Extracto
Las propiedades mecánicas de los tumores y el ambiente del tumor proporcionan información importante para la progresión y la caracterización del cáncer. Los tumores están rodeados por una matriz extracelular (ECM), dominado por colágeno I. Las propiedades geométricas y mecánicas de la ECM desempeñan un papel importante para la etapa inicial en la formación de metástasis, presentado por la migración de células malignas hacia nuevos asentamientos, así como el sistema vascular y linfático. El alcance de esta invasión de células en el ECM es un marcador para el pronóstico médico tecla cáncer.
In vivo
estudios revelan un aumento de la rigidez y diferente arquitectura del tejido tumoral en comparación con sus homólogos sanos. La organización de colágeno paralelas observado en la frontera del tumor y la disposición radial en la zona de invasión ha planteado la cuestión acerca de los mecanismos de organización de estas estructuras. Aquí se estudia el efecto de las fuerzas de contracción se originó a partir de esferoides tumorales modelo incrustados en un colágeno I biomimético matriz. Mostramos que las fuerzas contráctiles actúan inmediatamente después de la siembra y deforman la ECM, lo que conduce a fuerzas radiales de tracción dentro de la matriz. La relajación de la tensión a través de este corte el colágeno reduce invasión, que muestra una relación mecánica entre el estado de tensión de la ECM y la invasión. A su vez, estos resultados sugieren que las fuerzas de tracción en el ECM facilitan la invasión. Además, la contracción simultánea de la ECM y el crecimiento tumoral conduce a la condensación y la reorientación del colágeno en la superficie del esferoide. Se propone un modelo basado en la tensión de explicar la organización del colágeno y el inicio de la invasión de las fuerzas provenientes del tumor
Visto:. Kopanska KS, Alcheikh Y, R Staneva, Vignjevic D, T Betz (2016) a la tracción las fuerzas originadas por el cáncer esferoides Facilitar la invasión tumoral. PLoS ONE 11 (6): e0156442. doi: 10.1371 /journal.pone.0156442
Editor: Adam J. Engler, Universidad de California, San Diego, Estados Unidos |
Recibido: 28 Diciembre, 2015; Aceptado: 13-may de 2016; Publicado: 7 Junio 2016
Derechos de Autor © 2016 Kopanska et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Los datos pueden puede acceder desde:. https://osf.io/up847/
Financiación: Este trabajo ha recibido el apoyo en el marco del programa «Investissements d'Avenir» puesto en marcha por el Gobierno francés y puesto en práctica por la ANR con las referencias de la ANR - jcjc SVSE 5 2011 (TB) y PSL LABEX CelTisPhyBio ANR-10-LBX-0038 ANR-10-IDEX-0001-02 (TB, KK y DV), las células en movimiento Cluster de Excelencia (EXC 1003 - CIM) de la Universidad de Münster, Alemania (TB), Cancer Institut Thématique Multi-organismes - plan de cáncer de 2014-2019 y la Ecole du Vivant Doctorale Fronteras (FdV) - Programa de Bettencourt (RS). El intravital de imágenes fue apoyado por la Fundación para la Investigación Médica (FRM N ° DGE20111123020), el Cancerople-IDF (n ° 2012-2-EML-04-IC-1), INCA (Instituto Nacional del Cáncer, n ° 2011-1 -label-CI-4), y Siric (Inca-DGOS- 4654), PICT-IBISA y Nikon Imaging Center @ CNRS-Institut Curie
Conflicto de intereses:. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia.
Introducción
la metástasis es la causa principal de muerte para los pacientes con cáncer y el resultado final de un proceso de múltiples pasos que implica la invasión local del tumor, la diseminación de las células tumorales a órganos distantes y una adaptación a diferentes tejidos [1]. Los mecanismos de la invasión han sido ampliamente estudiadas en el pasado [2]. células invasoras a menudo presentan características epitelial a mesenquimal transición (EMT), marcadores, tales como abajo regulación de la E-cadherina y la regulación positiva de la vimentina, y pierden algunas características epiteliales, como apical- polaridad basal [3].
