Extracto
Los estudios epidemiológicos han demostrado que el uso regular de medicamentos no esteroides anti-inflamatorios no esteroideos (AINE) está asociada con un menor riesgo de diversos tipos de cáncer. Además, in vitro y experimentos en modelos de ratón han demostrado que la iniciación AINE disminución del tumor y /o progresión de varios tipos de cáncer. Sin embargo, hay estudios preclínicos limitados que investigan los efectos de los AINE en el cáncer de ovario. Aquí, hemos estudiado los efectos de dos AINE, diclofenaco e indometacina, en líneas celulares de cáncer de ovario y en un modelo de xenoinjerto de ratón. Diclofenac y tratamiento con indometacina disminuyó el crecimiento celular mediante la inducción de la detención del ciclo celular y la apoptosis. Además, diclofenaco e indometacina redujo el volumen del tumor en un modelo de xenoinjerto de cáncer de ovario. Para identificar las posibles vías moleculares que median en los efectos del tratamiento NSAID en el cáncer de ovario, se realizó el análisis de microarrays de células de cáncer de ovario tratados con indometacina o diclofenaco. Curiosamente, varios de los genes que se encuentran downregulated siguiente diclofenac o tratamiento con indometacina son genes diana transcripcional de E2F1. E2F1 se downregulated en el ARNm y la proteína tras el tratamiento con diclofenaco e indometacina, y la sobreexpresión de E2F1 células rescatadas de los efectos inhibidores del crecimiento de diclofenaco e indometacina. En conclusión, los AINE diclofenaco e indometacina ejercen un efecto antiproliferativo en el cáncer de ovario in vitro e in vivo y los efectos de los AINE pueden ser mediados, en parte, por la regulación a la baja de E2F1
Visto:. Valle BL, C 'Souza T, Becker KG, madera WH III, Zhang Y, Wersto RP, et al. (2013) Los fármacos antiinflamatorios no esteroideos-inflamatorios disminuir la expresión de E2F1 e inhibir el crecimiento celular en células de cáncer de ovario. PLoS ONE 8 (4): e61836. doi: 10.1371 /journal.pone.0061836
Editor: Resham Bhattacharya, de la Clínica Mayo, Estados Unidos de América
Recibido: 18 Enero, 2013; Aceptado: February 25, 2013; Publicado: 24 Abril 2013
Derechos de Autor © 2013 Valle et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada totalmente por el Programa de Investigación Intramural de los Institutos nacionales de Salud, Instituto Nacional sobre el Envejecimiento. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario es la principal causa de muerte por tumores malignos ginecológicos. Cuando se detecta a tiempo, la tasa de supervivencia a 5 años es de hasta el 90%, pero, por desgracia, la gran mayoría de los casos son diagnosticados como enfermedad en etapa tardía, que es a menudo resistente a la quimioterapia convencional. En consecuencia, la tasa de supervivencia global a 5 años de cáncer de ovario es de aproximadamente 30-40%. Por tanto, es imperativo para investigar nuevos enfoques para el tratamiento y manejo de esta enfermedad mortal.
Los estudios epidemiológicos han sugerido que el uso regular de medicamentos no esteroides anti-inflamatorios no esteroideos (AINE) se asocia con un menor riesgo de varios tipos de cáncer, incluyendo cáncer colorrectal, de mama, pulmón y ovario [1], [2], [3]. Además, en estudios in vitro y en animales han demostrado que los AINE pueden disminuir la iniciación y /o progresión de varios tipos de cáncer [4], [5], [6]. Por ejemplo, la indometacina NSAID inhibió el crecimiento de los cánceres de colon inducido químicamente en ratas [7], [8]. Además, indometacina redujo el crecimiento de tumores mamarios espontáneos nuevos y establecidos [9]. El diclofenac NSAID disminuyó el crecimiento de xenoinjertos de cáncer de pulmón de células pancreáticas y no pequeñas [10], [11]. Sin embargo, hay estudios preclínicos limitados que investigan los efectos y mecanismos de acción de diclofenaco e indometacina en el cáncer de ovario [12], [13]. En este sentido, Zerbini et. Alabama. informó que el diclofenaco disminución del volumen tumoral en ratones SCID con células de cáncer de ovario SKOV-3 xenoinjertos de ~ 20% [12]. Sin embargo, otro estudio informó que la indometacina no tuvo ningún efecto sobre el crecimiento del sarcoma de células reticulares de ovario M5076 [13].
