Extracto
Tetrandrine, un alcaloide bis-bencilisoquinolina aislado de la raíz seca de Hang-Fang Chi (
Stephania
tetrandra
S. Moore), se ha informado que poseen efectos contra el cáncer en muchos tumores. En este estudio, se determinó la apoptosis inducida por tetrandrine sobre el cáncer gástrico humano BGC-823 células
in vitro
y
in vivo
. Los resultados mostraron que la tetrandrina viabilidad celular significativamente inhibido en la dosis y de manera dependiente del tiempo y la apoptosis inducida. Se aumentó la apoptosis; la regulación positiva de Bax, Bak, y malo; y la regulación a la baja de Bcl-2 y Bcl-XL en células BGC-823. Por otra parte, la tetrandrina aumentó la activación de caspasa-3 y -9, la liberación de citocromo
c
, y la regulación positiva de Apaf-1, lo que sugiere que la apoptosis inducida por la tetrandrina se relaciona con la vía mitocondrial. Mientras tanto, el pretratamiento con el inhibidor pan-caspasa z-VAD-FMK en BGC-823 células reducción de la apoptosis inducida por tetrandrine mediante el bloqueo de la activación de las caspasas. Además, la tetrandrina inhibía eficazmente el crecimiento del tumor a través de la inducción de apoptosis, que fue verificada mediante análisis inmunohistoquímico en un modelo de xenoinjerto de ratón desnudo. Tomados en conjunto, llegamos a la conclusión de que tetrandrine inhibió significativamente la proliferación del cáncer gástrico células BGC-823 a través de la apoptosis dependiente de la mitocondria, que puede jugar un papel prometedor en la terapia del cáncer gástrico
Visto:. Qin R, Shen H, Cao Y, fang Y, Li H, Chen Q, et al. (2013) Las mitocondrias Tetrandrine induce la apoptosis mediada en humanos cáncer gástrico BGC-823 células. PLoS ONE 8 (10): e76486. doi: 10.1371 /journal.pone.0076486
Editor: Lucía R. Languino, Thomas Jefferson University, Estados Unidos de América
Recibido: 16 de diciembre de 2012; Aceptado: 27 Agosto 2013; Publicado: 1 de octubre 2013
Derechos de Autor © 2013 Qin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo recibió el apoyo de las siguientes subvenciones: las subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81070423 y 81101677), las becas de la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Jiangsu (BK 2010332). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
En china, cáncer gástrico, uno de los tumores malignos más comunes, como resultado de una acumulación de eventos genéticos y epigenéticos, todavía tiene una alta incidencia y mortalidad [1-3]. Hay varios factores que causan la aparición de cáncer gástrico, como
Helicobacter Pylori
la infección, la dieta, el consumo de tabaco, y así sucesivamente [4]. Dependiendo de las circunstancias, la mayoría de pacientes con cáncer gástrico necesitan cirugía, quimioterapia y /o quimiorradioterapia [5]. Estudios previos han revelado que el cáncer gástrico es una enfermedad genética compleja relacionada con los oncogenes o supresores tumorales [6].
Tetrandrine (C
38H
42N
2O
6, 622,730 MW ) es un alcaloide bis-bencilisoquinolina aislado de la raíz seca de Hang-fang Chi (
Stephania
tetrandra
S. Moore). Recientemente, las diversas actividades biológicas de tetrandrina se han estudiado intensivamente debido a su amplio uso en la artritis, la arritmia, la inflamación, la silicosis, diversos tipos de tumores, y la resistencia a múltiples fármacos [7,8] inversa. Se ha informado de que tetrandrine tiene efectos significativos sobre tumores incluyendo la desaceleración del crecimiento del tumor y el aumento de animales tiempo de supervivencia y tasa de supervivencia [9-12]. Tetrandrine provoca un bloqueo del ciclo celular G1 e induce la apoptosis en varios tipos de células. Sin embargo, los mecanismos precisos por los que tetrandrine inicia la apoptosis e inhibe el crecimiento celular en las células tumorales gástricas siguen sin estar claros [13]. Se ha informado de que el codelivery de paclitaxel (Ptx) y tetrandrine por nanopartículas puede mejorar eficazmente la citotoxicidad de Ptx por la inhibición secuencial de la vía de Akt ROS-dependiente y la activación de las vías de apoptosis basado en la terapia de oxidación contra el cáncer gástrico [14]. Sin embargo, como un agente terapéutico, Ptx tiene inevitablemente efectos secundarios graves, debido a sus efectos no específicos y disolventes tóxicos especiales, y las células tumorales pueden ser más resistentes a la apoptosis inducida por Ptx [15-17]. Un estudio previo ha demostrado que la tetrandrina tiene un efecto sinérgico con agentes quimioterapéuticos sobre la apoptosis de líneas celulares de cáncer gástrico [18]. Además, un derivado de (H1) de la tetrandrina ejerce buena actividad de resistencia a múltiples fármacos anti-iniciando la vía de la apoptosis intrínseca y la inhibición de la activación de Erk1 /2 y Akt1 /2 [19]. Estos hallazgos sugieren que podría sustituir a tetrandrine Ptx como la primera línea de quimioterapia para el cáncer gástrico.
