiente de epiplón son un importante motor de la evolución clínica [2].
La hipótesis que el epiplón es un entorno hospitalario para la formación de la metástasis del cáncer de ovario, debido a una población de células madre mesenquimales trópico tumorales en el tejido adiposo omental. Recientemente, hemos caracterizado una población de células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo multi-potentes del epiplón (O-ASC) de dos pacientes con enfermedad omental y otro sin él. Cada aislado se confirmó que poseen potencial de diferenciación de múltiples potente como se espera de MSC. ASC se asemejan a las células derivadas de la médula ósea madre mesenquimales (MSC) BM-que tienen la capacidad de migrar en los tumores y puede haber demostrado promover la iniciación del tumor, el crecimiento, la vascularización, la metástasis, y la resistencia a la quimioterapia en muchos modelos de tumores [3-6 ]. Se investigaron los efectos de la O-ASC de pacientes con y sin metástasis de epiplón en líneas celulares de cáncer de ovario.
Materiales y Métodos
Las líneas celulares
Las líneas celulares de carcinoma de ovario humanos OVCA 429, OVCA 433 y A2780 se obtuvieron del Dr. Samuel C. Mok (La Universidad de Texas MD Anderson Center, Houston, TX). OVCA 429 y Ovča líneas celulares 433 se establecieron líneas celulares derivadas de pacientes con la fase tardía de adenocarcinomas de ovario seroso, como se describe por Bast et al [7]. Las líneas celulares de carcinoma de ovario humano SKOV3 y A2780 y humano BM-MSC se obtuvieron de American Type Culture Collection (Manassas, VA). Todas las líneas celulares se mantuvieron en DMEM (Mediatech, Inc., Manassas, VA) que contenía suero bovino fetal al 10% (FBS) (Hyclone, Logan, UT) y 1% de penicilina y estreptomicina (Mediatech, Manassas, VA) a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO2.
Humano O-ASC y SQ-ASC aislamiento
Bajo El protocolo aprobado por la Junta de Revisión Institucional MD Anderson, evidentemente normal que aparece epiplón humano y el tejido adiposo subcutáneo se obtuvieron durante los procedimientos de estadificación de los pacientes con cáncer de ovario. El consentimiento informado para los bancos de tejidos se obtuvo de cada paciente. Toda la investigación clínica se ha llevado a cabo a través de los principios expresados en la Declaración de Helinski. Se obtuvo consentimiento escrito de cada paciente. O-ASC y SQ-ASC se aislaron de acuerdo con los protocolos publicados previamente [8]. O-ASC1 se aisló de una (índice de masa corporal (IMC) = 25,2 kg /m
2) paciente con adenocarcinoma endometriod recurrente del endometrio y ovario sin metástasis omental. O-ASC4 y O-ASC5 se aislaron a partir de pacientes con cáncer de ovario seroso de alto grado con la participación de epiplón. El índice de masa corporal de pacientes de los que se derivaron O-ASC4 y 5 fueron de 32,4 kg /m
2 y 22 kg /m
2, respectivamente. O-ASC5 se utilizó para la matriz de la expresión génica y la expresión de marcadores de superficie celular, pero se perdió después de pases seriados
in vitro
y por lo tanto podría no utilizado en ensayos funcionales. El aislado O-ASC y SQ-ASC se cultivaron en medio α-MEM (Mediatech, Manassas, VA) con 20% de FBS (Hyclone, Logan, UT) y 1% penicilina estreptomicina, y L-glutamina (Mediatech, Manassas, VA ).
línea de O-ASC caracterización
Después del aislamiento, se ampliaron las células
in vitro
en un medio α-MEM (Mediatech, Manassas, VA). la expresión de marcadores de superficie celular se caracterizó por análisis de citometría de flujo. O-ASC se caracterizaron en el pase temprano (máximo 5) utilizando anticuerpos específicos para los siguientes marcadores: CD11b, CD29, CD34, CD44, CD45, CD 90, EpCAM (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) y CD105 (BioLegend, San Diego, CA).