Hasta donde sabemos, no existen informes sobre los efectos de la indometacina específicamente en el cáncer de ovario epitelial, que comprende la mayoría de los cánceres de ovario (aproximadamente 90%). En este estudio, hemos investigado los efectos de la diclofenac AINE y la indometacina en células de cáncer de ovario. Se presenta que los AINE reducen significativamente el crecimiento de células de cáncer de ovario in vitro e in vivo, y, usando el análisis de microarrays, hemos identificado el factor de transcripción E2F1 como mediador de este efecto. Es importante destacar que se encontró que la expresión ectópica de E2F1 revirtió los efectos inhibidores del crecimiento de los AINE que sugieren que los AINE podrían actuar, en parte, a través de un mecanismo que implica E2F1 regulación a la baja en las células de cáncer de ovario.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Todos los procedimientos realizados en ratones fueron aprobados por el Comité de Cuidado y uso de Animales institucional del Instituto Nacional sobre el Envejecimiento. Este estudio se realizó de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud.
Reactivos
El diclofenaco e indometacina fueron adquiridos de Sigma-Aldrich (St. Louis , MO). Los anticuerpos anti-E2F1, anti-E2F4, anti-MCM2, y anti-MCM4 se adquirieron de Proteintech (Chicago, IL). Los anticuerpos de Abcam (Cambridge, MA) reconocieron GAPDH, y los anticuerpos de Señalización Celular (Danvers, MA) reconocieron Rb. E2F1 y eGFP plásmidos de expresión eran de GeneCopoeia (Rockville, MD). Rb siRNA (SC-29468) era de Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CA).
Cultivo de células y transfections
Las líneas celulares de adenocarcinoma seroso de ovario HEY, OVCAR5 y UCI-101 fueron amablemente previstos de la siguiente manera: Hey células por el Dr. Robert C. Bast [14], las células OVCAR5 por el Dr. Thomas C. Hamilton [15] y las células de la UCI-101 por el Dr. Michael J. Birrer [16]. Las células se cultivaron en medio de cultivo 5A de McCoy suplementado con suero bovino fetal al 10% y penicilina /estreptomicina (100 unidades /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina), y se incubaron a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO
2 . Todos los experimentos se realizaron en medios que contienen suero
Para las transfecciones, HEY Las células se sembraron a una densidad de 5 × 10
4 células en placas de 12 pocillos y se transfectaron transitoriamente con E2F1 o eGFP como control.; o Rb siRNA o ARNsi de control durante 24 horas, utilizando X-treme Gen 9 ADN reactivo de transfección (Roche) o Lipofectamine 2000 (Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células fueron entonces volvieron a sembrar a densidades de 5 × 10
3 células en placas de 6 pocillos y se trataron durante 24-48 horas con diclofenaco 300 M o indometacina. Las células se lisaron y se analizaron por inmunotransferencia o lavan y se utilizan en ensayos por clonación.
MTS y ensayos por clonación
Para los ensayos de viabilidad MTS (Promega), HEY, OVCAR5 o UCI-101 células fueron sembradas a una densidad de 7 x 10
3 células en placas de 96 pocillos y se trataron durante 48 horas con diclofenac 300 M o indometacina. Las células se incubaron a continuación con reactivos de MTS y la absorbancia a 490 nm se midió después de la incubación 1-4 horas a 37 ° C. Para los ensayos de viabilidad dependencia de la dosis, las células se trataron durante 24 horas con concentraciones crecientes de diclofenaco o indometacina (50, 100, 250, y 500 mM). Para ensayos por clonación, HEY, OVCAR5 o UCI-101 células se sembraron a una densidad de 3 x 10
3 células en placas de 6 pocillos y se trataron durante 48 horas con 300 mM diclofenaco o indometacina, se lavan y se dejan crecer durante 10 días. Las colonias se visualizaron después de tinción con violeta cristal (0,5% de cristal violeta en metanol al 50%).