microambiente tumoral se caracteriza por propiedades mecánicas distintivas en comparación con los tejidos sanos. La matriz extracelular (ECM), compuesta principalmente de colágeno [4], se acumula en el estroma del tumor y es responsable del aumento de la rigidez observada en muchos tumores [5]. La progresión tumoral también es acompañada por un arquitecturas distintas de colágeno [6], denominado firmas de colágeno asociados a tumores (TACS), que han sido correlacionadas con el pronóstico del paciente. Inicialmente, hay un aumento en cantidades de colágeno en el tejido circundante (TACS-1). En los estados posteriores fibras de colágeno se alinean paralelos a la superficie del tumor (TACS-2) [4-6]. Finalmente, en los tumores invasivos, se encuentran fibras de colágeno para ser alineado perpendicular a la frontera tumor (TACS-3), que también se correlaciona con la dirección de la invasión celular [7]. TACS se han descrito como un marcador pronóstico para la supervivencia de los pacientes [5]. Del mismo modo, una fuerte correlación entre la potencia y la alineación metastásico matriz intra-tumoral, incluyendo radial y la alineación paralela de las fibras de colágeno se ha descrito en el modelo de ratón de cáncer colorrectal [8]. Una retroalimentación positiva entre los cambios mediada tumorales en el colágeno y el cáncer, así como los tipos de células de cáncer asociado ha sugerido [9], lo que puede explicar la ocurrencia estable y reproducible de estas estructuras de colágeno.
Las modificaciones de el estroma tumoral es conocido por ser el resultado de procesos enzimáticos /bioquímicos, en los que las células cancerosas, así como de cáncer asociado fibroblastos (CAF) juegan un papel clave en la degradación y remodelación de la matriz [8,10-12]. Esta remodelación bioquímica ha sido ampliamente estudiado y depende de la degradación por metaloproteinasas de la matriz (MMPs) y de refuerzo ECM por lisil oxidasa (LOX) [10]. El endurecimiento de la matriz se sugirió a ser un factor determinante para la invasión [13], los estudios sin embargo más reciente identificar el tamaño de la matriz de poros en lugar de la rigidez como la propiedad fundamental la modulación de la invasión de células de cáncer [14,15]. Aquí nos ocupamos de la pregunta en qué medida una remodelación mecánica pura de ECM tumor puede ser generada por las fuerzas aplicadas por las células tumorales en el ECM. Tales fuerzas de tracción en el ECM que son creados ya sea por las mismas células cancerosas, o por cáncer asociado fibroblastos (CAF) se sabe que contribuyen a la rigidez de la matriz y la alineación de las fibras alrededor del tumor [16-23].
Debido a la complejidad espacial del entorno 3D, la regulación y el resultado de las fuerzas de tracción sobre el colágeno del tumor son difíciles de estudiar
in vivo
. Sin embargo, los recientes avances en el desarrollo de 3D
in vitro y modelos de cáncer fiables en, permiten la disección de un proceso de remodelación mecánica. Especialmente, esferoides multicelulares de cáncer incrustados en la ECM se han encontrado útiles para estudiar la invasión [24,25]. Los estudios que utilizan estos modelos esferoide 3D mostraron que las células cambian de forma activa la matriz circundante mediante alineación mecánica y la tensión de refuerzo [26]. En los sistemas de esferoides de tumores cerebrales, tanto la presión de compresión y la tensión en el microentorno de la matriz se ha demostrado estar relacionado con la dinámica invasivos del tumor [27]. La dinámica detallada y la correlación entre la remodelación mecánica y la invasión aún no se ha estudiado. Además, los estudios mostraron que la presión mecánica y la elasticidad ECM regulan el crecimiento de esferoides [28,29].
