Extracto
Antecedentes
Los perfiles de expresión génica global de las células madre de la próstata murino fetal adultos y se determinaron para definir los reguladores comunes y únicas cuya expresión errónea podría desempeñar un papel en el desarrollo del cáncer de próstata .
Metodología /Principales conclusiones
Un núcleo distintivo de reguladores transcripcionales comunes a ambas células de la próstata primitivas fetales y adultos fue identificado, así como moléculas que son exclusivos de cada población. Elementos comunes a las células madre fetales y de próstata en adultos incluyen los perfiles de expresión de Wnt, Shh y otras vías identificadas en las células madre de otros órganos, firmas del receptor de aril hidrocarburos, y la regulación de los componentes de los ejes de los receptores de aldehído deshidrogenasa /ácido retinoico . También hay una firma metabolismo de los lípidos significativa, marcado por la sobreexpresión de enzimas metabolizadoras de lípidos y la presencia del motivo de unión para SREBP1. La población de células madre fetal, caracterizado por más rápida proliferación y la auto-renovación, expresa los reguladores del ciclo celular, tales como E2F, NFY, Tead2 y Ap2, en niveles elevados, mientras que las células madre adultas muestran una firma en la que TGF-β tiene un papel destacado. Por último, la comparación de las firmas de células de la próstata primitivos con los perfiles previamente descritos de tumores de próstata humanos identificados moléculas de células madre y las vías de expresión desregulada en los tumores de próstata incluyendo modificadores de la cromatina y el oncogén, Erg.
Conclusiones /Importancia
Nuestros datos indican que las células madre o progenitoras de adultos de próstata pueden adquirir características de las células de la próstata fetales primitivas auto-renovación durante la oncogénesis y sugieren que la activación aberrante de componentes de las vías de células madre de la próstata puede contribuir al desarrollo de tumores de próstata.
Visto: Blum R, R Gupta, Burger PE, Ontiveros CS, Salm SN, Xiong X, et al. (2009) Molecular Firmas de células madre de la próstata Reveal novedosas vías de señalización y proporcionar información sobre el cáncer de próstata. PLoS ONE 4 (5): e5722. doi: 10.1371 /journal.pone.0005722
Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 13 Febrero, 2009; Aceptado: 3 Abril 2009; Publicado: 29 de mayo de 2009
Derechos de Autor © 2009 Blum et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud, CA132641 (ELW), CA 90593 (DM), Servicio Nacional de Investigación Premio (NRSA) de los Institutos nacionales de Salud, Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y renales, 5F32DK071468 (OSC), Amgen Inc. y la Helen L y S Martin Kimmel Center de Biología de células Madre de la Facultad de Medicina de la Universidad de Nueva York. científicos de Amgen tenían un papel en este estudio mediante la participación en el análisis de los datos y en la preparación del ARN usado en los experimentos mircroarray. No hay otros donantes tenían un papel en este estudio
Conflicto de intereses:. Entre otros apoyos este trabajo también fue apoyado por una beca de investigación de Amgen Inc. (no hay un número para la esta subvención). Un número de nuestros colegas de Amgen también fueron colaboradores en este proyecto. Estos colaboradores participaron en el análisis de los datos de microarrays y en la preparación del ARN usado en los experimentos de microarrays. El papel específico de cada autor se detalla en la sección correspondiente dedicado a las funciones de los autores.
Introducción
Es probable que la proliferación aberrante de células madre de próstata (PSC) y /o sus progenitores contribuye a la patología de la próstata. Se determinó la expresión génica firmas de PSC fetal y adulto (FPSC y APSC) para obtener información sobre las vías de señalización que caracterizan estas poblaciones de células madre dos normal (SC) y estos perfiles en comparación con los de las células de tumor de próstata. La delimitación de estas vías de regulación puede proporcionar información sobre los mecanismos que convierten las células de la próstata adulta en reposo en un compartimento proliferante que da lugar a la hiperplasia benigna de próstata y carcinoma permitiendo de este modo la focalización de las vías específicas para tratar estas enfermedades.