ciclo celular y la apoptosis análisis
y se trataron durante 24 ó 48 horas con 300 mM diclofenaco o indometacina . Las células se marcaron con yoduro de propidio y se analizaron en un citómetro de flujo del calibre FACS (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Para el análisis de apoptosis, las células se trataron durante 48 ó 96 horas con diclofenac 300 M o indometacina. La apoptosis y el ADN contenido se ensayaron por BrdU y tinción con yoduro de propidio utilizando un kit de Apo-BrdU (Phoenix Flow Systems, San Diego, CA) y se analizaron en un citómetro de flujo LSR-II (BD Biosciences, San Jose, CA).
los estudios en animales se obtuvieron
7-8 semana ratones desnudos atímicos hembra de Harlan Laboratories (Frederick, MD) y se revisaron todos los experimentos y aprobado por el IACUC NIA.
células HEY ( 1,5 × 10
6) se inyectaron por vía subcutánea en ambos flancos de ratones desnudos. Para el estudio diclofenac, los ratones se asignaron al azar en 2 grupos: control (PBS) o diclofenac (18 mg /kg); 6 ratones por grupo. Los ratones fueron inyectados por vía intraperitoneal dos veces a la semana durante 4 semanas a partir de 3 días después de la inyección de células. Los tumores se midieron dos veces a la semana, comenzando en la semana 1, usando calibradores y W
2L /2 [17] se utilizó para calcular el volumen del tumor. Para el estudio de la indometacina, los ratones se asignaron al azar en 2 grupos: control (agua) o indometacina (2,5 mg /kg); 5 ratones por grupo. La indometacina se administra diariamente en el agua de bebida durante 6 semanas, comenzando el día después de la inyección de células. Los tumores se midieron dos veces a la semana, comenzando en la semana 3, usando calibradores y W
2L /2 [17] se utilizó para calcular el volumen del tumor. Los datos se representan como media ± error estándar. Las concentraciones de diclofenaco e indometacina utilizados para este estudio son similares a otros que han sido previamente demostrado ser eficaz y bien tolerado en ratones [4], [10], [11], [18].
el análisis de microarrays
HEY, células OVCAR5 y UCI-101 se sembraron en placas de 60 mm y se trataron durante 24 horas con 300 mM diclofenaco o indometacina. Se aisló el ARN utilizando el kit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA). El ARN total se utiliza para generar biotina ADNc etiquetados utilizando el kit de iluminación TotalPrep de amplificación del ARN (Ambion, Grand Island, NY) y se analizó mediante microarrays de Illumina (de Illumina Sentrix HumanRef-8 BeadChips expresión) en el Fondo Microarray Core (Instituto Nacional sobre el Envejecimiento). Cada BeadChip tiene 24.000 transcripciones RefSeq bien anotado con un promedio de 30 veces la redundancia. Los genes que son expresados diferencialmente 2 veces o más en las tres líneas celulares se identificaron y un subconjunto de estos genes seleccionados para su posterior análisis. Los datos de microarrays se ha presentado a la NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) de bases de datos (número de acceso GSE45052).
Real-Time RT-PCR
HEY, OVCAR5, y la UCI-101 células fueron tratadas durante 24 horas con diclofenaco 300 M o indometacina. Se aisló el ARN utilizando el kit RNeasy y 1 g de RNA total se usó para generar ADNc utilizando Taqman transcripción reversa Reactivos (PE Applied Biosystems). Para la amplificación PCR y la cuantificación, el ensayo SYBR Green I y el Sistema GeneAmp 7300 de detección de secuencias (PE Applied Biosystems) se utilizaron. Se utilizó el método CT comparativo para determinar el nivel de expresión relativa de los genes en cada muestra tratada NSAID con el valor de TC de muestra sin tratar (PE Applied Biosystems) y los valores de GAPDH fueron utilizados para la normalización [19]. Las secuencias de los cebadores están disponibles de los autores.
Immunoblotting
Las células se lavaron y los lisados celulares se prepararon en tampón de lisis (150 mM Tris-HCl, pH 6,8, 25% de glicerol, y 5% de SDS). Los lisados celulares se separaron mediante SDS-PAGE en 4-12 o 10-20% en geles de Tris-glicina y se transfirieron a membranas de PVDF. Las membranas se bloquearon con TBS-T + leche en polvo 5% no grasa y se incubaron durante la noche a 4 ° C con anticuerpos específicos para las proteínas indicadas. Después de lavar las membranas, se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano. la detección de proteínas se realizó por un aumento de quimioluminiscencia (Amersham, Pittsburgh, PA).
se realizó Estadísticas
prueba de Wilcoxon de rangos con signos para determinar la significación en los estudios del ratón. Para todos los demás análisis, se realizó ANOVA de una vía y la prueba de comparación múltiple de Dunnett. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software Graph Pad Prism 3.