Estudios anteriores demostraron que las células cancerosas individuales ejercen fuerzas de tracción en proteínas de la matriz fibrilar que conducen a la ECM deformación [12]. El análisis de la alineación de las fibras de colágeno
in vivo
y
in vitro
habían sugerido que las fuerzas procedentes del esferoide del tumor son importantes para esta alineación [7,20,21,23]. Mientras que las fuerzas contráctiles se han observado en el contexto de una sola célula para reorganizar las fibras de colágeno [12,30], el crecimiento de un tumor en lugar sugiere empuje de la ECM en la superficie del tumor, que comprime eficazmente la matriz de colágeno. Por lo tanto, dos contribuciones de compresión se pueden aislar, una fuerza de empuje debido al crecimiento del tumor y una fuerza de tracción que se aplica por las células cancerosas en el ECM. En el colágeno superficie tumor se puede doblar, pero también romper o ser degradado. El efecto de la contractilidad en otros sistemas celulares, tales como fibroblastos ha sido bien estudiado, donde se demostró que la contracción del colágeno crea patrones de tensión y la alineación de fibras ', que facilitan la migración celular [31-33]. La importancia de la tensión en la migración celular también es proporcionada por los estudios sobre el cultivo de fibroblastos en la flotación, gelatinas en 3D de baja tensión, así como anclados (restringido), geles de alta tensión [34,35].
El objetivo principal de la trabajo presentado en este trabajo es estudiar el efecto de la contracción de ECM mediada por tumor y para demostrar que la tensión se genera y afecta a la invasión de células.
resultados
modelo tridimensional de la invasión de las células cancerosas
para estudiar la invasión de células cancerosas en el ECM se utilizó un ensayo de invasión de colágeno 3D descrita anteriormente que fue adaptado a nuestros experimentos (S1A y S1B Fig) [25,36]. Esferoides derivadas de la línea murina de células de carcinoma de colon CT26 [37], transfectadas para expresar de forma estable GFP citoplasmática, se registran por hilado microscopía de disco para visualizar invasión. células CT26 se caracterizan por un fenotipo mesenquimal, sobre todo por la falta de expresión de E-cadherina [37]. Por lo tanto tienen un alto potencial invasivo y a medida que encuentran un ambiente favorable (ECM) que migran fuera del esferoide. esferoides multicelulares se generaron utilizando un protocolo de cojín de agarosa clásica y embebidos en el colágeno de tipo I adjunto a la superficie de la placa (Fig S1B). gel de colágeno se polimeriza a temperatura ambiente (≈22 ° C) para proporcionar una arquitectura de matriz comparable a
in vivo
. Geraldo et al. mostró que el colágeno polimerizado
in vitro en la temperatura ambiente se asemeja fibras encontrados
in vivo
en modelos animales con una red que consta de una mezcla de un par de haces de finos y muchos haces gruesos que van desde 0,72 hasta 1,56 m de espesor. Por el contrario, el colágeno polimerizado en 37 ° C no mostraron similitudes con tejido animal [38]. En nuestro estudio se eligió la condición de polimerización fisiológicamente más relevante a temperatura ambiente (Fig S1C y S1 Película) [25]. Esto está además apoyado por
in vivo
estudio en el cáncer de colon de ratón, donde se observa la organización similar a la del sistema reconstituido utilizado aquí.
Fig 1A muestra imágenes representativas de fluorescencia confocal (proyección en 3D) de un esferoide GFP-CT26, donde las células difunden desde el esferoide en el ECM, por lo tanto, imitando invasión.
(a) radial perfil de fluorescencia de GFP de esferoide más de 72 horas de la invasión en el colágeno de tipo I. las diferentes zonas del esferoide se pueden distinguir: zona oscura, como se ha descrito anteriormente núcleo necrótico (línea de puntos), borde proliferativa (línea discontinua) y la invasión (línea y área sombreada). Insertar: imagen representativa de esferoide (GFP) 24 horas después de la siembra. Barra de escala: 100 micras. (B) el cambio de morfología con el tiempo de diferentes tamaños de esferoides sembradas en colágeno de tipo I. Los esferoides se obtuvieron imágenes en campo claro y fluorescencia (GFP). Barra de escala: 200 micras. cinética (C) de crecimiento de esferoides para tres tamaños diferentes iniciales (& lt; 300 micras, 350 a 400 micras y & gt; 400 m). Los valores son la media ± desviación estándar de n = 6-12 de tres experimentos independientes.
