Extracto
Las células madre del cáncer (CSC) poseen alta capacidad iniciadoras del tumor y se han reportado para ser resistente a la terapéutica. A la inversa, las células cancerosas resistentes a la terapia parece manifestarse fenotipos y las propiedades de CSC. En general se ha asumido que las células cancerosas resistentes a los fármacos pueden ser todos los CSC aunque se desconoce la generalidad de esta suposición. A continuación, se trataron crónicamente células de cáncer de próstata Du145 con etopósido, paclitaxel y algunos medicamentos experimentales (es decir, estaurosporina y 2 de paclitaxel análogos), lo que llevó a las poblaciones de células tolerantes con las drogas (DTC). Sorprendentemente, estos DTC, cuando se implanta por vía subcutánea o ortotópica en ratones NOD /SCID, presentaron menor cantidad tumorigenicidad o fueron aún no tumorigénicos. las células cancerosas de colon DLD1 con las drogas tolerantes seleccionados por un protocolo de selección crónica similar también se muestran tumorigenicidad reducida mientras que las células de cáncer de vejiga UC14 tolerante con las drogas demostradas ya sea aumento o disminución de la capacidad de regeneración del tumor. DU145 células tolerantes con las drogas demostraron baja proliferativa y el potencial clonogénico y eran prácticamente desprovista de CD44
+ células. knockdown prospectivo de CD44 en las células Du145 inhibió la proliferación celular y la regeneración del tumor, mientras que la restauración de la expresión de CD44 en las células Du145 tolerante con las drogas aumento de la proliferación celular y el aumento de la tumorigenicidad parcialmente. Curiosamente, DU145 células tolerantes con las drogas mostraron aumentos y disminuciones en muchos genes "troncalidad". Por último, se proporcionó evidencia de que la exposición crónica de drogas genera DTC a través de los mecanismos epigenéticos que implican moléculas como CD44 y KDM5A. Nuestros resultados revelan que 1) no todos los DTC son necesariamente los CAC; 2) Los fármacos quimioterapéuticos convencionales tales como taxol y etopósido pueden dirigirse directamente a las células iniciadoras de tumores CD44
+; y 3) los DTC generados a través de la selección de medicamentos crónica implican mecanismos epigenéticos
Visto:. Yan H, Chen X, Zhang Q, J Qin, Li H, Liu C, et al. Las células-Tolerante medicamento contra el cáncer (2011) muestran una reducción del tumor iniciadoras Capacidad: El agotamiento de CD44
+ células y Prueba de los mecanismos epigenéticos. PLoS ONE 6 (9): e24397. doi: 10.1371 /journal.pone.0024397
Editor: Amit Singh, Universidad de Dayton, Estados Unidos de América
Recibido: 5 de Julio, 2011; Aceptado: August 8, 2011; Publicado: 15 Septiembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Yan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio fue financiado por los Institutos nacionales de Salud (NIH) R01-ES015888, NIH 1R21CA 150009, Departamento de Defensa, W81XWH-08-1-0472, Departamento de Defensa, W81XWH-11-1-0331, Fundación Elsa Pardee, Centro MDACC para el cáncer La epigenética. Los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida de datos y análisis, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de células madre (CSC) concepto, que los tumores contienen células cancerosas de tallo como se propuso hace décadas y recientemente revivió para explicar la heterogeneidad celular en el tumor. Uno de los criterios más importantes para la definición de células madre cancerosas es su capacidad mejorada para regenerar tumores trasplantables que histológicamente recapitulan la heterogeneidad fenotípica del tumor parental [1]. Como tal, células madre cancerosas a menudo se llaman células iniciadoras del tumor. Los CCC se identificaron por primera vez en la leucemia y, desde 2003, se ha informado de muchos tumores sólidos humanos, incluyendo glioma [2], el sarcoma [3], y los cánceres de la mama de Ewing [4], [5], de colon [6] - [ ,,,0],12], páncreas [13], [14], el hígado [15] - [17], el estómago [18], de pulmón [19], [20], de cabeza y cuello [21], el riñón [22], y el ovario [ ,,,0],23], [24].