Resultados
AINE disminución viabilidad de las células de cáncer de ovario en una forma dependiente de la dosis
Para determinar si los AINE podrían reducir el crecimiento de las células de cáncer de ovario in vitro, hemos tratado las líneas de células HEY, OVCAR5, y la UCI-101 con el diclofenaco e indometacina AINE. Después de 48 horas de tratamiento, diclofenaco e indometacina redujo el número de células en más de un 50% en las líneas de células tratadas con respecto a las poblaciones no tratados en tres líneas celulares de cáncer de ovario diferentes (Figura 1A). Los efectos de estos AINE fueron dependientes de la dosis, como el aumento de las concentraciones de diclofenaco o indometacina más disminuido el número de células viables (Figura 1B). Además, diclofenaco e indometacina disminuyeron la capacidad de formación de colonias de células de cáncer de ovario (Figura 1C).
A) HEY, OVCAR5 o células UCI-101 se trataron durante 48 horas con 300 mM diclofenaco o indometacina. Las células se incubaron a continuación con reactivos de MTS y la absorbancia a 490 nm se midió después de una incubación de 1 hora a 37 ° C. Se muestra la media de 3 experimentos. La significación estadística se representa como sigue: * p & lt; 0,05 y *** p & lt; 0,001. B) Las células se trataron durante 24 horas con las concentraciones indicadas de diclofenaco o indometacina. La viabilidad celular se midió usando un ensayo MTS. Se muestra la media de 3 experimentos. La significación estadística se representa como sigue: * p & lt; 0,05 y *** p & lt; 0,001. C) Las células se trataron durante 48 horas con diclofenac 300 M o indometacina, se lavaron y se dejaron crecer durante un total de 7 a 14 días. Las células fueron teñidas con violeta cristal. La imagen mostrada es representativo de 3 experimentos.
El diclofenaco e indometacina promueven la detención del ciclo celular y la apoptosis en células de cáncer de ovario
Desde el diclofenaco e indometacina redujo el crecimiento de células de cáncer de ovario, quisimos determinar si esta disminución se debe a alteraciones en el ciclo celular. Diclofenac y detención del ciclo celular inducida por indometacina en las 3 líneas celulares de cáncer de ovario examinados, como se detectó por tinción con yoduro de propidio después de 48 horas de tratamiento (Figura 2A). Los dos AINE tenían diferentes efectos sobre el ciclo celular, como diclofenac indujo una acumulación de células en fase S y G2, mientras que la indometacina arresto G1 inducida en las tres líneas celulares de cáncer de ovario examinados. También se observó una población sub-G1 de las células en las células UCI-101 tratadas con diclofenaco e indometacina y en HEY células tratadas con indometacina, sugiriendo aumento de la apoptosis. Para determinar si estas células sufren apoptosis después del tratamiento con NSAIDs, se trataron las células con el diclofenaco o indometacina durante 48 o 96 horas y la fragmentación del ADN se mide por tinción con Apo-BrdU. Como se muestra en la Figura 2B, UCI-101 células sufren apoptosis después del tratamiento con ambos NSAIDs, mientras HEY células sufren apoptosis solamente con indometacina (Figura 2B). OVCAR5 no se somete a la apoptosis después de 4 días de tratamiento con AINE. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que los AINE reducen el crecimiento de células de cáncer de ovario mediante la inducción de la detención del ciclo celular y la apoptosis.
A) HEY, OVCAR5 y las células de la UCI-101 fueron tratados durante 24 horas con 300 mM diclofenaco o indometacina. Las células se marcaron con yoduro de propidio y se analizaron en un citómetro de flujo FACS calibre. La imagen mostrada es representativa de 4 experimentos. B) Las células se trataron durante 48 ó 96 horas con diclofenac 300 M o indometacina. La apoptosis y el contenido de ADN se ensayaron por BrdU y yoduro de propidio tinción utilizando el kit de Apo-BrdU. Las células en la caja cuadrante superior (puerta P3) representan a la población apoptótica.