Hemos demostrado que las células epiteliales con características SC se concentran en la región proximal ductal, adyacente a la uretra [1] - [3]. Estas características incluyen la quiescencia, alto potencial proliferativo y la capacidad de las células individuales para dar lugar a estructuras ductales que contienen tanto basal y las células luminales [2] - [4]. Hemos aislado anteriormente, basado en la expresión de Sca-1 [2], dos poblaciones de células que son capaces de regenerar el tejido prostático en un
vivo
ensayo de reconstitución de próstata en. La primera población, las células madre, tiene considerable potencial de crecimiento, no requiere andrógenos para la supervivencia, expresa altos niveles de Sca-1 y reside en la región proximal de los conductos. Casi todas las células Sca-1
Hi también expresan la integrina α6, un antígeno expresado en células de la próstata primitivos [2] - [4]. La segunda población, las células de tránsito de amplificación, tiene potencial de crecimiento más limitado, expresa niveles más bajos de Sca-1, requiere andrógenos para la supervivencia y se encuentra en todas las regiones ductales [2], [3]. Un tercio de la población, las células madre de la próstata fetales, existe en el seno urogenital de la que se desarrolla la próstata [5]. La capa interna de las células epiteliales del seno urogenital murino comienza a invadir la capa externa de mesénquima para formar los conductos de la glándula prostática después de E16. Antes de este evento, el epitelio del seno urogenital (UGE) que contiene células de la próstata fetales primitivos se puede aislar fácilmente del seno urogenital.
Con el fin de identificar las moléculas y las vías que están activos en las poblaciones primitivas de próstata se determinó la transcripción perfiles de cuatro poblaciones de células: (i) UGE, enriquecido en FPSC, (ii) Sca-1
Hi, las células que expresan altos niveles de Sca-1, enriquecidos en APSC [2], [6], (iii ) Sca-1
Lo, las células que expresan medio a niveles bajos de Sca-1 y se enriquecen en células de tránsito de amplificación de [2], y
Neg, células (iv) Sca-1 sin Sca-1 expresión, que representan la población más madura y casi no tienen potencial de regeneración [2]. Para obtener una perspectiva de las capas de regulación transcripcional de las redes activas en las células de la próstata primitivos, se realizó una pantalla computacional de cis-regulador promotor motivos [7] para revelar los que se enriquecen de manera significativa entre los genes del PSC. También se identificaron genes categorías funcionales que se enriquecen en las células primitivas.
Las poblaciones SC fetales y adultos expresado numerosos genes relacionados con el SC-conocidos. Nuestro análisis reveló un enriquecimiento significativo de varios motivos sitio de unión a factor de transcripción (TF) en los promotores de los genes expresados. Los datos indican que la FPSC y APSC tienen transcripcional programas únicos y comunes e identificar un número de las principales características que permiten el mantenimiento y la auto-renovación del estado indiferenciado. Varios de los genes relacionados con las células madre se identifican también puede participar en el desarrollo de tumores de próstata, lo que indica que estas moléculas pueden delinear un subconjunto de tumores con un más primitivo y, posiblemente, un fenotipo más agresivo.
Materiales y Métodos
preparación de las células, anticuerpos y análisis FACS
Ética comunicado.
Todos los cuidados y procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con los requisitos de la junta de revisión institucional de la Universidad de Nueva York.
la región proximal de conductos prostáticos (es decir, la porción de los conductos más cercanos a la uretra) de 6 semanas de edad C57BL /6 ratones fueron digeridos y se examinaron las células para la expresión del antígeno (Tabla S1) [1], [2]. células Sca-1-etiquetados fueron ordenados por FACS utilizando un clasificador de DakoCyomation MoFlo en 3 poblaciones de acuerdo a la intensidad media de fluorescencia (MFI) de Sca-1 de expresión [2]. Las células (10.000-50.000) con la más alta IMF (25%; Sca-1
Hi), medio /bajo IMF (40%; Sca-1
Lo) y los que carecen de Sca-1 de expresión (25%; Sca-1
Neg) se recogieron en TRIzol (Invitrogen). UGE se aisló a partir del seno urogenital de 16 días de edad embriones C57BL /6 murinos [8] y se añadió a TRIzol. Los niveles de expresión de ALDH se determinaron mediante análisis FACS después de la tinción con el kit de reactivos Aldefluor (StemCell Technologies).