Para confirmar el potencial adipogénico de O-ASC y BM-MSC, que se incubaron 10
5 células en medio de inducción adipogénico (medio DMEM con 10% de SFB, 45 g /l de glucosa, L-glutamina, 1% de penicilina y estreptomicina, 10 mg /ml de insulina, 500 mM 3-isobutil-1-metilxantina, 1 mM de dexametasona, y 200 M indometacina). Después de 72 horas, el medio de mantenimiento (DMEM Mediatech, Manassas, VA) con 10% de SFB, 45 g /L de glucosa, L-glutamina, 10 mg /ml de insulina, 1% de penicilina y estreptomicina) se añadió a las células. El medio de mantenimiento se cambió de 2 veces por semana durante 10 días de incubación. En los momentos indicados, se realizó un aceite rojo O (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) tinción histoquímica de las inclusiones citoplasmáticas de lípidos neutros de adipocitos funcionales.
osteoblásticas diferenciación O-ASC y BM-MSC fue efectúa utilizando 5 x 10
4 células. Después de 3 semanas de incubación en medio de inducción de osteoblastos (medio OsteoDiff NH, Bergisch Gladbach, Miltenyi Biotec GmbH, Alemania), los depósitos de calcio extracelular se tiñeron utilizando rojo de alizarina S (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).
confirmó la células potencial condrogénica utilizando 10
6 células, que se incubaron en 2 ml de medio de condrogénica (medio DMEM con 45 g /L de glucosa, L-glutamina, 1% de penicilina y estreptomicina, 50 g de ácido ascórbico /ml, 100 nM de dexametasona, y 10 ng /ml factor de crecimiento transformante β). El medio se cambió tres veces por semana. Después de 21 días, se recogieron las células, se incluyeron en parafina, y se tiñeron con 1% Azul de Alcian (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) en ácido acético al 5%. El color azul de la imagen representa depósitos de proteoglicanos sulfatados que son indicativos de condrocitos funcionales.
ensayo de expresión humana Nimblegen HG18
extracción de ARNm para O-ASC1, O-ASC4, O-ASC5, subcutánea ASC (SQ-ASC), y BM-MSC se llevó a cabo usando el kit Qiagen RNeasy Mini (Qiagen, Valencia, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Nimblegen (Madison, WI) HG18 72 k microarrays que contienen 72.000 oligonucleótidos largos (60-mer) que tejen el genoma humano se utilizaron para la matriz de perfiles de expresión génica. Perfiles de expresión génica se realizó un mínimo de dos veces para cada líneas celulares. Microarray imágenes fueron procesadas en NimbleScan v2.3 (Nimblegen, Madison, WI). La normalización se realizó utilizando el algoritmo robusto análisis de múltiples matrices con la configuración predeterminada.
Expresión software de análisis
Para realizar el análisis de conglomerados de la muestra y análisis de la expresión de los genes de perfiles, la matriz BRB Herramientas Versión 4.2. se ha usado 1 (Richard Simon y Amy Peng Lam, Instituto Nacional del cáncer, Bethesda, MD). Las muestras se agruparon utilizando la agrupación jerárquica sin supervisión con la configuración predeterminada. Las comparaciones por clase utilizando un univariante
t-test
con un modelo de variación aleatoria en la RMA se utilizaron (robusta gama Multi-Media) normalizado de datos para identificar los genes que son expresados diferencialmente de manera significativa. Un nivel de significación de p = 0.001 fue designado para cada prueba univariado.
ensayos metabólicos
Las células se cultivaron en placas a 50.000 células por pocillo en placas de 12 pocillos durante 48 horas. Los sobrenadantes se recogieron para análisis y sedimentos celulares metabólicos extracelulares se lisaron con tampón RIPA para el análisis de proteínas. El consumo de glucosa se evaluó mediante el kit de glucosa Wako y los ensayos se realizaron según el protocolo del fabricante. Los sobrenadantes celulares se añadieron a una placa de 96 pocillos lleno de reactivo de glucosa Wako reconstituido (Wako Chemicals, Richmond, VA). A continuación, la placa se incubó a 37 ° C y se agitó al mismo tiempo. La absorbancia se detectó a 505 nm y 600 nm mediante un espectrofotómetro (SpectraMax
® M5; Molecular Devices) para medir el contenido de glucosa de las muestras. Los resultados se expresaron en mol /mg de proteína [9].