Los AINE reducen el crecimiento de xenoinjertos HEY en ratones desnudos
Para determinar si los AINE podrían inhibir el crecimiento tumoral in vivo, se usado un modelo de ratón con xenoinjerto de cáncer de ovario en ratones desnudos. HEY se inyectaron las células por vía subcutánea en ambos flancos de ratones desnudos y asignados al azar en 2 grupos: control (PBS) o diclofenac (18 mg /kg), inyectados por vía intraperitoneal dos veces a la semana, durante 4 semanas. Como se observa, el tratamiento diclofenac redujo significativamente (p = 0,016) el crecimiento de HEY xenoinjertos en ratones desnudos (Figura 3A). El volumen medio del tumor en el grupo tratado con diclofenac se redujo en un 33%, en comparación con el grupo control. Alternativamente, los ratones fueron distribuidos aleatoriamente en el control (agua) o indometacina (2,5 mg /kg) grupos, y drogas administraron diariamente en el agua potable durante 6 semanas. Como se observa, la indometacina significativamente (p = 0,031) redujo el crecimiento de xenoinjertos de HEY en ratones desnudos (Figura 3B). El volumen medio de los tumores se redujo significativamente en un 22% en el grupo tratado con indometacina en comparación con el grupo control. Además, los ratones en el grupo tratado con indometacina desarrollaron menos tumores que el grupo de control, 5 y 9, respectivamente. Tomados en conjunto, estos resultados indican que los AINE disminuyen el crecimiento de células de cáncer de ovario in vivo.
HEY células (1,5 × 10
6) se inyectaron por vía subcutánea en ambos flancos de ratones desnudos. A) Los ratones se asignaron al azar en 2 grupos: control o diclofenac (18 mg /kg). El tratamiento se inició tres días después de la inyección de células y se administró por vía intraperitoneal dos veces a la semana durante 4 semanas. Los tumores se midieron dos veces a la semana, comenzando en la semana 1. El grupo de control (sólo PBS) consistió en 6 ratones que se desarrolló 12 tumores en total; el grupo de diclofenaco (18 mg /kg) consistió en 6 ratones que desarrollaron un total de 11 tumores. Los valores representan la media ± error estándar. La significación estadística se representa como * p & lt; 0,05. B) Los ratones se distribuyeron al azar en 2 grupos: control o indometacina (2,5 mg /kg). El tratamiento se inició el día después de la inyección de células y se administra diariamente en el agua potable durante 6 semanas. Los tumores se midieron dos veces a la semana, comenzando en la semana 3. El grupo de control (sólo agua) consistía en 5 ratones que desarrolla tumores 9 en total; el grupo de la indometacina (2,5 mg /kg) consistía en 5 ratones que desarrollaron un total de 5 tumores. Los valores representan la media ± error estándar. La significación estadística se representa como * p & lt;. 0,05
genes E2F1 y de destino están regulados a la baja en las células tratadas con AINE
Para investigar los genes expresados diferencialmente en células de cáncer de ovario después del tratamiento con AINE , se trataron HEY, UCI-101, y las células OVCAR5 con diclofenaco e indometacina durante 24 horas y se realizó el análisis de microarrays. Los mRNAs expresados diferencialmente (≥2 veces) en las tres líneas celulares se muestran (Figura 4A). Un pequeño subconjunto de mRNAs expresados diferencialmente fue compartido entre las tres líneas celulares, y un pequeño número de mRNAs expresados diferencialmente fueron compartidos por el tratamiento con diclofenaco e indometacina en las tres líneas celulares.
HEY, OVCAR5 y UCI-101 las células fueron tratadas durante 24 horas con diclofenac 300 M o indometacina. A) RNA se analizó por Illumina microarrays. El número de los ARNm que son expresados diferencialmente 2 veces o más en las tres líneas celulares está indicado para el diclofenaco e indometacina tratamientos (en negrita son los ARNm sobreexpresados, que se muestran en letra normal son los ARNm regulados a la baja). B) ARN de las líneas celulares indicadas tratados con diclofenac o indometacina se analizó en tiempo real por RT-PCR. los niveles de ARNm de E2F1 y E2F4 se expresan como factor de cambio en las muestras tratadas en comparación con los no tratados, después de la normalización con GAPDH. Se muestra la media de 3 experimentos. La significación estadística se representa como *** p & lt; 0,001. lisados C) celular de las líneas celulares indicadas que fueron tratados con diclofenac o indometacina se analizaron mediante inmunotransferencia con anticuerpos específicos para las proteínas indicadas. GAPDH se utilizó como control de carga de proteínas.