Los esferoides aumento de tamaño (Figura 1B), como resultado de la proliferación celular. Como se muestra por Alessandri et al. [36], el núcleo de esferoides CT26 es necrótico, similar a otros sistemas de esferoide. En contraste, las células en el borde separan e invaden en el colágeno. En los perfiles radiales de la fluorescencia de GFP se puede observar el desarrollo dependiente del tiempo de las diferentes zonas. En t = 0h (Figura 1A, amarillo) la fluorescencia en el esferoide interior es un poco menor que en la frontera. Sin embargo, después de 24 horas tres zonas son evidentes, (figura 1A, rojo): el núcleo necrótico (el área oscura dentro del esferoide, la intensidad de señal baja), el borde proliferativa (picos de intensidad de señal), y la zona de invasión (área sombreada). Estas características imitan la morfología de
in vivo
tumores [24].
Para elegir el tamaño inicial óptimo de los esferoides que contienen tres zonas distintas, se analizó el crecimiento (Figura 1C) y la invasión de esferoides de tres diámetros diferentes, a saber, 450 micras, 350 micras y 250 micras (Fig 1B). El área oscura en esferoides más pequeñas (250 micras) se hace visible después de aproximadamente tres días en que el esferoide ha llegado a 300 micras de diámetro (Figura 1B), mientras que esferoides más grandes desarrollan el núcleo ya después de un día de cultivo en el colágeno. Para probar si el tamaño inicial de esferoides afecta a la invasión, se cuantifica el área de invasión de esferoides de diferentes diámetros iniciales y no encontramos ninguna dependencia importancia de la zona invasión relativa en el tamaño inicial esferoide (valor p & gt; 0,05) (datos no mostrados ). Como los pequeños esferoides muestran un crecimiento continuo y proporcionan un acceso más fácil para obtener imágenes 3D, utilizamos exclusivamente esferoides entre 300-350 micras de tamaño inicial para este estudio.
Las células cancerosas contrato de la red de colágeno
Para estudiar la reordenación dinámica de la matriz de colágeno durante la invasión que realiza imágenes en vivo con una resolución de tiempo de 1 h más de 24 horas (S2 película). tamaño aumenta del esferoide iniciales con el tiempo (Figura 2A, y GFP de campo brillante) y 9 horas están en observaron primeras células que salir del esferoide (inicio de la invasión) (figura 2A flecha en blanco). La distribución de células invasoras a las 24 horas es uniforme en todo el esferoide
.
(A) Secuencia de imágenes de CT26-GFP (verde) en la invasión de células de colágeno de tipo I marcado con TAMRA (rojo). Las células inician la invasión (flecha blanca) después de aproximadamente 9 horas (aparición de invasión). Barra de escala: 50 micras. (B) Kymographs de colágeno y células de la secuencia de imágenes (S2 Película). Las imágenes fueron tomadas cada hora durante 24 horas. Escala de 50 micras y 3 horas. (C) Aumento de la región en caja que muestra el movimiento de las fibras de colágeno hacia el esferoide. El quimógrafo ilustra los dos movimientos que antagonizan de compresión debido al crecimiento de esferoides (cerca de esferoide, flecha azul y la línea azul), y la contracción del colágeno en la zona de invasión (rayas hacia el esferoide, flecha amarilla y la línea amarilla). (D) El zoom en imágenes confocal de células CT26-GFP esferoides multicelulares de células cancerosas con las células invasoras (verde) en la red de colágeno tipo I (rojo) que muestra la organización del colágeno: fibras paralelas (flecha blanca) y las fibras radiales (flecha amarilla). Escala de 20 micras. (E) i orientación de las fibras de colágeno) Código de colores de mapa de orientación. ii) La medición cuantitativa de orientación (tabla-ángulos) en seleccionados ROIs (círculos). orientación de la superficie del esferoide: 45 °, orientación normal a la superficie: de -45 ° F (firmas) de colágeno que se encuentran en un solo INET /p53
- /- tumor intestinal del ratón son proyectados utilizando intravital microscopía de dos fotones. i) TAC-1, la estructura de colágeno y rizado; ii) TACS-2, colágeno recto y alineado, paralelo al borde del tumor y iii) TACS-3, colágeno alineados perpendicularmente al borde tumor. Las células epiteliales de cáncer (GFP nuclear, verde), colágeno (SHG, magenta). Las puntas de flecha apuntan a la organización del colágeno distinta. Las barras de escala, 50 micras.