El contenido de lactato de las muestras se midieron por Kit lactato Trinidad según el protocolo del fabricante. Brevemente, las células se diluyeron sobrenadantes 1:10 en PBS y se añadieron las muestras y después se diluyó a placa de 96 pocillos llenos de reactivo reconstituido lactato Trinidad. La placa de 96 pocillos preparada se protege de la luz y se incuba a 37 ° C durante una hora. La absorbancia se detectó a 540 nm con un espectrofotómetro (SpectraMax
® M5; Molecular Devices) para medir el contenido de lactato de las muestras. ensayo de piruvato nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) la cuantificación colorimétrica involucrados. La lactato deshidrogenasa (LDH) cataliza la conversión del piruvato en lactato con el gasto de NADH. En pocas palabras, la solución de NADH se preparó disolviendo NADH (Sigma Aldrich) en una solución de Tris (pH = 7,0). La lactato deshidrogenasa (LDH) se reconstituyó en 50% de glicerol y se diluyó en solución Tris (pH = 7,0). solución NADH se añadió a la placa de 96 pocillos antes de la adición de sobrenadante de células. La placa preparada se incubó a 37 ° C durante cinco minutos y se agitó. La absorbancia se leyó a 340 nm con un espectrofotómetro (SpectraMax
® M5; Molecular Devices) para escanear los niveles basales de NADH. A continuación, se añadió la LDH y la placa se protege de la luz y se incubó a 37 ° C durante una hora. Los niveles finales de NADH se midieron en la misma longitud de onda. La pérdida de absorbancia de NADH corresponde a piruvato contenido de muestras. el contenido de ATP intracelular se midieron para los diferentes tipos de células utilizando el título Glo-luminiscentes ensayo de viabilidad celular de la célula (Promega). Las células se sembraron en placas de 96 pocillos (blanco) a 8.000 células por pocillo durante 24 horas. Veinticuatro horas más tarde, las células fueron incubadas durante 2 horas, ya sea en presencia de oligomicina (2.5μg /ml) o 2-desoxiglucosa (100 mM). El contenido de ATP se detectó de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con un espectrofotómetro (SpectraMax
® M5; Molecular Devices).
Ensayo de proliferación de
OVCA 429, OVCA 433 células, A2780 y células SKOV3 se transfectaron de forma estable con el gen de la luciferasa de luciérnaga utilizando un método lentiviral y se sembraron a 5000 células /pocillo en una placa de 96 pocillos BD Falcon, solo o en 1: 1 de co-cultivo con o-ASC1 o o-ASC4. Los co-cultivos se realizan en DMEM (Mediatech, Manassas, VA) con 10% de FBS y 1% de penicilina y estreptomicina. Después de 24 horas, se añadió 0,15 mg /ml de D-luciferina y se incubó durante 1 hora. La luminiscencia se midió con un luminómetro (FLUOstar Omega, BMG Labtech, Offenburg, Alemania). se sustituyeron los medios de comunicación, y las mediciones se repitieron durante un máximo de 11 días de cultivo.
Migración de ensayo
La migración celular se ensayó usando medio condicionado (CM) generada a partir de O-ASC1 y O-ASC4 . O-ASC se cultivaron en una placa de 6 pocillos hasta la confluencia en medio α-MEM (Mediatech, Manassas, VA) con 20% de FBS (Hyclone) y 1% de penicilina, estreptomicina y L-glutamina (Mediatech, Manassas, VA). Después de lavar con PBS, DMEM libre de suero, con 1% de penicilina y estreptomicina (Mediatech, Manassas, VA) se añadió a cada pocillo. Después de 36 horas, se recogió CM O-ASC. líneas celulares de cáncer de ovario de interés se sembraron (en medio libre de suero) en la parte superior de un pozo 24 transwell placa con 8 micras poros (Corning, Inc., Corning, NY) con 500 l de O-ASC CM añaden a la parte inferior de cada pocillo. Todas las muestras se analizaron por duplicado o triplicado. Después de 24 horas, las células migradas se tiñeron utilizando Hema 3 Stat Pack (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). La densidad óptica se lee directamente en la placa de 96 pocillos a 590 nm de una (ELISA) lector de inmunoabsorción ligado a enzimas ensayo de placa (Instrumentos BioTek, Winooski, VT).