La evidencia creciente sugiere que las CSC puede ser más resistente a la terapéutica contra el cáncer, como se muestra en leucémica [25] y el mieloma múltiple [26] las células madre. CD133
+ CSC aumento después de la radiación y contribuir a radioresistance glioblastoma través de la activación preferencial de la respuesta de punto de control de daño del ADN y un aumento en la capacidad de reparación del ADN [27]. El CD44
+ CD24
lo /- células madre cancerosas de mama se enriquecen en pacientes con cáncer de mama que han recibido quimioterapia adyuvante [28] y más resistentes a algunos fármacos quimioterapéuticos [29]. En modelos de ratones de tumores de mama, células madre cancerosas también se han demostrado ser refractario al tratamiento con cisplatino [30]. Además, las células de cáncer de colon muestran quimiorresistente CSC fenotipos [31] y CD133
+ células madre cancerosas hepáticas son quimiorresistente debido a la activación preferencial de la vía de Akt [32]. Estos nuevos resultados destacan la posible participación de los CAC en la resistencia a la terapia y en la recurrencia de la enfermedad. Se ha supuesto que las células cancerosas resistentes a los fármacos pueden todos ser enriquecidas en células madre cancerosas aunque la aplicabilidad general de esta suposición permanece sin probar.
La tinción inmunohistoquímica [33], [34], ensayos clonogénicos [35], [36 ], así como experimentos de trasplante de tumores [37] - [41] han proporcionado pruebas de que el cáncer de próstata humano (CaP) también contiene células madre similares. Nuestros estudios sistemáticos en modelos de xenoinjertos indican que las células de CaP son heterogéneos con respecto a su capacidad iniciadoras del tumor con el CD44
+ población de células que albergan ambas células madre cancerosas quiescentes y progenitores tumorales proliferan rápidamente [38], [42]. Una fracción de CD44
+ células de CaP son lentos-ciclismo, aparentemente, puede someterse a la auto-renovación, preferentemente expresar los genes de troncalidad ', y poseen un alto potencial tumorigénicas y metastásicas. Los CCC se pueden enriquecer aún más el uso de CD44
+ α2β1
hi marcador perfil [39] y holoclones de células de CaP, en el que la mayoría de las células son CD44
+ α2β1
hola, contener células iniciadoras de tumores auto-renovación [41]. Nuestro trabajo reciente muestra que Nanog, esencial para la auto-renovación y la pluripotencia de las células ES, se enriquece en el CD44
+ población de células CaP y funcionalmente necesario para el crecimiento del tumor [43]. De hecho, Nanog expresión inducible es suficiente para dotar a CSC propiedades fenotípicas y funcionales y promover el desarrollo del CaP resistente a la castración [44]. Una pregunta sin respuesta clave es si las células madre CaP-como pueden comportarse como algunas otras células madre cancerosas son resistentes a la terapéutica o, como alternativa, si el tratamiento farmacológico enriquecería células iniciadoras del CaP. Aquí mostramos los resultados inesperados que algunas células cancerosas tolerante con las drogas son mucho menos tumorigénicas o incluso no tumorigénicos. Sorprendentemente, los cultivos de células Du145 CaP tolerante con las drogas están desprovistos de CD44
+ células, lo que, al menos en parte, dan cuenta de su tumorigenicidad reducida.
Materiales y Métodos
relacionado con animales los estudios han sido aprobados por el comité Institucional del Centro del cáncer MD Anderson IACUC (ACUF 08-05-08132). Todos los otros estudios presentados en este informe fueron la iniciada por el investigador y no requieren la aprobación de otros organismos reguladores.
Las células, reactivos, y los animales
Du145, PC3, y las células UC14 se obtuvieron a partir de ATCC y cultivaron en RPMI que contiene 7% de SFB, inactivado por calor 100 mg /ml de estreptomicina y 200 U /ml de penicilina (Gibco). Se obtuvieron células DLD1 de la ATCC y se cultivaron en DMEM que contenía FBS al 7% con antibióticos. Etopósido (VP16) y paclitaxel fueron adquiridos de Sigma. Doxorubicina (Dox) y estaurosporina (STS) fueron comprados a Biomol. WP1102 WP1103 y se sintetizaron dos nuevos análogos de paclitaxel con sustituciones en la posición 2 'OH (por el grupo Priebe, los detalles que se publicarán en otra parte). Los anticuerpos primarios utilizados en este estudio fueron: anticuerpo monoclonal de conejo para CD44 (Abcam) para el Western Blot (1:1,000), mAb ratón para CD44 (BD Pharmingen) para inmunotinción (1:500), mAb ratón para ABCG2 (Abcam; 1: 500), conejo pAb de Bcl-2 (Santa Cruz; 1:500), anticuerpos monoclonales de ratón para p21 y p27 (Santa Cruz; 1:1,1000 para ambos), pAb de conejo para hTERT (Santa Cruz; 1:100), mAb de conejo para GAPDH (Señalización celular; 1:2,000) y mAb de beta-actina (Señalización celular; 1:1,000). Los anticuerpos secundarios fueron adquiridos de GE Healthcare y ECL Plus reactivos fueron de ratones NOD PerkinElmer Inc. /SCID fueron adquiridos inicialmente a partir de los Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) y las colonias de reproducción establecidos en nuestras instalaciones de animales y se mantuvieron en condiciones estándar de acuerdo con el directrices institucionales.