A medida que el colágeno está polimerizando en presencia del esferoide, podemos observar la penetración del gel en capas de células en primer lugar (Figura 2A y 0h). Además, las imágenes representan proyecciones máximas de espesor z-pilas 40μm, que también daría lugar a una cierta superposición. Con el tiempo, la organización de colágeno cambia en función de la distancia al esferoide. A saber, las fibras de colágeno están alineados en paralelo al borde de esferoide en las proximidades (flecha blanca Fig 2D) y aparecen alineados radialmente más lejos de la superficie (flecha amarilla Fig 2D). Esta alineación se cuantificó mediante la medición de la orientación angular en diferentes posiciones (Fig 2E). Cabe señalar que sólo pocas células han alcanzado la región con la alineación perpendicular a la superficie. Esto excluye que el reajuste es debido a la reorganización masiva del colágeno por las células tumorales, por ejemplo mediante la creación de huecos en el colágeno durante la migración. Nuestro hallazgo de esta disposición confirma la variable
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y
in vitro y los informes de similar [6,39]. La organización dependiente del tiempo se muestra en la figura 2A permite vigilar los cambios de colágeno durante el crecimiento y la invasión de esferoide. Observamos (Fig 2A) que el colágeno se remodela durante 24 horas, cambiando de una organización isotrópica en el tiempo de 0h a la alineación paralela descrito en la superficie y que la apariencia de los haces radiales en la ECM circundante. no se observa Posible alineación paralela de las fibras durante la fase de polimerización del colágeno, pero podría estar más allá de la resolución de los datos actuales. áreas enmascaradas que se observan alrededor de la esferoide podrían estar asociados a la degradación enzimática por las células o células en diferentes posiciones z. Los experimentos anteriores han demostrado que las fuerzas de empuje de la creciente esferoide solos ya pueden dar lugar a la alineación paralela a la superficie esferoide [40].
El quimógrafo (Fig 2B y 2C) muestra una rica empujando comportamiento /tracción. Mientras que el colágeno cerca de la superficie esferoide es empujado hacia afuera por el crecimiento de esferoides, 30 m de distancia de esta zona de empuje se observa una tracción del colágeno hacia el esferoide, dando como resultado una contracción general de la ECM de colágeno alrededor de la esferoide. El quimógrafo (Fig 2C) ilustra los dos movimientos antagonizar de compresión debido al crecimiento esferoide (flecha blanca) y la contracción del colágeno en la zona de invasión (flecha amarilla). Este comportamiento un tanto contradictorios de una producción simultánea de empuje (debido al crecimiento de esferoides, línea azul, la figura 2C) y de tracción (por las fuerzas de células, línea amarilla, la figura 2C) crea una zona de compresión en la superficie del esferoide en el que el colágeno se reorganiza tangencial al esferoide ( Figura 2). Además, las fuerzas de tracción deforman el colágeno radialmente, creando así inherentemente una alineación preferencial de las fibras perpendicularmente a la superficie de esferoides (Fig 2D) que es muy similar a la alineación de las fibras observadas
in vivo
(Fig 2F). Este tipo de comportamiento también se conoce a partir de fibras de colágeno cizallados
in vitro
[30].
contracción del colágeno celular inducida por precede a la invasión
La inspección basada en quimógrafo sugiere que se inicia la contracción del colágeno inmediatamente después de la siembra de la esferoide en el ECM, mientras que las células invaden sólo más tarde. Para estudiar la sincronización de la contracción y la invasión cuantificamos su dependencia del tiempo. Invasion se mide a partir de imágenes de fluorescencia de las células CT26 positivas GFP (Fig 3A), mediante la cuantificación de la zona de las células que aparecen separados del esferoide y la normalización con el área cubierta por el esferoide (S2 Fig). La detección contracción del colágeno (Fig 3B) se basa en un algoritmo de correlación anteriormente descrito aplicado a las imágenes de campo claro [41], que se valida mediante el seguimiento de perlas fluorescentes embebidos en el gel de colágeno (S3-S5, S8 y S9 Figs).