ensayo Radiosensibilidad
luciferasa se sembraron células A2780 marcado con (a una densidad de 10.000 células /pocillo) en una placa de 96 pocillos BD Falcon, solo o en 1: 1 o 01:19 co-cultivo con o-ASC1 o o-ASC4. Se llevaron a cabo co-cultivos en DMEM (Mediatech, Manassas, VA) con 10% FBS G418, 250 mg /ml, 1% de penicilina y estreptomicina. Después de 24 horas, las células se irradiaron a 0 Gy, 2 Gy, 4 Gy, 6 Gy, y 8 Gy a través de cesio 137 radiación de haz externo. La expresión de luciferasa se midió en 0,15 mg /ml de D-luciferina. Después de 1 hora de incubación a 37 ° C, la luminiscencia se midió con un espectrofotómetro (FLUOstar Omega, BMG Labtech, Offenburg, Alemania). entonces Se reemplazó el medio con nuevos medios que contienen G418, y las mediciones se repitieron cada dos días hasta que las células alcanzaron la confluencia.
paclitaxel y carboplatino ensayos
Luciferase marcado OVCA 429, OVCA 433, A2780 y se sembraron células SKOV3 (a una densidad de 10.000 células /pocillo) en una placa de 96 pocillos BD Falcon, solo o en 1: 1 de co-cultivo con o-ASC1 y o-ASC4. Los co-cultivos se realizan en DMEM (Meditech, Manassas, VA). Después de 24 horas, OVCA 429 a 0,5 M paclitaxel 200 M carboplatino, OVCA 433-1 mu M paclitaxel y 100 mM de carboplatino, A2780 a 20 M paclitaxel 200 M carboplatino y SKOV3 a 50 M paclitaxel y carboplatino 100 M fueron expuestos. La expresión de luciferasa se midió en 0,15 mg /ml de D-luciferina. Después de 1 hora de incubación a 37 ° C, la luminiscencia se midió con un luminómetro (FLUOstar Omega, BMG Labtech, Offenburg, Alemania). Los medios de comunicación fueron reemplazados con los nuevos medios que contienen la concentración designada de paclitaxel y carboplatino y la medición se repitieron durante 9 días.
O-ASC
in vivo
injerto
Para determinar si o-ASC se injertan en el estroma cáncer de ovario, 5 ratones desnudos fueron inyectados por vía intraperitoneal (IP) con 5 x 10
6 luciferasa células tumorales que expresan SKOV-3 con o sin el mismo número de RFP marcado con o-ASC1. El grupo de control consistió de ratón inyectado con sólo el O-ASC1. El crecimiento tumoral se controló con
in vivo-
bioluminiscente de imágenes. Los ratones se sacrificaron después de 53 días. Todos los ratones fueron sacrificados por protocolo aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional del MD Anderson (IACUC). Tumor y ovarios fueron fijados y embebidos en parafina para el análisis histológico. La inmunofluorescencia se realizó en los ovarios con el fin de detectar RFP que expresa O-ASC en todos los ratones. Todo el trabajo con animales se lleva a cabo de acuerdo con el protocolo del ratón aprobado en el MD Anderson Cancer Center. protocolo del ratón fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional del MD Anderson (IACUC). (H & amp; E) hematoxilina y eosina tinción se realizó utilizando el protocolo estándar en portaobjetos de tejidos embebidos en parafina.