Desde tetrandrine tiene un gran potencial en la terapia contra el cáncer, es importante estudiar de forma sistemática para comprender su mecanismo. Por lo tanto, en este estudio, hemos investigado los posibles mecanismos de tetrandrine en células de cáncer gástrico humano
in vitro
y
in vivo
.
Materiales y Métodos
Materiales y reactivos
Tetrandrine se obtuvo a partir de Jiangxi Yintao Pharmaceutical Development Company (Jiangxi, china). Los anticuerpos se obtuvieron de las siguientes fuentes: Los anticuerpos contra Bcl-2, Bax, Bcl-XL, caspasa-3, -8, -9, el citocromo
c
, Apaf-1, y β-actina fueron de Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CA, EE.UU.); anti-malo y Bak eran de Bioworld Tecnología (St. Louis Park, MN, EE.UU.). El kit de reactivo Trizol fue adquirido de Invitrogen (Grand Island, NY, EE.UU.). MTT (3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, bromuro de 5-difeniltetrazolio) se adquirió de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.).
Cultivo celular
La línea celular humana de cáncer gástrico BGC-823 fue adquirido de Shanghai Biología celular, Academia de Ciencias de china (Shanghai, china). Las células se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Gibco BRL, Grand Island, NY, EE.UU.), suplementado con 10% de suero bovino fetal (Hyclone, Logan, UT, EE.UU.), 1% de penicilina y 1% de estreptomicina en una atmósfera humidificada de 95% de aire y 5% de CO
2 a 37 ° C.
viabilidad de las células de ensayo
la viabilidad celular se midió mediante el ensayo de MTT. En resumen, las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una densidad de 1 x 10
4 células /pocillo. Después de 36 h, las células fueron tratadas con o sin tetrandrine a concentraciones variables durante 24, 48, y 72 h; y solución salina tamponada con fosfato (PBS) sirvió como control negativo. A continuación, 20 l de solución de colorante MTT (/ml, se disolvió en PBS y se filtró a través de una membrana de 0,2 mm-0,5 mg) se añadió a cada pocillo y se incubaron a 37 ° C durante 4 h. A partir de entonces, se añadieron 150 l de sulfóxido de dimetilo a cada pocillo, y las placas se incubaron a 37 ° C durante 10 min adicionales. Se midió la absorbancia a 490 nm usando un lector de microplacas de 96 pocillos. El IC
50 valor se definió como la concentración de fármaco que inhibe el crecimiento celular del 50% en comparación con el control.