(a) Selección de imágenes que muestran la invasión de células (verde) en el colágeno de más de 48 horas. Aproximadamente a las 9-12 horas las células comienzan a salir del esferoide (inicio de la invasión). imagen de campo brillante inicial del esferoide en el colágeno en el tiempo de 0 horas y los mapas de velocidad de contracción del colágeno (B). Las flechas indican la direccionalidad de la contracción y el código de color se refiere a la velocidad de contracción (rojo-azul-alta y baja). Los campos de color azul oscuro enmascaran movimiento de las células y el crecimiento de esferoides, que no se tiene en cuenta al calcular el mapa de velocidad de desplazamiento. Para la cuantificación velocidad media de desplazamiento se calculó a partir del área 100 micras fuera del esferoide indicado por las líneas de trazos. (C) La velocidad de contracción del colágeno (m /h) durante un período de 66 horas. Las diferentes fases pueden distinguirse, a velocidad de contracción: la iniciación Ia- con una mayor aceleración, la aceleración y reduce Ib-II-desaceleración, separados por la línea de puntos. Invasión inicio se indica con sombreado amarillo. (D) La línea azul muestra el acumulativo de la deformación de colágeno promedio (de la Figura 3C) y la zona de invasión (rojo). El área de invasión se normalizó para cada muestra a la zona inicial esferoide. Barra de escala: 150 mm (campo claro y GFP) y 300 (mapa de velocidades) micras. Todos los valores son la media ± error estándar (n = 19) a partir de cinco experimentos independientes.
La secuencia de mapa de velocidades resultante (figura 3B) visualiza la velocidad de flujo contráctil como un código de colores, mientras que las flechas dan dirección del flujo. Ya 3 horas después de la siembra, se detecta un flujo de colágeno contráctil (sombreado azul claro a verde) hacia los esferoides (flechas negras). La contracción disminuye radialmente y muestra algunas variaciones tangenciales. La zona de contracción alrededor del esferoide se expande con el tiempo y velocidad de contracción típicamente picos a aproximadamente 30h post-siembra, seguido por una disminución gradual.
La contracción se cuantifica mediante el cálculo de la velocidad media la contracción en un área de 100 m alrededor la superficie de la esferoide para cada marco (Fig 3B círculo blanco). Fig 3C muestra el tiempo de la velocidad de contracción dependiente resultante como promedio durante varios esferoides diferentes (n = 19). Las propiedades reproducibles globales sugieren que el sistema modelo esferoide se puede utilizar para estudiar la variación de la invasión y las interacciones mecánicas entre el esferoide y el modelo de ECM.
tres fases se pueden distinguir fenomenológicamente (figura 3C). En la primera fase (Ia) contracción se inicia inmediatamente después de la preparación de muestras con una velocidad de contracción bien definido. La contracción se acelera con un aumento de la velocidad lineal de hasta 12 horas después de la siembra. La segunda fase (Ib) se inicia con un cambio en aumento de la velocidad y dura hasta las 30h, cuando los picos de velocidad de contracción. En ciertos casos, la contracción aún mesetas a una velocidad estable, baja durante la segunda fase (véase la figura S3). Después de alcanzar el pico de la velocidad de contracción en alrededor de 30 a 33 horas se observa una desaceleración general de la contracción hacia abajo de una parada de crecimiento casi con una velocidad final de tan sólo 0,1 + - 0,02 m /h en el extremo de la recodificación (66 h) ( Fase II). Mediante la comparación de la dependencia de tiempo de deformación total de colágeno con zona de invasión (Fig 3D), se encontró que la contracción precede invasión en promedio en alrededor de 9-12h, lo que confirma los resultados de la quimógrafo en la figura 2. El inicio de la invasión aparece sólo después de la media deformación colágeno llega a 2-4 micras (Fig 3D). Curiosamente, en el comienzo de la fase II (33h), se observa una aceleración suave de la invasión (Fig 3D) que se produce en el momento los picos de velocidad de contracción. Además, estos resultados muestran que el área invasión sigue aumentando en la fase II, a pesar de la contracción del colágeno se ralentiza (fase II), lo que sugiere que no es el movimiento de colágeno que influye en la invasión.
contracción del colágeno crea tensión en la red
contracción del colágeno sugiere que las células de la capa externa de la esferoide tiran de las fibras. Quisimos determinar si el movimiento de colágeno fue el resultado de las fuerzas de tracción activas células 'o, simplemente, causada por el flujo viscoso debido a la digestión de colágeno en la superficie esferoide. La importancia de la tracción era evidente cuando la siembra de dos esferoides en las proximidades. En esta configuración se observa que las células migran predominantemente a través de la zona comprendida entre esferoides. Este patrones de migración también se corresponde con el patrón de las fuerzas de tracción esperados (S4 FIG), como se observó en otros sistemas modelo [31-33,35,42]. En tales experimentos multi-esferoide, la alineación radial observada es típicamente más pronunciada que en el análisis de esferoide sola.