El análisis estadístico
T-pruebas se realizaron utilizando el software GraphPad Prism, versión 5.00 (GraphPad Software, San Diego, CA, www.graphpad.com) para determinar diferencias estadísticamente significativas entre los grupos. Las diferencias se consideraron significativas si
p Hotel & lt; 0.05 .. Todos los gráficos muestran la media ± SEM.
Resultados
Caracterización de O-ASC
O-ASC fueron aisladas de tres pacientes con cáncer de ovario. O-ASC1 se obtuvo a partir de tejido adiposo omental de un paciente con adenocarcinoma de endometrio y ovario sin metástasis omental. O-ASC4 y O-ASC5 se aislaron de epiplón aparecer macroscópicamente normal obtenido de un paciente con carcinoma de ovario seroso con metástasis omental. ensayos de diferenciación demostraron que O-ASC, como BM-MSC, se diferencian en adipogénica, condrogénica, y linajes mesenquimales osteogénicas (Figura S1). marcadores de superficie celular se caracterizaron con citometría de flujo (Figura S2). O-ASC1 y O-ASC4, similar a BM-MSC, expresan CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 y. Ellos no expresan CD11b, CD34, CD45, o EpCAM. El marcador de superficie CD34 (glicoproteína transmembrana expresado en hematopoyético temprano y tejido vascular) fue expresada por el 10% de O-ASC1s en comparación con 0,2% de BM-MSC y 1,42% de O-ASC4. La endoglina (CD105) y CD44 fueron casi universalmente expresa en BM-MSC (99,34% y el 100% de las células, respectivamente), pero se expresa a niveles más bajos en O-ASC1 (87,24% y 46,1% de las células, respectivamente), o O- ASC4 (7,98% y el 30% de las células, respectivamente). Otros marcadores se expresaron en niveles similares en todas las líneas celulares.
La expresión génica
La expresión de genes de O-ASC1, O-ASC4, O-ASC5 para la comparación con SQ-ASC y BM-MSC Se hizo una encuesta con matrices Nimblegen. Un algoritmo de agrupación jerárquica se utilizó para las muestras del grupo sobre la base de similitud en la expresión de todos los 24.000 genes. Dendrogramas basados en muestras sin supervisión agrupación se separó en dos ramas principales; 1) O-ASC4 y O-ASC5, las cuales fueron aisladas de pacientes con metástasis en el epiplón, y 2) SQ-ASC y O-ASC1) y BM-MSC (Figura 1A).
agrupamiento no supervisado se realizó para generar un dendrograma utilizando la correlación centro y el promedio de vinculación (A) (O-ASC1, O-ASC4, O-ASC5, BM-MSC: n = 2; SC-ASC: n = 4). análisis reveló IPA vías con significativamente diferente expresión entre O-ASC1 y O-ASC4 (B). Las funciones se enumeran en la mayoría de bares (más altos) a menos significativos (barras inferiores) significativas, y la línea amarilla perpendicular marca el umbral de significación (p = 0,05).
El uso de un paquete de herramientas estadísticas, hemos identificado 415 genes expresados diferencialmente significativa entre O-ASC1 y O-ASC4. Cincuenta y seis por ciento de exceso de genes expresados (mínimo cambio 10x veces) en O-ASC4 respecto a O-ASC1 codificado para productos cuya localización final es en la membrana plasmática o el espacio extracelular. Ingenuity Pathways Analysis (IPA) análisis demostró que la mayoría de estos genes están implicados en el movimiento celular, el crecimiento y la proliferación y el cáncer o el metabolismo de moléculas pequeñas (Figura 1B). La Tabla 1 enumera las 25 principales genes (doble cambio de corte de & gt; 4 y el valor de p & lt; 0,001) cuya expresión difiere significativamente entre OSC4 y OSC1.