Establecimiento de células tolerantes con las drogas (DTC) y la determinación de IC
50 valores
Du145, células DLD1, y UC14 fueron expuestos inicialmente a varios medicamentos, en pocillos por cuadruplicado , en un intervalo de concentraciones, es decir, 0, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 50 nM, 0,1 M, 0,5 M, 1 M, 2 M, 4 M, y 10 mM. Los fármacos se reponen cada 3 días y las células se trataron continuamente durante 2 semanas. La supervivencia celular y la muerte fueron monitoreados de cerca con un microscopio de contraste de fase invertida. Al final de un tratamiento de 2 semanas, las concentraciones "óptima" de drogas se determinaron con base en el criterio de que las drogas mostraron efectos inhibitorios significativos en la expansión celular, pero no mataron por completo toda la población (~ 90% de destrucción celular). Todo el experimento se repitió una vez. Estos experimentos condujeron a la determinación de las concentraciones óptimas (indicado en el texto). A partir de entonces, las células cancerosas fueron continuamente cultivadas en el medio que contiene la concentración óptima de los fármacos durante un mínimo de 3 meses para establecer el DTC, que fueron designados como DU145 células-VP16, células Du145-paclitaxel, así sucesivamente y así sucesivamente. Que los DTC se cultivaron de forma rutinaria en el medio que contiene las concentraciones óptimas de fármacos individuales
.
Para determinar las concentraciones de la mitad del máximo de inhibición (es decir, IC
50) de las células cancerosas de los padres y de los DTC, 2.5- 3.0 × 10
5 células se sembraron por cuadruplicado en placas de 24 pocillos. Después de cultivo durante la noche, las células fueron tratadas con diferentes concentraciones del fármaco de selección inicial o medicamentos que no son la selección (para examinar el potencial de resistencia cruzada) durante 24-48 h. Al final del tratamiento, el número de células viables se contaron usando ensayos de azul de tripano y el software GraphPad prisma 5,0 se utilizó para analizar los datos y calcular la IC
50 valores.
ensayos clonales y de incorporación de BrdU, inmunofluorescencia, e inmunotransferencia
procedimientos básicos para estos experimentos se han descrito en nuestras publicaciones anteriores [37] - [39], [43] - [45]. Para determinar el número de células totales, 5.000 células se sembraron triplicado o cuadruplicado en placas de 12 pocillos y se cultivaron durante 10 días, con medio fresco alimentado cada 3 días. Al final, el número de células viables se contaron usando azul de tripano. Para los ensayos de BrdU, las células se sembraron por triplicado en cubreobjetos de vidrio (10.000 células /cubreobjetos) durante la noche y luego se pulsaron con 10 mM de BrdU durante 4 h. Al final, las células se fijaron en paraformaldehído al 4% que contiene 5% de sacarosa durante 10 minutos. Las células se incubaron durante 20 min en 1% de Triton-100 y luego desnaturalizado, neutralizado, bloqueado, y se incubaron con anticuerpo monoclonal anti-BrdU (1:100) durante 1 hora a 37 ° C seguido de cabra anti-IgG de ratón-Alexa Fluor 594 (30 min a 37 ° C). Un total de 500-1000 células se contaron por cubreobjetos y dos cubreobjetos fueron contados para cada tipo de células para determinar el porcentaje de la proliferación (es decir, BrdU
+) células.
Para el análisis clonal, 100 células fueron chapada por triplicado en placas de 6 pocillos y se cultivaron durante 10 días con medio fresco alimentadas cada 3 días. Al final, ambos holoclones y meroclones [41] se enumeraron y los resultados se presentan como la eficiencia de clonación. Paraclones contenían células grandes y senescentes [41] y en general tenían & lt; 20 células y por lo tanto no se cuantificaron. Se realizó tinción de inmunofluorescencia de CD44 como se describe [38], [45]. Para la transferencia Western. Du145 padres y varios DU145 células tolerantes con las drogas fueron cosechadas para preparar lisado de células enteras en el análisis de Western blot de las moléculas que se indican en los paneles de las figuras. En algunos experimentos, las células Du145-VP16 fueron tratados primero con diversas concentraciones de tricostatina A (TSA) o 5'-aza-desoxicitidina (AZA) durante 72 h.