Para estimar las fuerzas de tensión elásticas en el colágeno que ablated colágeno 48h post-siembra usando un láser pulsado 800 nm ( La figura 4A y S6 Película). En este punto del tiempo el flujo de colágeno se ha detenido en gran medida, lo que significa que los sistemas se ha relajado ya sea cualquier tensión mecánica por flujo viscoso o que un equilibrio mecánico, donde se establece fuerzas de tracción de las células se equilibran con las tensiones mecánicas del colágeno. El colágeno se forma la imagen antes y después de la ablación con una resolución temporal de 10 seg. ablación exitosa se confirmó por microscopía de reflexión en la misma configuración, que no depende de una señal de fluorescencia, pero la presencia de las fibras de colágeno.
(A) Para estudiar la presencia de tensión en el momento en que la contracción tiene casi se detuvo, las fibras de colágeno se cortaron 48 horas después de la siembra de un esferoide CT26 GFP en colágeno: (i) imágenes representativas de la zona de ablación en 0 y 30 segundos después del corte. La flecha blanca indica la posición del esferoide. La plaza da a la zona de ablación y la línea discontinua representa la línea elegida para la quimógrafo en iii. (Ii) co-localización de las fibras de colágeno antes y 30 segundos después de la ablación realizada al lado de la esferoide (flecha blanca). el rojo y el verde se aplica a la fluorescencia de reflexión antes y después del corte visualizar respectivamente reubicación de las fibras de colágeno. Barra de escala: 20 micras. (Iii) quimógrafo de secuencia de fotogramas de la película S6. La línea roja traza la retracción de la fibra. La cepa se define como u = L
d /L
0, y está en el ejemplo presentado 0.23. Barra de escala: 15 micras (barra larga) y 10 segundos (barra corta). (B) Experimento de control en el colágeno sin esferoide. No se observa ninguna tensión, ya que no hay signos de retracción tras el corte. Barra de escala: 15 micras (barra larga) y 10 segundos (barra corta) guía empresas
Se observa un desplazamiento inicial de la fibra rápida justo después del corte (figura 4A II y S6 Película), seguida de una descomposición continua. proceso de relajación. Las fibras se mueven en direcciones opuestas, como se indica en la quimógrafo (figura 4A iii). geles de control sin esferoides no muestran signos de tensión y relajación (Figura 4B). El movimiento observado directamente muestra que la red es en este punto de tiempo todavía bajo tensión mecánica. Esto sugiere que la contracción es causada por fuerzas generadas por el esferoide. Además, el hecho de que la retracción después de que el corte está alineado en la dirección del esferoide muestra que las células en el esferoide tire del colágeno, lo que explica directamente a los flujos de colágeno observados. Cepa (Fig 4A iii) se calcula dividiendo la longitud de deformación
L
d
en el corte (en micras) por la distancia desde el corte en el que no hay movimiento del colágeno se midió después del corte también en micras (
L
0
). Se encontró que la deformación media después del corte para ser u = 11 + - 5,3% (media + - SEM n = 14)
La invasión se suprime de forma local en ausencia de tensión
Para determinar. una posible relación entre las fuerzas de tensión aplicadas por el esferoide al colágeno y el cáncer de la invasión de células, que asimétricamente relajó la tensión por los experimentos macroquirúrgica. Esto se hizo mediante una serie de experimentos de corte en geles de colágeno con esferoides empotrados, donde los geles se cortan de forma asimétrica en un lado del esferoide (S5 Fig) justo después de colágeno se polimeriza (Fig 5A). Durante la contracción del colágeno, el plano construida de tensión mecánica en la dirección hacia el corte se suprime debido a la frontera libre. La invasión y la contracción se controla más de 72 horas (S7) de película y una asimetría de la invasión se pueden observar (figura 5A, 72h). Mientras que en el lado del corte del colágeno todavía contratos, se observa una inhibición de la invasión de células en ambos, el lado que da al corte (de color azul claro área sombreada figura 5B) y el lado opuesto