Real-Time PCR
Uno g de ARN total fue inverso-transcrito a 52 ° C durante 1 hora usando el sistema de RT-PCR Thermoscript (Invitrogen). 20 ng de cDNA resultante se utilizó en una reacción de Q-PCR usando un iCycler (Biorad) y pre-diseñados ensayos de expresión TaqMan Gen (Applied Biosystems). valores de umbral de ciclo a partir de tres muestras de ARN separadas se promediaron; cantidades de diana fueron interpolados a partir de curvas estándar y normalizado a hipoxantina guanina fosforribosil transferasa.
El aislamiento de ARN y la hibridación de microarrays
Hemos establecido los perfiles de transcripción de la UGE, Sca-1
Hola, CEA- 1
lo, y para las células diferenciadas del Sca-1
Neg. Tres repeticiones de UGE (FPSC) y Sca-1
Hola muestras (APSC) y cuatro repeticiones de Sca-1
Lo y Sca-1 se analizaron muestras
Neg. Se aisló el ARN mediante procedimientos estándar y su calidad se evaluó utilizando un Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). Las muestras con un número de ARN de Integridad (RIN) & gt; 7,0 se consideraron adecuados para el etiquetado y 20 ng se marcaron utilizando el kit de dos ciclos objetivo de etiquetado GeneChip (Affymetrix). Diez microgramos de cRNA marcado y fragmentado se hibridan con el genoma del ratón MOE430 2.0 array (Affymetrix), que interroga ~45,000 transcripciones. los datos de expresión cruda (archivos CEL) se generaron utilizando GCOS 1.4 (Affymetrix). Los datos mencionados en esta publicación se han depositado en Gene Expression Omnibus de NCBI y son accesibles a través de GEO serie número de acceso GSE15580 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE15580) .
Análisis de los datos de expresión de genes
Utilizando ArrayAssist (Stratagene), archivos de Affymetrix CEL primas fueron procesados por la aplicación del algoritmo MAS5, para asignar llamadas de detección (Presente /Marginal /ausente) para cada sonda conjunto que se utilizaron posteriormente en el filtrado de datos de bajada. Para generar los niveles de expresión normalizados, se utilizó el algoritmo PLIER (sonda de error de intensidad logarítmica), un modelo basado en, estimador de señal de múltiples matrices que produce valores de la señal de sonda-set más precisos [9]. La combinación de estos parámetros anteriormente citados se utilizó para el filtrado de datos para obtener 33.967 "
genes válidos
", que representa transcripciones (sondas de genes) con señales de & gt; 20 cuando se presenta en al menos una muestra. Para obtener un subconjunto de genes variables, se calculó el coeficiente de variación (CV) para cada una transcripción y generamos un conjunto de 5095 "
genes activos
" que contiene las transcripciones de la más alta (15% del total) CV puntuaciones. Para centrarse en los genes que se han alterado de manera estadísticamente significativa, las muestras se agruparon según el tipo de células (UGE, Sca-1
Hola, Sca-1
Lo, Sca-1
Neg), intensidades de los
gen activo
transcripciones fueron log2-transformado y se sometieron a análisis estadísticos adicionales que utilizan dos pruebas diferentes: (a) un modelo lineal utilizando un Benjamini-Hochberg corrección (
p Hotel & lt; 0.05) y (análisis b) la importancia del método de microarrays (SAM) con una tasa de falso descubrimiento del 5%. Esto proporcionó una lista de 3137 "
genes importantes
", que representa transcripciones que coincidan con los criterios de estas dos pruebas estadísticas. Un análisis principio componentes (PCA) (media centrada) calculado por ArrayAssist, mostró una reproducibilidad y la separación apropiada dentro de los diferentes tipos de células (Figura S1). Para definir las características distintivas de la UGE, Sca-1
Hi y Sca-1
poblaciones Lo, se comparó la intensidad de la expresión génica lee (muestras agrupadas) de cada una de estas poblaciones con la de las células adultas más diferenciadas (Sca-1
Neg) usando un T-test no pareado (Benjamini-Hochberg corregida
p Hotel & lt; 0,05). Tres subconjuntos de genes (UGE, Sca-1
Hi y Sca-1
Lo) que contiene transcripciones cuya expresión aumento (& gt; 1,75 veces) con respecto a su expresión en células Sca-1
se generaron células Neg .