Símbolo
número de Acceso
Entrez gen nombre
Ubicación y Tipo de cambio veces
paramétrico valor p
ACANNM_001135, NM_013227AggrecanExtracellular spaceOther116.511.20E-06VNN1NM_004666Vanin 1Plasma membraneEnzyme0. 0327.20E-06GPR116NM_015234G receptor acoplado a proteína 116Plasma membraneG acoplado a la proteína receptor23.811.02E-05GRIK2NM_021956, receptor de NM_175768Glutamate, ionotrópicos, la adhesión celular kainato 2Plasma membraneIon channel21.191.02E-05NRCAMNM_001037132Neuronal componente moleculePlasma membraneOther0.0331.13E-05C1QL3NM_001010908Complement 1, q-como subcomponente 3Extracellular spaceOther0.0421.24E-05ITGA8NM_003638Integrin, alfa-8Plasma membraneOther51.011.35E 05CADM3NM_021189Cell molécula de adhesión de proteínas de unión 3Plasma membraneOther0.0491.51E-05NEBLNM_006393NebulettePlasma membraneOther0.0582.17E-05GJA5NM_005266Gap, alfa 5, 40 kDaPlasma membraneTransporter24.452.27E-05NPTX1NM_002522Neuronal pentraxina IExtracellular spaceOther35.62.51 E-05AIF1LNM_001002260Allograft factor inflamatorio 1-likePlasma factor de membraneOther12.842.73E-05F11RNM_016946F11 receptorPlasma membraneOther0.0983.18E-05PF4NM_002619Platelet 4Extracellular spaceCytokine0.0973.39E-05OXTRNM_000916Oxytocin receptorPlasma membraneG acoplado a la proteína receptor14.553.63E-05PCDH10NM_032961Protocadherin 10Plasma membraneOther57.293.83E-05SGCANM_000023Sarcoglycan, alfa ( 50 kDa glicoproteína asociada a distrofina) plasma membraneOther10.434.00E-05SORBS1NM_001034954Sorbin y dominio SH3 que contiene 1Plasma membraneOther30.084.00E-05CXCL5NM_002994Chemokine (motivo) ligando CXC 5Extracellular spaceCytokine0.124.15E-05ESM1NM_007036Endothelial molécula específica de células 1Extracellular spaceGrowth factor20.674.34E-05CCBP2NM_001296Chemokine vinculante proteína 2Plasma membraneG acoplados a proteínas receptor0.134.39E-05IL13RA2NM_000640interleukin 13 receptor, alfa-2Plasma membraneTransmembrane receptor0.0684.60E 05MMP7NM_002423Matrix metalopeptidasa 7 (matrilisina, uterina) extracelular spacePeptidase0.14.68E-05WFDC1NM_021197WAP dominio básico de cuatro disulfuro 1Extracellular spaceOther19.454.75E-05Table 1. Lista de los 25 genes cuya expresión fue estadística y significativamente diferentes entre los O-O-vs ASC4 ASC1.
Para calcular la significación estadística, se utilizó Estudiante de
t-test
. Descargar CSV CSV
ensayos metabólicos
Stroma se ha demostrado que promover la progresión maligna al alterar el metabolismo de las células cancerosas. De acuerdo con el "efecto de Warburg inversa", las células del estroma regulan al alza la glucólisis, el aumento de la producción de lactato que se secreta y se consume por las células cancerosas adyacentes para alimentar la fosforilación oxidativa (OXPHOS) [10]. La hipótesis de que los efectos pro-proliferativa y migratoria de OSC pueden ser explicadas por diferencias metabólicas en el estroma aísla. SQ-ASC tenía el más alto nivel de la captación de glucosa y la secreción de lactato en comparación con BM-MSC y O-ASC (Figura 2A y 2B). Entre O-ASC aislados, O-ASC4 había un número significativamente mayor tasa de glucólisis y la secreción de lactato que O-ASC1 (Figura 2A y 2B). O-ASC4 tuvo una mayor tasa de absorción de piruvato que O-ASC1 que probablemente se convierte en lactato dado que la tienen una mayor tasa de actividad glucolítica en O-ASC4 (Figura 2C). la producción de ATP en estado estacionario fue mayor en S-ASC4 que O-ASC1 (Figura 2E-F). La producción de ATP atribuido a la glucólisis se determinó por inhibición de la F1F0 ATP sintasa-con oligomicina mientras ATP a partir de la fosforilación oxidativa (OXPHOS) se midió mediante la inhibición de la vía de la glucólisis con 2-desoxiglucosa (2DG). Estos resultados demostraron que O-ASC4 produce ATP preferentemente de la glucólisis, mientras que O-ASC1 producido ATP a partir de la fosforilación oxidativa (Figura 2 E y F).