se encontró que la mayoría de los mRNAs expresados diferencialmente tras el tratamiento con diclofenac ser downregulated, mientras que la mayoría de los genes afectados por la indometacina se upregulated. Dado que el diclofenaco e indometacina inducida por la detención del ciclo celular y la apoptosis, que elegimos para los genes de validación posiblemente implicadas en estos procesos. Se confirmó por RT-PCR cuantitativa, que la expresión de
MCM2
,
MCM4
, y otros mRNAs que codifican proteínas implicadas en la regulación de la replicación del ADN y el ciclo celular se downregulated por diclofenaco (Tabla 1), mientras que
GADD45A
y
PPP1R15A
ARNm, entre otros codifican las proteínas de la apoptosis relevante, se upregulated por la indometacina y el diclofenaco (Tabla 1). Además, se validó mRNAs upregulated mediante la codificación de la indometacina proteínas portadoras soluto SLC1A5 y SLC7A1 (Tabla 1). Sin embargo, los ARNm que mostraron niveles de expresión diferencial solamente por el diclofenaco o indometacina en el análisis de microarrays, se encontraron diferencialmente expresado por ambos fármacos cuando se ensayaron por RT-qPCR (Tabla 1).
Para identificar los factores de transcripción que podría regular la expresión diferencial de estos ARNm, análisis de factor de selección de transcripción se realizó con WebGestalt. WebGestalt (conjunto de genes ANÁLISIS material en línea) es una herramienta en línea (http://bioinfo.vanderbilt.edu/webgestalt/) para analizar conjuntos de genes y el programa de análisis de factor de transcripción objetivo de WebGestalt predice factores de transcripción probable que participan en la regulación de estos genes. Tabla S1 muestra los factores de transcripción más altamente significativas predijeron, junto con los correspondientes genes expresados diferencialmente identificados por microarrays. E2F1, factor nuclear Y y E2F4 fueron los principales factores de transcripción predichos para regular los genes expresados diferencialmente por tratamiento con diclofenac, y se downregulated los ARNm correspondientes. NFAT y AP1 fueron los dos primeros factores de transcripción predijeron para regular los genes afectados por la indometacina, y los mRNAs que codifican estas proteínas eran en su mayoría upregulated.
Para determinar si los AINE tuvieron un efecto sobre la expresión de los factores de transcripción identificados anteriormente , se examinaron los niveles de ARNm y proteínas de factores de transcripción E2F1, NFY, E2F4, NFAT y AP1. De acuerdo con la tendencia registrada anteriormente,
E2F1
ARNm se downregulated en las tres líneas celulares de cáncer de ovario después del tratamiento durante 24 horas con diclofenaco o indometacina, y en particular en las células HEY (Figura 4B). proteína E2F1 también se downregulated, así como proteínas MCM2 y MCM4 (Figura 4C).
NFAT
y
AP1
ARNm eran en su mayoría regulados positivamente (Tabla S2), al igual que sus objetivos transcripcional. Sin embargo, NFAT y la abundancia de proteínas AP1 fue menor (Figura S1), a pesar de mostrar mayores niveles de mRNA. Los niveles de
NFY
y
E2F4
ARNm no se modificaron significativamente (Figura 4B y el cuadro S2).
sobreexpresión de E2F1 aumenta la supervivencia de las células de cáncer de ovario tratados con AINE
Dado que la expresión de ambos genes de su objetivo y E2F1 está regulado por disminución tras el tratamiento con diclofenaco e indometacina, quisimos determinar si E2F1 estuvo involucrado en el crecimiento de los efectos inhibitorios de los AINE en las células de cáncer de ovario. Overexpressed E2F1 en células HEY (Figura 5A) y observó un aumento de la supervivencia tras el tratamiento con diclofenaco e indometacina (Figura 5B). Este experimento sugiere que la regulación por disminución de E2F1 podría estar implicado en la inhibición del crecimiento celular por los AINEs.