Análisis de categorías funcionales
Hemos utilizado anotaciones funcionales de los genes murinos que proporciona el genoma murino Informática, que utiliza el vocabulario estándar introducido por el consorcio de ontología de genes (GO). categorías funcionales enriquecidos (
p
≤0.01, después de la corrección de múltiples ensayos) fueron identificados en cada uno de los tres grupos (
UGE-
única,
UGE + Sca-1
Hola
,
Sca-1
hi-solamente
) usando expansor, en el que se utiliza el cálculo hipergeométrica para determinar excesivamente representados GO categorías funcionales en un objetivo fijado en relación con un conjunto de fondo (la totalidad colección de genes murinos putativo) [7]. Para evitar sesgos, los genes representados por múltiples conjuntos de sonda se cuentan una sola vez.
Análisis computacional de elementos reguladores cis-promotor
Para el análisis de promotor aplicamos EXPANSORA [7] para detectar promotor cis-reguladores elementos que controlan las alteraciones transcripcionales observados en los grupos de expresión génica. Dada objetivo y fondo conjuntos de promotores, el expansor realiza pruebas estadísticas para identificar TFS cuyas firmas sitio de unión son significativamente más representadas en el objetivo fijado en relación con el fondo (enriquecimiento TF está indicada por
p-valor
) [7 ]. Ambas cadenas de cada promotor se analizan en busca de supuestos sitios de unión (que abarca el sitio de inicio de la transcripción a partir de 1000 pb aguas arriba de 200 pb aguas abajo). Los enriquecimientos identificados en este estudio fueron robustos, ya que se mantuvieron estables en un amplio intervalo de valores de umbral.
Comparación de los datos a SC-perfiles conocidos
se utiliza Entrez Gene IDs y UniGene identificadores únicos para que coincida con los genes representados en diferentes plataformas de microarrays. Marcamos el número de genes que son comúnmente hasta reguladas en los perfiles de expresión génica y en al menos otro perfil SC.
Resultados y Discusión
perfiles de expresión génica en tres madre de la próstata /poblaciones enriquecidas de células progenitoras
se aisló ARN de las cuatro poblaciones de células descritas anteriormente (UGE, Sca-1
Hola, Sca-1
Lo y Sca-1
Neg), preparados para hibridación a microarrays y se analizaron como se describe en Materiales y Métodos. Tres subconjuntos de genes (UGE, Sca-1
Hi, Sca-1
Lo) se generaron que consiste en transcripciones cuya expresión fue elevado estadísticamente en cada una de las poblaciones relativas a su expresión en el más diferenciada Sca-1
Neg población de células (Figura 1, Tabla S2). El subconjunto FPSC tiene el mayor número de transcripciones alterado de manera significativa (1286 sondas de genes), como se puede esperar cuando se compara un SC fetal con una población de células adultas diferenciadas. El subconjunto APSC (Sca-1
Hi) tiene 641 y el subconjunto de tránsito de amplificación (Sca-1
Mín; más diferenciado que el subconjunto APSC) tiene sólo 144 transcripciones que se expresan de forma diferente. Esto nos permitió determinar si se podría discernir patrones de expresión comunes entre estos tres subconjuntos progenitoras y patrones que eran únicos para cada subconjunto. Intersección de las transcripciones regulados hasta dentro de los tres subconjuntos dio lugar a la generación de cuatro grupos (
UGE-
única,
UGE + Sca-1
Hola
,
CEA- 1
Hi-
única,
Sca-1
Hola
+
Sca-1
Lo
) de los genes expresados mutuamente o exclusivamente (Figura 1, Tabla S3). El patrón de expresión génica más distintivo se deriva de la población de células UGE, manifestada por 1050 transcripciones que se sobreexpresan exclusivamente en el de sólo UGE
grupo (cluster FPSC)
. Un segundo patrón distintivo fue evidente en el Sca-1
Hola subconjunto, representado por la exclusiva sobre regulación de 296 transcripciones en el
Sca-1
Hi-
única agrupación (cluster APSC). Curiosamente, dentro de la agrupación que se superpone entre el feto y los subconjuntos de adultos, el
UGE + Sca-1
Hola
grupo, se encontró un número sustancial de las transcripciones (209) que eran comúnmente hasta reguladas, mientras menor homogeneidad de las transcripciones (112) se observó en el grupo que se superpone (
Sca-1
Hola
+
Sca-1
lo
clúster) entre el subconjunto APSC (CEA- 1
Hi) y el subconjunto TA (Sca-1
lo) (Figura 1, Tabla S2). Muy pocas transcripciones (5) se sobreexpresa distintivamente en la población más diferenciado (
Sca-1
Lo-solamente
clúster). Estos resultados representan prominentes transcripciones de genes específicos de la etapa expresadas durante la maduración de las células de la próstata, a partir de la población fetal más primitivo (UGE), y progresando a través de la población APSC (Sca-1
Hi), y su progenie, el tránsito -amplifying células (Sca-1
lo), y culminando con el subconjunto más diferenciada (Sca-1
Neg).