Establecimiento de GFP marcada con células DU145 tolerante con las drogas
en pocas palabras, células de empaquetamiento 293FT [43] fueron transfectadas con GFP-pLL3.7 vector lentiviral [43] junto con los plásmidos de embalaje utilizando Lipofectamine. medio que contiene el virus se recogió 48 a 72 h después, se centrifugó a 3.000 rpm, pasa a través de un filtro de 0,45 micras para eliminar los desechos y finalmente se sometió a ultracentrifugación (20.000 rpm x 2 horas a 4 ° C). a continuación, las células DU145 con las drogas tolerantes fueron infectadas con el virus a una MOI (multiplicidad de infección) de 20-25.
subcutánea (sc) y los experimentos de tumor ortotópico
Los procedimientos básicos se describieron anteriormente [37 ] - [39], [41], [43], [46]. Brevemente, Du145 parental y tolerante a las drogas (y otras) las células en diferentes números fueron inyectados en el 50% de Matrigel s.c. en los flancos de ratones NOD /SCID. Cuando el tumor más grande (s) en cualquier grupo debe ser terminado por regulaciones IACUC o los animales portadores de tumores se convirtió moribundo, todos los animales de ese grupo se sacrificaron y se recogieron los tumores. Para la implantación ortotópica, los animales se anestesiaron y se inyectaron las células en una mezcla de mediano Matrigel 20-l (01:01) en la próstata dorsal. Cuando la carga del tumor se hizo evidente (por palpación), se terminó el experimento, los animales se sacrificaron, y los tumores primarios junto con varios órganos (es decir, pulmón, hígado, bazo, páncreas, riñón, etc.) se disecaron y se examinó para micro y macrometástasis (es decir, GFP
+ focos) con un microscopio de epifluorescencia Nikon microdisección.
experimentos CD44 desmontables
mediada desmontables shRNA se realizó según lo descrito recientemente [43], [46]. En pocas palabras, 293FT células de empaquetamiento fueron transfectadas con cualquiera pGIPz CD44 shRNA vector lentiviral o pGIPz-NS control de vectores. El medio de cultivo que contiene el virus se recogió 72 h después de la transfección, se centrifugó a 3000 rpm, se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,45 micras-y finalmente sometido a ultracentrifugación (20.000 rpm x 2 horas a 4 ° C). El sedimento viral se reconstituyó en el medio OPTI-MEM y se utiliza para infectar las células HT1080 de fibrosarcoma para determinar el título viral. Entonces DU145 células fueron infectadas con los virus pGIPz-NS o pGIPz-CD44shRNA a una MOI de 20, y, a las 24-48 h más tarde, fueron utilizados en cualquiera de las caracterizaciones in vitro o in vivo en experimentos tumorales.
sobreexpresión de CD44 experimentos
El procedimiento básico retroviral se ha descrito anteriormente [45]. En resumen, los vectores retrovirales, incluyendo el control de vectores pBabe-GFP y pBabe-CD44 (Addgene, Cambridge, MA) se transfectaron en las células Ampho-Phoenix 293 (ATCC). 48 a 72 h después de la transfección, se recogió medio de cultivo que contiene el virus, se centrifugó a 3000 rpm, se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,45 micras-y finalmente sometido a ultracentrifugación (22.000 rpm x 2 horas a 4 ° C). El sedimento viral se reconstituyó en el medio OPTI-MEM y se utiliza para infectar las células Du145 tolerante con las drogas durante 24-48 h, que se utilizaron a continuación, tanto en in vitro e in vivo.
tratamiento terapéutico de PC3 ortotópico tumores con paclitaxel
El procedimiento básico para experimentos terapéuticos fue descrito recientemente [46]. Brevemente, las células PC3-GFP se implantaron en la próstata dorsal (DP) de NOD macho /ratones SCID (500.000 células /DP; n = 10). Tres semanas más tarde, se inyectaron 5 animales por grupo, por vía intravenosa, con 15 mg /kg de peso corporal de paclitaxel o el vehículo de control (PBS). Las inyecciones se repitieron cada semana durante dos semanas más (es decir, un total de 3 inyecciones) y los animales se terminaron 49 días después de la implantación de células tumorales. Los tumores fueron disecados DP, incluidas en la imagen, y se pesaron mientras que varios órganos, incluyendo los pulmones, el páncreas, los ganglios linfáticos, el hígado y el cerebro, fueron examinados para la metástasis en un microscopio de disección epifluorescencia [46].