Se realizó un análisis metabólico en BM-MSC, SC-ASC y O-ASC1 y 4, incluyendo la captación de glucosa (A), la secreción de lactato (B), la captación de piruvato (C), la producción endógena de ATP (D), ATP derivado de la glucólisis (e) y ATP derivado de la fosforilación oxidativa (OXPHOS) (F). Los datos se presentan como media ± S.E.M. * P & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01 y *** p & lt; 0,001 para desapareado la prueba t de Student de 2 colas (n = 8).
O-ASC efectos sobre la proliferación de células de cáncer de ovario
Teniendo en cuenta la distinción entre O-ASC1 y O-ASC4 con respecto al análisis de la expresión génica y ensayos metabólicos, la hipótesis de que estos aislamientos pueden tener efectos distintos sobre la biología del cáncer de ovario. Para probar esto, se compararon los efectos de la O-ASC1 y O-ASC4 sobre la proliferación de células de cáncer de ovario, la migración y chemsensitivity. En primer lugar, para determinar si O-ASC influyen en el metabolismo celular de cáncer de ovario, no marcados O-ASC y líneas celulares de cáncer de ovario de luciferasa que expresan (OVCA 429, Ovča 433, A2780, y SKOV3) se co-cultivaron a una relación de 1: 1 hasta célula se convirtió en una confluencia de 11 días después de la siembra. 433 células OVCA 429 y OVCA proliferación se incrementó significativamente en 7 (p & lt; 0,001 y p & lt; 0,5, respectivamente), 9 (p & lt; 0,0001 para ambas líneas celulares) y 11 días (P & lt; 0,0001 y p & lt; 0,001, respectivamente) cuando se co-cultivaron con O-ASC1 comparado con el control. efectos pro-proliferativos importantes de O-ASC4 se observaron en OVCA 429 células después de 9 días (p & lt; 0,01) y 433 células Ovča el 11 día de co-cultivo (p & lt; 0,001). O-ASC4 aumento de la proliferación de las células SKOV3 en 7 (p & lt; 0,001), 9 (p & lt; 0,01) y 11 días (p & lt; 0,01). Curiosamente, O-ASC1 y O-ASC4 suprimen la proliferación de células A2780 humanos carcinoma de ovario (P & lt; 0,01 en los días 7, 9 y 11) (Figura 3). Para evaluar el impacto de una menor proporción de células ASC, se realizaron ensayos de proliferación con un uno y diecinueve O-ASC: las células del cáncer de relación (Figura S3). No hubo diferencia significativa en la tasa de proliferación para OVCA 429, OVCA 433, A2780 y líneas celulares SKOV3 cuando se co-cultivaron con O-ASC en esta relación.
luciferasa que expresan líneas celulares de cáncer de ovario se cultivaron solo o en una proporción 1: 1 con no marcados O-ASC. Diferencia significativa entre los controles (células cancerosas cultivadas solo) y células de cáncer de co-cultivadas con O-ASC se muestran: *, P & lt; 0,05; **, P & lt; 0,01; ***, P & lt; 0.001; ****, P & lt; 0,0001 (n = 5). ANOVA con una prueba de comparaciones múltiples Bonfferoni.
efectos O-ASC sobre la migración de células de ovario cáncer
Para investigar el impacto de O-ASC sobre la migración de células de cáncer de ovario, modificado ensayos de cámara de Boyden se realizaron con medio condicionado (CM) de O-ASC. El número de células de cáncer migrado (OVCA 429, OVCA 433, A2780, y SKOV3) aumentó significativamente después de la incubación con CM tanto de O-ASC1 y 4. O-ASC4 CM aumentó significativamente la migración de OVCA 429, 433 y las células A2780 en comparación con O-ASC1. (Figura 4, Figura S4).
células de cáncer de ovario migrado a través de un poro 8 micras en presencia de control de los medios acondicionados O-ASC. La absorbancia a 590 nm refleja el número de células que pasan a través de la membrana Transwell. Las diferencias significativas se muestran como sigue: *, P & lt; 0,05; **, P & lt; 0,01; ***, P & lt; 0,001 para la prueba t de Student no pareado de 2 colas (n = 3).