Un diagrama de Venn que detalla el número de transcripciones (sondas de genes) de sobreexpresa genes compartidos y distinta entre UGE, Sca-1
Hi y Sca-1
subconjuntos Lo. El número de transcritos dentro de cada subconjunto se indica entre paréntesis fuera del gráfico Venn. El número de transcripciones dentro de cada grupo se da en cursiva dentro de las rebanadas de diagrama de Venn. El número de genes anotados que aparecen en cada uno de los cuatro grupos se dan en la tabla de inserción. Se presenta el dendograma correspondiente de cada grupo.
A. La expresión de marcadores en SC madre prostática /progenitoras grupos
Nuestro análisis para la descripción indica que todos los subconjuntos /progenitoras enriquecido tres madre contienen un número considerable de marcadores conocidos de PSC murino, es decir,
Trp63
,
CD200
,
CTNNB1
,
Smo
,
KRT5
,
KRT14
,
ITGA6
/
CD49f
,
Cd44
,
Kit
,
Bcl2
, y
Cd34
[10] (Figura 2 A, B, Tabla S4). Una comparación de 11 marcadores PSC conocidos que son regulados hasta en nuestros subconjuntos con un panel de 15 genes de limpieza murinos comunes, cuya expresión no se vio alterada, confirma que nuestros perfiles reflejan una firma transcripcional específico de FPSC primitivo y APSC (Figura 2, Tabla S4). Además, transcripciones para un receptor ephrin,
EphB3
, y dos ligandos ephrin,
Efna5
y
EfnB2
, que actúan como coordinadores de la migración y proliferación de la SC intestinal nicho [11] están regulados tanto en la FPSC y poblaciones APSC (Figura 2B). análisis FACS de Sca-1
Hi y Sca-1
células Lo validado el aumento de la expresión de varios antígenos de células madre predichos por la micromatriz (Figura 3A), incluyendo marcadores de células madre a6 y beta 4-integrinas [12], queratina 5, Bcl-2, β-catenina [10], Sox2 [13] y CD34 [14] (Figura 3B). Esto indica que los cambios en los niveles de mRNA de muchos SC-marcadores se reflejan en cambios en sus niveles de proteína.
A. perfiles de expresión de moléculas descritas como se expresan en las poblaciones primitivas de próstata que fueron regulados hasta al menos 2 veces (panel superior) en las células de la UGE, Sca-1
Hi y Sca-1
Lo se presentan. Cada columna representa una muestra individual, y cada fila representa un gen específico. Rojo (alto), verde expresión relativa (bajo); negro indica la igualdad de expresión en relación con las células Neg Sca-1
. El panel inferior presenta un cassette de 15 genes de limpieza murinos comunes que se manifiestan expresión estable en todas las muestras. Entrar relación de los valores (LR) se presentan en la Tabla S3. B. Perfiles de expresión de marcadores conocidos (SC
Egon
y
FatiGO
encuesta), que fueron hasta reguladas por al menos 2 veces en muestras madre de la próstata /progenitoras enriquecido. Cinco patrones de expresión pueden ser distinguidos. LR valores se presentan en la Tabla S5.