Análisis de '' stemness perfiles de expresión de genes de la transcriptasa inversa cuantitativa - reacción en cadena de la polimerasa (qPCR)
El procedimiento básico para el análisis qPCR se ha descrito recientemente [44], [46]. Brevemente, el ARN total fue extraído de células Du145 y Du145-VP16 usando un kit RNeasy RNA-purificación (Qiagen, Valencia, CA). El ABI alta capacidad de cDNA Archivo Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) y hexámeros aleatorios se utilizaron para la síntesis de ADNc. qPCR se realizó por el Fondo para la Biología Core M. D. Anderson Ciencia-Park molecular utilizando un ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems). Archivo de software del constructor 3.1 (Applied Biosystems) se utilizó para diseñar cebadores de PCR y sondas. pares de cebadores específicos de genes humanos fueron utilizados para perfiles de expresión mediante el método SYBR verde. El Ct experimental (ciclo umbral) se calibró frente a la de 18S producto de control. Todas las amplificaciones se realizaron por triplicado. El método DDCT se utilizó para determinar la cantidad de producto génico en relación con la expresada en DU145 células parentales (1-pliegue, 100%).
Los análisis estadísticos
software
GraphPad Prism 5.0 y F- test se utilizaron para comparar la IC
50 valores. Desapareado
t-test
se utilizó para comparar las diferencias en el número de células BrdU,
+% de células, la eficiencia de la clonación, CD44
+% de células tumorales, y pesos. La prueba exacta de Fisher se utilizó para comparar la incidencia y la latencia.
Resultados
tratamiento farmacológico subletal crónica dio lugar a células cancerosas tolerante con las drogas
Clínicamente, muchos pacientes de cáncer a menudo son tratados de forma crónica por la terapéutica anti-cáncer. El mejor ejemplo es quizá CML (leucemia mielógena crónica) de los pacientes que deben tomar imatinib (Gleevec) de forma continua durante años [47]. Por otra parte, la quimioterapia metronómica - una forma de administración de la quimioterapia a menudo se caracteriza por una administración frecuente diaria,, extendida de pequeñas dosis de chemodrugs convencionales sin mayores pausas [48], se está convirtiendo en un régimen terapéutico estándar para muchos tipos de cáncer. Con base en los supuestos de que las CSC pueden tener una ventaja especial de la terapéutica que sobreviven y son probablemente las células que median la resistencia a los medicamentos, hemos probado si las células cancerosas que han sobrevivido el tratamiento crónico de drogas pueden ser todos poseen propiedades CSC. Nos primera trataron las células de cáncer de próstata Du145 (PCA) con dos fármacos clínicos, es decir, etopósido (VP16) y paclitaxel (Taxol), así como tres fármacos experimentales, estaurosporina (STS), un inhibidor de la proteína quinasa promiscua, y dos análogos de paclitaxel recién sintetizadas denomina WP1102 WP1103 y (los detalles se presentarán en otro lugar). Como se describe en Métodos, primero trataron DU145 células con estos cinco medicamentos en una gama de 10 concentraciones durante 2 semanas para determinar las concentraciones óptimas '' subletales en el que las drogas expansión de las células del tumor inhibió significativamente, pero no mató a toda la población. El uso de este protocolo de tratamiento crónico que el tratamiento metronómica 'imita' en la clínica, que determina las concentraciones óptimas, en DU145 células, de VP16, paclitaxel, STS, WP1102, y WP1103 en 1,25 M, 50 nM, 7 nM, 5 nM, y 25 nM, respectivamente. DU145 células fueron cultivadas posteriormente, de forma continua, en el medio que contiene las concentraciones óptimas de fármacos para ~ 3 meses. Los (DTC) líneas de células tolerantes con las drogas resultante se designaron como DU145-VP16, Du145-paclitaxel, Du145-STS, Du145-WP1102, y Du145-WP1103, respectivamente.