hacia el interior del gel (rojo claro área sombreada Fig 5B). Sin embargo, en los dos lados perpendiculares al corte, la invasión se facilita (área blanca Fig 5B). Esto se cuantificó mediante la medición de la intensidad media de fluorescencia de las células fuera del esferoide como una función del ángulo. Mientras que en 0h, hay una fuerte desviación de la fluorescencia se hace evidente, ya después de 24 horas hay un ligero aumento en los bordes de la zona de corte, que se convierte en muy dominante después de 72 horas tal como se cuantifica por el de dos picos en la figura 5B. Como las fuerzas contráctiles no están equilibradas en la dirección del corte, se observa un movimiento global de la esferoide lejos de la corte, que a su vez reduce la tensión acumulada en el lado opuestos del corte. Curiosamente, también vemos una disminución de invasión en la dirección opuesta a la corte (figura 5B luz roja). La disminución de la invasión se cuantifica mediante la comparación de la invasión en la dirección del corte y el resto del esferoide (Fig 5C, n = 54 esferoides)
(A) Colágeno (z proyección, objetivo 4x).: colágeno rojo TAMRA se polimerizó y se corta con el escalpelo en un lado. las imágenes izquierda muestran la invasión de células positivas para GFP (verde) a los 0, 24 y 72 horas después de la siembra. La línea discontinua indica un borde del colágeno corte y la flecha indica la dirección de la contracción del colágeno. A la derecha: las imágenes fluorescentes de esferoide unwinded angular donde cada línea horizontal se corresponde con el perfil de intensidad de fluorescencia radial. El eje y de estas imágenes corresponde a los diferentes ángulos. Las flechas muestran la zona de la invasión en el lado del corte. La línea de puntos negro hace el límite izquierdo del área utilizada para calcular la media de fluorescencia como se muestra en B. (B) la intensidad de fluorescencia media de las células se extienden sobre la superficie inicial esferoide como una función del ángulo Θ. Esto se utiliza para estimar la derivación de células desde el tamaño original de esferoide. Los diferentes colores representan la intensidad media después de 0 (rojo), 24 (verde) y 72 horas (violeta) de invasión. El sombreado de la gráfica muestra el lado que da al corte (azul claro), el lado opuesto hacia el interior del gel (rojo claro) y las dos partes perpendicular al corte (área blanca). La línea punteada representa la consecuencia de esferoides empotrados en colágeno sin cortes en los tiempos correspondientes. área de cuantificación (C) Invasion en el lado del corte (después de 0 horas) y el área promedio de invasión en el lado sin cortes. zona de invasión se cuantificó como en la figura 3 (media ± error estándar, n = 54 de 6 experimentos independientes). (D) Bosquejo del modelo de invasión tensión dependiente.
Discusión
Al igual que en la mayoría de células móviles, las células cancerosas se aplican fuerzas físicas en su matriz circundante [9,43] y dinámicamente remodelar el ECM. Ambas características sugieren que pueden cambiar de forma activa su entorno y estos cambios pueden mejorar las condiciones para la invasión de las células del cáncer [16].
Si bien los efectos entre las células que migran y el ECM ya han sido estudiados previamente en el nivel de células individuales , cabe señalar que los estudios sobre el nivel esferoide permiten hacerse una idea de los posibles efectos colectivos. El gran cuerpo de trabajo de una sola célula se utiliza para comprender los elementos de fuerza y tensión en dichos sistemas aislados mecánicamente. Se ha demostrado que las células individuales para aplicar fuerzas contráctiles y la tensión sobre el colágeno que dan como resultado tanto remodelación mecánicos y bioquímicos, similar a la esferoide. Sin embargo, debido a las fuerzas limitadas de células individuales los efectos sobre la arquitectura global ECM siguen siendo pequeños en comparación con el efecto de esferoides de cáncer. Las excepciones a esto son de libre flotación, geles de baja tensión, donde la matriz no es capaz de resistir las fuerzas de tracción de fibroblastos individuales.