A. nivel de transcripción de marcadores SC en células de la próstata primitivas y progenitoras. microarrays de datos de marcadores SC de estas poblaciones de células primitivas se expresan como valores LR relativo [media ± DE] para madurar muestras Sca-1
Neg. B. Expresión de Antígeno de marcadores SC en Sca-1
Hi y Sca-1
Lo células. El análisis FACS de Sca-1
Hi y Sca-1
Lo células determina la expresión de marcadores SC (indicado en A) en estas poblaciones. enriquecimiento de los valores [media ± DE] se expresan como el cambio veces en la expresión del antígeno en relación con la expresión del antígeno de la Sca-1
población de células maduras Neg.
Para determinar si los genes relacionados adicional SC se expresaron en los subconjuntos de próstata madre /progenitoras, se utilizaron dos enfoques. En primer lugar, hemos utilizado dos herramientas bioinformáticas (
Egon
y
FatiGO
[15]) para la identificación de los genes anotados como de Células Madre-genes basados en publicaciones anteriores. Este estudio indica que todos nuestros /subconjuntos relacionados progenitoras-madre (UGE, Sca-1
Hola, Sca-1
Lo) expresan una serie de marcadores de células madre (un total de 67 genes) (Figura 2B; Tabla S5 ). Nuestro segundo enfoque para determinar la naturaleza primitiva de los perfiles incluyó una comparación sistemática de nuestro perfil con otros cinco perfiles de expresión génica a partir de embriones (ESC), hematopoyéticas (HSC), neuronal (NSC) [16], [17], la piel [18 ] y [19] las células madre hepáticas. Se encontró que un número significativo de los ARNm expresados en los grupos de próstata madre /progenitoras fueron también hasta reguladas en al menos uno de los cinco perfiles SC publicadas (que van desde el 40% de los
UGE-sólo
ARNm al 20% de la
Sca-1
Hola + Sca-1
lo
ARNm) (Figura 2B, las Tablas 1, S6). Por lo tanto, a pesar de las limitaciones de la comparación de los datos obtenidos utilizando diferentes condiciones experimentales y microarrays menos amplio que se utiliza en nuestro estudio, hemos detectado un alto grado de solapamiento entre los genes sobreexpresados en los perfiles de células madre /progenitoras de la próstata y los que se sobreexpresa en otros perfiles SC. Esto implica que las células madre /progenitoras de próstata comparten numerosas características con SC aislado de otras fuentes. Sin embargo, las células madre /progenitoras de próstata también expresan los genes no identificados en cualquiera de estas cinco poblaciones SC que indica que algunos de estos genes pueden ser exclusivas de próstata o puede ser compartida con otros perfiles SC no descritas. En particular, los dos enfoques utilizados en la estimación del enriquecimiento SC-marcador indican que, si bien existe una considerable sobrerrepresentación de genes relacionados con el SC-en adultos Sca-1
células Hola, hay una representación aún más alto de SC-marcadores en las células de UGE. Curiosamente, una comparación con dos estudios 'stemness firma "[16], [17] indica que el perfil PSC tiene un mayor solapamiento con ESC o perfiles NSC, que con HSC. Por ejemplo, la comparación con los datos de Ramalho-Santos et al [17] indica que 14,4% y 16,1% de los ARNm enriquecido-PSC se solapan con los mRNAs Esc- y enriquecidos con NSC respectivamente, mientras que un menor número de mRNAs (6,8%) se superponen con transcripciones enriquecido-HSC (Tabla 1). Varios estudios recientes han demostrado que los perfiles de expresión génica de los CES y NSCs solaparse entre sí en mayor medida que con HSC [17], [20]. Por consiguiente, nuestros resultados sugieren que el linaje progenitor de próstata puede parecerse a la de progenitores neuronales o embrionarios en un grado mayor que el de progenitores hematopoyéticos.
La presencia de un número significativo de genes SC en nuestra APSC y FPSC sugiere que estas poblaciones tienen las características de las células progenitoras no diferenciadas. Se determinó siguiente, los perfiles moleculares de las poblaciones aisladas PSC para descifrar potenciales vías de señalización que son expresadas por estas células.