Efecto de O-ASC en la respuesta de las células del cáncer de ovario al tratamiento de quimioterapia y radiación
Para determinar si la presencia de las células de cáncer de ovario impacto o-ASC respuesta a la quimioterapia, las células tratadas solo y co-cultivadas con o-ASC con paclitaxel o carboplatino. Ovča 429 células tenían una supervivencia significativamente mayor después del tratamiento con carboplatino o taxol cuando se co-cultivaron con O-ASC4. OVCA 433 y SKOV-3 supervivencia después del tratamiento de carboplatino y taxol incrementó con el co-cultivo de ambos O-ASC1 y O-ASC4. A2780 supervivencia no se vio afectado por O-ASC co-cultivo (Figura 5A). Para determinar el efecto O-ASC sobre la sensibilidad a la radiación, las células A2780 fueron co-cultivadas 1: 1 durante 7 días con O-ASC1 o O-ASC4. Después de la incubación, las células se irradiaron a 2, 4, 6, y 8 Gy. Se observó un aumento significativo en la supervivencia después de 4, 6, y 8 Gy en las células A2780 co-cultivadas con O-ASC1 (p & lt; 0,05, p & lt; 0,0001 y p & lt; 0,01, respectivamente) y O-ASC4 (p & lt; 0,01, p & lt ; 0,001 y p & lt; 0,01, respectivamente) en comparación con el control (Figura 5B). El papel de radio-protección de las células madre de tejido adiposo no se muestra claramente en un experimento similar realizado con una relación 1:19 de las células O-ASC a. las células cancerosas (Figura S5).
células de cáncer de ovario se cultivaron con o sin un número igual de O-ASC y se trataron con las dosis de paclitaxel y carboplatino (n = 5) (A) o la radiación (n = 4) 0-8 Gray (B) como se muestra. Las diferencias significativas se muestran como sigue: *, P & lt; 0,05; **, P & lt; 0,01; ***, P & lt; 0.001; ****, P & lt; 0,0001 para no apareado la prueba t de Student de 2 colas.
O-ASC injerto
A continuación, nuestro propósito es determinar si O-ASC se injertan en el estroma cáncer de ovario y tejidos normales, incluyendo ovario. Los ratones desnudos se inyectaron por vía intraperitoneal con células tumorales que expresan luciferasa SKOV-3 con o sin un número igual de RFP marcado con O-ASC1. El crecimiento tumoral se controló con
in vivo-
bioluminiscente de imágenes. Después de 7 días, la actividad luciferasa fue significativamente mayor en los ratones tratados con O-ASCs pero posteriormente disminuyó (Figura S6). O-ASC fueron re-inyectados en el día 25. La inmunofluorescencia se llevó a cabo 7 días después de detectar RFP expresando O-ASC dentro de los cánceres de ovario y de ovario no afectado. se detectaron RFP que expresan O-ASC dentro del estroma de xenoinjertos de ovario pero no dentro de ovarios no involucrados (Figura 6A, 6B), lo que demuestra el injerto específico de tumor, como se ha informado con MSC de otras fuentes.
(A) Immunoflouresence se realizó para detectar O-ASC en xenoinjertos SKOV3 de ovario y de ovario macroscópicamente normal. O-ASC se detectan como los glóbulos rojos dentro del estroma de los tumores de ovario en ratones inyectados con RFP que expresa O-ASC. (B) H & amp;. E tinción de tejidos (20 aumentos) guía empresas
Discusión
Además de los adipocitos, el epiplón contiene vasos sanguíneos y linfáticos, así como un infiltrado inflamatorio rico que hacen que distinta de tejido adiposo subcutáneo.