Para determinar si Du145 tolerante con las drogas las células fueron realmente tolerante con los fármacos originales de selección, se trataron DU145 células parentales y tolerante con las drogas de lado a lado con los respectivos cinco fármacos. Como se muestra en la Fig. 1, DU145 células tolerantes con las drogas fueron en general más resistentes que DU145 células parentales a las drogas de selección. Así, las células Du145-VP16 fueron & gt; 10 veces más resistente que DU145 células a VP16 (IC
50 valores siendo 0,78 M durante Du145 y 9,17 mM para las células Du145-VP16). DU145 células-paclitaxel eran ~ 7 veces más resistente a paclitaxel de DU145 células (Fig. 1, A y C). Del mismo modo, las células Du145-WP1103 eran casi 30 veces más resistente a WP1103 de DU145 células (Fig. 1B-C). Por último, Du145-STS y DU145 células-WP1102 eran aproximadamente 1,5 y 3 veces más resistente a la STS y WP1102, respectivamente, que DU145 células no seleccionadas (fig. 1B-C). Por lo tanto, la resistencia a los medicamentos diferencial entre los DTC establecidos clasificado Du145-WP1103 & gt; Du145-VP16 & gt; Du145-paclitaxel & gt;. Du145-STS≈Du145-WP1102
A-B. líneas celulares de sus padres Du145 y tolerante con las drogas Du145 seleccionados con dos fármacos clínicos (A) o tres medicamentos experimentales (B) fueron expuestos, de lado a lado, para los respectivos medicamentos de selección (por ejemplo, células Du145-VP16 para VP16 y Du145- células de paclitaxel a paclitaxel) a las concentraciones (transformadas en logaritmo) indicaron. Eje Y representa la inhibición del crecimiento celular (%). C. presentaciones tabulados de IC
50 valores (véase Materiales & amp; Métodos) y su IC del 95% (intervalo de confianza) de DU145 y DU145 células tolerantes a las drogas en respuesta a los cinco fármacos indicados. Los valores se calculan a partir de los datos obtenidos en A y B.
A continuación, expusimos DU145-VP16 de tres fármacos no selección, es decir, el paclitaxel, STS, y doxorubicina (Dox). Como se muestra en la Fig. 2, DU145-VP16 fueron más resistentes (que DU145 células parentales) al paclitaxel (~ 4 veces), STS (1,5 veces), y Dox (13 veces), lo que sugiere que los DTC también mostraron resistencia cruzada a otros no-selección medicamentos
células
Du145-VP16 fueron tratados con paclitaxel (A), STS (B), y doxorubicina (dox; C). a las concentraciones indicadas [registro]. Los resultados se presentan como% de inhibición e IC
50 (D) se determinaron como en la Figura 1.
Uso de estrategias similares, también establecimos de colon DLD1 tolerante con las drogas (Fig. 3) y UC14 vejiga (no mostrada) las células cancerosas. En las células DLD1, las concentraciones óptimas para VP16, paclitaxel, WP1102, y WP1003 fueron determinados estar en 2,5 M, 100 nM, 120 nM y 100 nM, respectivamente. Como se muestra en la Fig. 3, las células DLD1-VP16, DLD1-paclitaxel, DLD1-WP1102, y DLD1-WP1103 establecidos eran resistentes a los fármacos respectivos de selección. Además, las células DLD1-VP16 también mostraron resistencia cruzada a paclitaxel y Dox (Fig. 3B). células UC14-drogas tolerantes fueron igualmente más resistentes a los medicamentos de selección (es decir, el paclitaxel, STS, VP16, Dox, WP1102, y WP1103), que las células UC14 parentales (no se muestra).
Parental y drogas líneas de células tolerantes DLD1 seleccionados con concentraciones óptimas (véase el texto) de VP16, paclitaxel, WP1102, y WP1103, se expusieron, de lado a lado, para los respectivos medicamentos de selección a las concentraciones (transformados en logaritmos) indicada (a). Eje Y representa la inhibición del crecimiento celular (%). B. presentaciones tabulados de IC
50 valores y su IC del 95% (la confianza de los intervalos) de las células parentales DLD1 y líneas DLD1 tolerante con las drogas en respuesta tanto a la selección y la selección de medicamentos no.
DU145 células de Drogas tolerantes eran sorprendentemente menos tumorigénicas que DU145 células parentales
la hipótesis de que los DTC podría poseer propiedades CSC y ser más tumorigénico in vivo. Para nuestra sorpresa, todas las células Du145 tolerante con las drogas por vía subcutánea (sc) inyectados en el ratones NOD /SCID demostraron muy reducidas tumor de iniciación de la capacidad en comparación con el mismo número de DU145 células parentales, que mostró una frecuencia de iniciación de tumor (TIF) de ~ 1/175 (Tabla 1). La inyección de cantidades de células Du145 parentales en aumento, como era de esperar, condujo a la latencia reducida (Tabla 1). En contraste, las células Du145-VP16 mostraron una TIF de ~ 1 /62.000 y, en 100.000 células inyectadas, la latencia del tumor fue más de dos veces más largo que para el mismo número de células Du145 (Tabla 1). De hecho, tanto las células Du145-paclitaxel y Du145-WP1103 eran no tumorigénicos hasta 10.000 (por Du145-WP1103) y 100.000 (para Du145-paclitaxel) células implantadas (Tabla 1). Incluso para Du145-STS y Du145-WP1102 células, que presenta el menor IC
50 diferenciales (fig. 1B-C), la reducción de la incidencia de tumores con TIF de 1/971 y 1 /45.787, respectivamente, y los tumores más pequeños eran también observado (Tabla 1).