B. Identificación de las categorías funcionales excesivamente y promotor motivos TF-vinculante dentro de los grupos de genes que se sobreexpresan en las células madre /progenitoras
Para identificar los principales procesos biológicos y las redes de transcripción dentro de los tres grupos que contienen SC-(
UGE-
única,
UGE + Sca-1
Hola
,
Sca-1
Hi-solamente
; Figura 1) se aplicó el paquete de expansión para funcionales y el análisis de promotor. Un número de categorías funcionales y promotor motivos TF-vinculante se enriquecen de manera significativa en estos grupos (Tablas 2, S7).
a) la firma auto-renovación en la FPSC
El
UGE de sólo
clúster está altamente enriquecido en genes de proliferación celular, como sería de esperar para una población fetal expansión (Tablas 3, S7,8). Sobre regulación de
Mki67 gratis (12 veces) exclusivamente en el subconjunto UGE da fe de que estas células están proliferando. vías relacionadas con el ciclo de proliferación de células y se encuentra elevado en la auto-renovación de SC normal [21]. PTEN eliminación, que alargan la reserva de auto-renovación NSC [21], revela una firma SC-auto-renovación (231 genes) de estas células. Cabe destacar que aproximadamente el 64% de estos genes son también hasta reguladas en el
UGE sólo
clúster, que denota una gran similitud en la expresión de genes entre estas dos poblaciones de auto-renovación (Tabla S9). Componentes, así como los genes diana, de la vía /β-catenina vía que promueve la auto-renovación en muchos tipos de Carolina del Sur [22] hay una importante presencia en la FPSC y APSC (Tablas 3, S10). La activación aberrante de esta vía en los tumores de próstata [23] y su enriquecimiento en PSC es consistente con la noción de que el cáncer de próstata puede surgir en el compartimiento primitivo. qPCR análisis validado los perfiles de expresión de genes, lo que indica que la expresión de
Wnt4
se eleva en FPSC (5 veces) y APSC (8 veces) con respecto a las células maduras (Sca-1
Neg). Además,
Wnt6
se eleva en FPSC (22 veces), y se eleva en Fzd6 FPSC (5 veces) y APSC (3 veces) con respecto a las células (Tabla S11) madurar. Componentes de la vía hedgehog sonic (Shh), que también está implicada en la auto-renovación de células primitivas [24] y la supresión de la diferenciación, se manifiestan en FPSC y APSC (Tablas 3, S12). La abundancia de SHH reguladores y genes diana que están regulados en marcha en la FPSC y APSC indica que la señalización hedgehog autocrina puede desempeñar un papel importante en la progenitora de próstata /biología de células madre. qPCR análisis valida los datos de expresión génica e indica que
Shh
y
Gli3
expresión se incrementan en fetal (35 veces y 4 veces, respectivamente) y adultos (6 veces y 3 veces respectivamente) SC relativa para madurar células (Tabla S11). señalización de Hedgehog es importante para el crecimiento normal de próstata y aumenta durante la tumorigénesis de próstata en concierto con un aumento de los marcadores de células progenitoras [25], lo que implica de nuevo que las células primitivas pueden expandirse durante la tumorigénesis.
sitio de unión TF- el análisis de los promotores de los genes que son regulados hasta dentro de la FPSC (
UGE sólo
clúster) identifica dos reguladores de la transcripción del ciclo celular, es decir, E2F y NFY (Tablas 2, S13), en consonancia con exceso representación de los genes de auto-renovación (Tablas 3, S7) [20]. Es importante destacar que, el aumento de los niveles de ARNm que codifican cuatro miembros de la familia E2F se observan a lo largo de numerosos genes que son dianas específicas de E2F3 (Tabla 3). El análisis por PCR cuantitativa confirma que
su gen diana representativa, E2F3 gratis (3 veces) y
Cdc2a gratis (12 veces), están regulados en las células de UGE en comparación con las células maduras (Tabla S11). Curiosamente, la expresión de E2F3 está asociada con la auto-renovación de murino trofoblasto SC [26], la expansión de SC en la columela y raíces laterales tapas de Arabidopsis [27], y un mal pronóstico en el cáncer de próstata [28]. La firma de unión-motivo para NFY también está bien representada en los promotores de genes FPSC y es de acuerdo con el aumento de la transcripción de Nfya y nfyb subunidades y el hallazgo de que Nfya es un potente inductor de HSC auto-renovación [29].