A) HEY células fueron transfectadas transitoriamente con E2F1 o eGFP como control y se trataron durante 24 horas con 300 mM diclofenaco o indometacina. Los lisados celulares se analizaron por inmunotransferencia con los anticuerpos indicados. B) HEY células fueron transfectadas transitoriamente con E2F1 o eGFP como control y se trataron durante 48 horas con diclofenac 300 M o indometacina. Las células fueron lavadas y se dejaron crecer y se tiñeron con cristal violeta. La imagen mostrada es representativo de 2 experimentos. C) HEY células fueron tratadas durante 24 horas con diclofenac 300 M o indometacina. Los lisados celulares se analizaron por inmunotransferencia. D) HEY células fueron transfectadas con siRNA Rb y se trataron durante 24 horas con diclofenaco o indometacina. Los lisados celulares se analizaron por inmunotransferencia. E) HEY células fueron transfectadas con siRNA Rb y se trataron durante 48 horas con diclofenac 300 M o indometacina, las células se lavaron a continuación y se dejó crecer y se tiñeron con cristal violeta. La imagen mostrada es representativo de 3 experimentos.
proteína retinoblastoma (Rb) bloquea la progresión del ciclo celular mediante la inhibición de E2F1 y el bloqueo de la activación de la transcripción posterior de los genes importantes para la entrada en la fase S. Se encontró que los niveles de Rb fosforilada se redujeron después del tratamiento con AINE (Figura 5C), indicativo de la activación de Rb. Por lo tanto, hemos tratado de regular negativamente la expresión de Rb para investigar más a fondo si E2F1 estuvo implicado en los efectos de los AINE (Figura 5D), como silenciar Rb usando pequeña (si) ARN de interferencia debe imitar la activación de E2F1. El tratamiento con siRNA Rb aumenta la supervivencia de las células HEY tratados con diclofenaco e indometacina (Figura 5E), lo que sugiere que la inhibición de E2F1 o regulación a la baja podrían estar involucrados en los efectos inhibidores del crecimiento de los AINE en estas células.
Discusión
en este estudio, hemos evaluado los efectos del diclofenaco e indometacina AINE en células de cáncer de ovario y de un modelo de xenoinjerto de ratón. Hasta donde sabemos, no existen informes sobre los efectos de la indometacina en vivo en el cáncer de ovario epitelial. Aquí mostramos que la indometacina redujo significativamente el crecimiento de xenoinjertos HEY en un 22% en ratones desnudos, lo que sugiere que la indometacina puede reducir la progresión del cáncer de ovario in vivo. Además, nos informan de que el diclofenaco reduce significativamente el crecimiento de xenoinjertos HEY. Esto es consistente con un reciente estudio de la presentación de informes que el diclofenaco redujo el crecimiento de células de cáncer de ovario SKOV-3 xenoinjertos [12]. Aunque nuestros resultados están de acuerdo, en nuestro estudio hemos encontrado un poco mejor efecto del diclofenaco (33% frente al 20%) y los efectos fueron notables anteriormente en (después de 4 semanas de tratamiento frente a 8 semanas). Esto podría ser debido en parte a las diferencias en el modo de entrega (intraperitoneal vs en la dieta). En conjunto, nuestros datos demuestran que estos AINEs tienen efectos inhibidores del crecimiento in vivo.
La indometacina y el diclofenaco han demostrado que induce la detención del ciclo celular y la apoptosis en varios tipos de células del cáncer [12], [20], [21 ], [22], [23], [24]. En nuestro estudio, la indometacina y el diclofenaco redujeron el crecimiento de células de cáncer de ovario, al menos en parte a través de la inducción de la detención del ciclo celular en las tres líneas celulares de cáncer de ovario examinados. Diclofenac y la indometacina tenían diferentes efectos sobre el ciclo celular, mientras que indometacina indujo una detención en G1, diclofenac inducida por una acumulación de células en fase S y G2 detención. Los resultados de la indometacina son consistentes con estudios anteriores en los que la indometacina también se ha informado de inducir la detención en G1 en una variedad de células [20], [21], [22], [25]. efectos Sin embargo, sólo dos estudios previos han informado de diclofenac sobre el ciclo celular: en las células de músculo liso, diclofenac inducida G1 detención [22], mientras que en las células de glioma murino diclofenac inducida detención G2 [26]. En nuestro estudio, el diclofenaco indujo una acumulación de células en fase S y G2 detención.