Para determinar si la implantación del tumor sitio podría tener un efecto sobre la tumorigenicidad diferencial observado, establecimos DU145 células GFP-etiquetados Du145 de los padres y de drogas de alta disponibilidad y un número igual implantados (es decir, , 500,000) de las células ortotópicamente en la próstata dorsal (DP) de los ratones NOD /SCID machos. Cuando el experimento se terminó 75 días después de las inyecciones de células tumorales, se observó que las células Du145-STS Du145-VP16 y generaron tumores más pequeños que las células Du145 parentales (Fig. 4A). De hecho, tanto las células Du145-paclitaxel y Du145-WP1103 eran no tumorigénicos en el modelo de regeneración tumor DP (Fig. 4A). Significativamente, DU145 células parentales metástasis en múltiples órganos, incluyendo los ganglios linfáticos, riñón, páncreas, hígado, pulmón y bazo mientras que las células Du145 tolerante con las drogas carecían aparente metástasis a cualquiera de estos órganos (Fig 4B-C;. Datos no mostrados)
A. DU145 células parentales o tolerantes a las drogas GFP-etiquetados se implantaron (500.000 células /inyección), en el 50% de Matrigel, en el DP de los ratones NOD /SCID. Todos los animales se terminaron 75 días después de la implantación. Se muestran los de incidencia del tumor y los pesos del tumor (media ± S.D.; estadísticas no aplicable debido al número relativamente pequeño de animales). ANTES DE CRISTO. imágenes tumorales y representativo de un animal portador de un tumor en el grupo de Du145 (B) y Du145-VP16 (C), respectivamente. Todas las imágenes fueron adquiridas mediante un microscopio de epifluorescencia Nikon microdissecting a 0,75 × y el área de caja en B (imagen de la GFP de pulmón) representa una ampliación que muestra GFP
+ manchas en el pulmón.
de Drogas DLD1 células tolerantes también demostraron una reducción de la tumorigenicidad mientras que las células UC14 tolerante con las drogas demostraron cambios drogodependientes en iniciadoras del tumor capacidad
para determinar si la tumorigenicidad reducida asociada con las células resistentes a los medicamentos se limita sólo a las células Du145, que de manera similar inyectada, sc, un número creciente de padres DLD1 y líneas celulares DLD1 de cuatro fármacos de alta disponibilidad en los ratones NOD /SCID. Como se muestra en la Tabla S1, las células DLD1 tolerante con las drogas, aunque presentan la incidencia de tumores similares, regeneran tumores significativamente menores en comparación con las células parentales DLD1 en el mismo número de células.
Hemos llevado a cabo experimentos tumorales limitativo dilución similares en 6 células UC14 drogas seleccionado (Tabla S2). En contraste con las células Du145 y DLD1 tolerante con las drogas, que uniformemente demostrado un descenso de potencial tumorigénico, 4 de los 6 células UC14 tolerante con las drogas (Tabla S2; sombreadas de color marrón) demostraron una mayor capacidad tumoral-regeneración en comparación con el mismo número de células UC14 parentales. Curiosamente, dos líneas de células UC14 tolerante con las drogas también regenerados tumores mucho más pequeños que el mismo número de células UC14 parental (Tabla S2; rosa sombreado). Estos resultados indican que las células UC14 tolerante con las drogas son más o menos tumorigénicas de las células parentales, dependiendo de los fármacos de selección iniciales.