firmas promotoras adicionales que están enriquecidos en el
UGE-
única agrupación son las de Ap2 y del factor de dominio que contienen TEA embrionaria (ETF), también conocido como Tead2 (Tablas 2, S13). En la expresión de FPSC
ETF
/
Tead2
y su coactivador,
YAP1
, se incrementaron en un 4 y 2 veces respectivamente. El aumento de la expresión de
Tead2
(4 veces) en FPSC relación a células maduras fue verificado por qPCR (Tabla S11). Tead2 induce genes que promueven la auto-renovación de las células progenitoras en el epitelio olfativo [30] y es esencial durante el desarrollo embrionario murino [31]. transcripciones Ap2 son elevados 3 veces y un número de sus genes diana se incrementan (Tabla 3). Ap2 promueve la proliferación a través de la diferenciación y es un marcador de pluripotencia SC y [32]. Por lo tanto, E2F, NFY, Tead2 la AP2, son propensos a estar involucrados en la auto-renovación y expansión de la población de próstata primitiva.
b) de TGF-ß firma señalización en APSC
En contraste a la abundancia de genes de proliferación presentes en la población de UGE, la expansión en APSC (Sca-1
Hola subconjunto) nos encontramos con que los genes diana TGF-β están regulados al alza que indica que la señalización de TGF-β es una característica destacada de la APSC. Se documentó previamente que el mantenimiento de la latencia de APSC depende de la Smad2 /3 vía de TGF-β /señalización [33]. De manera significativa, nuestro análisis promotor cis-elemento identifica enriquecido para Smad y Smad3 en el
Sca-1-sitios de unión
Hi-
única agrupación, mientras que los sitios similares estuvieron ausentes de la
UGE-solamente
racimo (Tabla 2), lo que indica que el TGF-β /Smad de señalización puede tener un papel predominante en la APSC.
El nivel de expresión de
Itgb6
, una integrina que se une y activa TGF β [34] es regulada hasta 3 veces en la APSC (Tabla 3). Además, un aumento en los niveles de expresión de
IGFBP3 gratis (14 veces), que fosforila Smad3 [35], se observa exclusivamente en el Sca-1
Hola subconjunto. Validación por qPCR (3 veces; Tabla S11) y el análisis FACS (3 veces; Figura 3B) confirma que el TGF-β gen diana clusterina (Clu) es hasta reguladas en APSC. Nuestro análisis también identifica promotor sobrerrepresentación del motivo SMAD3 en los promotores de genes de la UGE + Sca-1
clúster Hi (Tabla 2), lo que indica que el TGF-β también puede mediar la señalización en la FPSC. Como segundo método para determinar la posible implicación de la señalización de TGF-β en células de la próstata primitivos, se compararon los genes de los tres grupos de SC-enriquecido (
UGE-
única,
UGE + Sca-1
Hola
y
Sca-1
Hi-
solamente) con la firma de TGF-β impulsada a partir de queratinocitos [36]. Estas comparaciones indican que aproximadamente el 14% de los genes en cada uno de estos tres grupos analizados puede ser blancos TGF-β (
UGE sólo
112/823;
UGE + Sca-1
Hola
19/130;
Sca-1
Hi-solamente
23/172 genes) (Tabla S14), el apoyo a la contribución de la señalización de TGF-β en la FPSC, además de su papel destacado en la APSC (Tabla 3). En este sentido, es importante tener en cuenta que
Smad2
y
Smad3
, los dos principales mediadores de la transcripción de TGF-β, son exclusivamente hasta reguladas en la UGE (Tabla 3). La representación prominente del sitio de unión motivo Smad en los promotores de genes que están regulados en el APSC (Sca-1
Hola clúster sólo) indica que la vía de señalización de TGF-β es muy relevante para el programa transcripcional de estas células y apoya el hallazgo de que el TGF-β mantiene la quiescencia de APSC [33]. Natl. Acad. Sci.