Para hacer frente a la diferencia observada en los efectos del ciclo celular entre diclofenaco e indometacina, hemos intentado identificar las diferencias en la expresión génica después del tratamiento con cada uno droga. Entre los mRNAs validados por RT-qPCR, se encontró que la mayoría de los genes alterados por el tratamiento diclofenac también se expresaron diferencialmente en las células tratados con indometacina. Por lo tanto, se justifican más estudios de estos genes para determinar las causas de las diferencias en los efectos del ciclo celular por diclofenaco e indometacina
.
WebGestalt El análisis de factores de transcripción de los genes expresados diferencialmente por diclofenaco e indometacina predijo que varios de los genes downregulated por diclofenaco son los genes diana de E2F1. E2F1 es un factor de transcripción que controla el ciclo celular, mediante la regulación de la expresión de genes necesarios para la entrada en fase S. E2F1 se sobreexpresa en varios tipos de cáncer, y su sobreexpresión en general se ha asociado con un mal pronóstico [27], [28], [29], [30]. En las mujeres con cáncer de ovario, la sobreexpresión de E2F1 se ha asociado con una menor supervivencia libre de enfermedad y la disminución de la supervivencia general [31], [32]. En estudios anteriores, se pensó que la regulación a la baja de la expresión y /o actividad de E2F1 por NSAIDs para contribuir a los efectos inhibidores del crecimiento de los AINE [20], [33], [34], [35], [36], [37 ]. Se ha informado de que la actividad de E2F1 es downregulated por NSAIDs celecoxib y sulindac [20]. En el mismo estudio, la indometacina no disminuyó la actividad de E2F1 en la línea celular de carcinoma de cabeza y cuello escamoso UM-SCC-1. En este caso, nos informan de que E2F1 se downregulated en los niveles de ARNm y proteínas en las tres líneas celulares de cáncer de ovario examinados por el tratamiento con diclofenaco e indometacina. La sobreexpresión de E2F1 en células HEY células rescatadas de los efectos antiproliferativos de los AINE que conducen a una mayor supervivencia, lo que sugiere que E2F1 media, en parte, los efectos de los AINE. Estos resultados sugieren que el uso de AINE podría ser terapéuticamente relevantes, en particular para un subconjunto de los cánceres de ovario sobreexpresión de E2F1, y que se prevé que tienen un mal pronóstico.
Entre las transcripciones expresadas diferencialmente en diclofenac- y la indometacina células tratadas fueron
MCM2
,
MCM4
,
PCNA
y
RRM2
ARNm, todos ellos objetivos de E2F1 e importante para la replicación y el ciclo celular progresión. Recientemente, se informó de que RRM2, PCNA y MCM2 se downregulated tras el tratamiento con el AINE NS-398 en las células de cáncer de páncreas [38]. Regulación a la baja de MCM2, y otras proteínas MCM había sido informado de inducir G1 y G2 detenciones [39], [40] que contribuye a la inhibición del crecimiento celular. Por lo tanto, es posible que la regulación a la baja de estas proteínas podría contribuir a los efectos antiproliferativos de los AINE en las células de cáncer de ovario en nuestro estudio.
En conclusión, se muestra que el diclofenaco y la indometacina inhiben el crecimiento de células de cáncer de ovario in vitro y en un modelo animal, mediante la inducción de la detención del ciclo celular y la apoptosis. Los efectos inhibidores del crecimiento de diclofenaco e indometacina están mediados en parte por un mecanismo que implica la regulación por disminución de E2F1. Tomados en conjunto, nuestros resultados apoyan la opinión de que el uso de AINE podría ser terapéuticamente beneficioso para el cáncer de ovario.
Apoyo a la Información
Figura S1.
Los niveles de proteína de factores de transcripción NFAT y AP1. HEY, OVCAR5 y las células de la UCI-101 fueron tratados durante 24 horas con diclofenaco (300 M) o indometacina (300 M). Los lisados celulares se analizaron por inmunotransferencia con anticuerpos específicos para las proteínas indicadas
doi:. 10.1371 /journal.pone.0061836.s001 gratis (TIF)
Tabla S1. Los factores de transcripción
predichos por WebGestalt para regular los genes expresados diferencialmente en las células tratadas con diclofenaco e indometacina. Factor de Transcripción análisis objetivo de los conjuntos de genes expresados diferencialmente se realizó utilizando WebGestalt (http://bioinfo.vanderbilt.edu/webgestalt/) para identificar los factores de transcripción posiblemente implicados en la regulación de los genes expresados diferencialmente.