DU145 células de Drogas tolerante fueron menos proliferativa y mostraron baja eficiencia de clonación
Ya que era bastante inesperado que algunas células cancerosas tolerante con las drogas demostraron una reducción de la capacidad de regeneración del tumor, que se centró posteriormente en DU145 células tolerantes con las drogas en un intento por descubrir los mecanismos potenciales. Hemos observado consistentemente que la mayoría de las células Du145 tolerante con las drogas parecían proliferar más lentamente en comparación con DU145 células. De hecho, en un experimento prospectivo 10-días medir el número de células vivas, se observó que todas las células Du145 tolerante con las drogas, con excepción de las células Du145-WP1102, mostraron el número de células vivas mucho más bajo de punto final (Fig. 5A), lo que sugiere que DTCs eran menos proliferativa y /o más susceptibles a la muerte celular. A continuación, llevó a cabo experimentos de incorporación de BrdU para medir directamente la proliferación celular. Como se muestra en la Fig. DU145 células tolerantes con las drogas 5B, mostraron índices más bajos de proliferación (es decir,% BrdU
+ células). Curiosamente, incluso las células-WP1102 Du145 demostraron un menor índice de proliferación (Fig. 5B), aunque estos cultivos mostraron el número de células vivas totales similares a DU145 células parentales (Fig. 5A). Recuerde que las células Du145-WP1102 también muestran relativamente menos reducción de la capacidad de iniciación de tumor en comparación con otras células Du145 tolerante con las drogas (Tabla 1). Es posible que las células Du145-WP1102 proliferado menos, pero también tenía la muerte celular menos espontánea, lo que resulta en el número de células vivas de punto final similares (Fig. 5A) y disminuye menos pronunciado en la tumorigenicidad (Tabla 1). De hecho, se observó consistentemente que las células Du145-WP1102, seleccionados crónicamente usando 5 compuesto nM WP1102, mostraron menos flotante y células apoptóticas en los frascos de cultivo en comparación con las células Du145-WP1103 (no mostrados), que han sido seleccionados crónicamente usando 25 compuesto nM WP1103. Finalmente, se observó que todas las células Du145 tolerante con las drogas demostraron una menor eficiencia de clonación que los DU145 células parentales (Fig. 5C).
A. Cuantificación de número de células viables. Padres y DU145 células tolerantes con las drogas se sembraron, por cuadruplicado, en placas de 12 pocillos (5.000 células /pocillo) y las células viables se cuantificaron utilizando el ensayo de exclusión con azul de tripano 10 días después de chapado. B. Cuantificación de BrdU
+ células% (véase Materiales y Métodos amp;). C. Determinación de la eficiencia de clonación. Padres y DU145 células tolerantes con las drogas se sembraron, por cuadruplicado, en placas de 6 pocillos (100 células /pocillo) con medio fresco se repone cada 3 días. Los números de holoclones y meroclones se determinaron 10 días después de chapado. En todos los datos, las barras representan la media ± SD y los análisis estadísticos se realizaron utilizando Estudiante
t-test
(*, P & lt; 0,05; **, P & lt; 0,01) guía empresas
. en consonancia con la proliferación celular reducida, DU145 células tolerantes a los fármacos mostraron mayores niveles de dos inhibidores de la quinasa dependientes de ciclina, p21 y p27, especialmente en células Du145-WP1103 Du145-paclitaxel y (Fig. 6A), las dos líneas celulares que carecían completamente tumorigenicidad (Tabla 1). Los niveles de p27 también eran elevados en todas las otras tres líneas tolerantes con las drogas Du145 celulares (Fig. 6A). Curiosamente, la banda de proteína p27 aumentó significativamente en las células Du145-WP1103 Du145-Paclitaxel y migró ligeramente más rápido que la proteína en otras líneas celulares (Fig. 6A). Los estudios futuros se aclare esta observación potencialmente interesantes. En contraste con p21 y p27, Bcl-2, una proteína anti-apoptótica, mostraron menos, aunque decrementos dramáticos, de nuevo, en las dos líneas Du145 no tumorigénicas, es decir, Du145-Paclitaxel y Du145-WP1103 (Fig. 6A).
A. lisado de células enteras a partir de los tipos de células indicadas se utilizó en la transferencia Western de p21, p27, Bcl-2, y hTERT y la transferencia se volvió a sondear para la β-actina. NS, no específica. B. transferencia Western de CD44 y ABCG2. La transferencia se volvió a sondear para la β-actina y GAPDH. DISCOS COMPACTOS. DU145 y DU145 células tolerantes con las drogas se sembraron en cubreobjetos de vidrio y se tiñeron para CD44 usando anticuerpo monoclonal. Mostrados son imágenes representativas (C) y cuantificación de CD44
+ células (D; media ± DE, *, P & lt; 0,01).
culturas Du145 de Drogas tolerantes mostraron una reducción del número de, o carecían de, CD44
+ células
Varias piezas de evidencia sugieren que la disminución de la capacidad de regeneración de las células del tumor en Du145 tolerante con las drogas puede implicar, además de potencial proliferativo comprometida quizá mediada por el aumento de p21 y p27, defectos inducidos por las drogas en las células iniciadoras de tumores. DISCOS COMPACTOS.