blotting
células de cáncer gástrico occidentales se lavaron dos veces con PBS, y luego se añadieron 100 l de tampón de lisis RIPA (Beyotime, china) a cada pocillo para lisar las células durante aproximadamente 20 min. A continuación, la mezcla se centrifugó a 12.000
g
de 15 min, y el sobrenadante se recogió. La concentración de proteína se detectó mediante el uso de un kit de ensayo de proteínas BCA (Beyotime, China) según las instrucciones del fabricante. La proteína total se separó mediante SDS-PAGE en 8%, 10% y 12% geles de poliacrilamida y se transfirió electroforéticamente sobre difluoruro de polivinilideno (PVDF) membranas (Millipore, Bedford, MA, EE.UU.). Después de bloquear durante 2 h o durante la noche con leche en polvo no grasa 5% (disuelto en Tris-solución salina tamponada-Tween 20 tampón; TBST), las membranas se incubaron con anticuerpos primarios (1: 500 a 1: 1000 dilución) durante 2 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C y después se lavaron tres veces con TBST (5 mM Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 136 mM, 0,1% de Tween 20) antes de reaccionar con peroxidasa de rábano (HRP) conjugado con anticuerpos secundarios (1: 5000 -1: 10000) durante 1 h a temperatura ambiente. Después de lavar tres veces durante 10 minutos cada uno con TBST, las membranas fueron tratadas con reactivo de detección ECL Western Blotting.
reacción cuantitativa en cadena de polimerasa en tiempo real
ARN celular total se aisló usando el reactivo Trizol ( Invitrogen) siguiendo el protocolo del fabricante y se disolvió en agua tratada con DEPC. La concentración de ARN total se midió por espectroscopia de absorbancia de UV. La transcripción inversa se realizó usando un RevertAid ™ Primera Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas MBI, Waltham, MA, EE.UU.) siguiendo el protocolo del fabricante. El ADNc recién sintetizado se amplificó por reacción en cadena de la polimerasa (Fermentas). Las secuencias de cada cebador usado en este estudio se muestran en la Tabla 1. La cadena de la polimerasa condiciones de reacción son las siguientes: 95 ° C durante 3 min, 95 ° C durante 5 min, 58 ° C durante 30 min, y 72 ° C durante 30 min seguido de 40 ciclos a 94 ° C durante 15 s y 60 ° C durante 1 min. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.
Génica
cebador sentido (5 'a 3')
cebador antisentido (5 'a 3’)
bcl-2GGATCCAGGATAACGGAGGCCCAGATAGGCACCCAGGGTbaxACCAAGAAGCTGAGCGAGTGTACAAACATGGTCACGGTCTGCbclxlGGCAGGCGACGAGTTTGACCCATCCCGGAAGAGTTCATβ-actinTGGCACCCAGCACAATGAACTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCATable 1. Las secuencias de los cebadores para los genes utilizados en este estudio.
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unión Anexina V-yoduro de propidio ensayo
En resumen, las células se sembraron en placas de 6 pocillos y se trataron con diferentes concentraciones de tetrandrina durante 24 h, y PBS sirvieron como control negativo. Entonces, las células se resuspendieron en 500 l de tampón de unión frío. Las suspensiones celulares se tiñeron contra Anexina-V y yoduro de propidio (BD Pharmingen
TM, Becton Dickinson, San Jose, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante, y luego el análisis de citometría de flujo se realizó mediante un FACS (Coulter, Becton Dickinson).
caspasa-3 actividad ensayo
en pocas palabras, las células se incubaron en una placa de 6 pocillos a una concentración de 4 × 10
5 /pocillo y se trató con la concentración indicada de droga. se utilizó un volumen igual de PBS como control negativo. se midió la caspasa-3 actividad utilizando una caspasa-3 kit de ensayo de la actividad (Beyotime, china) siguiendo las instrucciones del fabricante. A continuación, la absorbancia se midió a 405 nm utilizando un lector de microplacas. Todos los experimentos se llevaron a cabo por triplicado.
Ética declaración
Los procedimientos que implican animales y su cuidado se realizaron de conformidad con las directrices del NIH (NIH Pub. No.85-23, versión revisada en 1996) y fueron aprobados por el Comité de Cuidado y uso de Animales del hospital Popular afiliadas, Universidad de Jiangsu.
los experimentos con animales
ratones desnudos hembra (BALB /c nu /nu), 4-6 semanas de edad, se obtuvieron del Centro de Experimentación Animal de la Academia de Ciencias de china (Shanghai, china) y se mantiene en condiciones libres de patógenos específicos en un armario biológica en el Centro de Animales de Laboratorio de la Universidad de Jiangsu. Los animales se mantuvieron en un ciclo de luz-oscuridad de 12 h. La temperatura ambiente se mantuvo a alrededor de 20 ° C, y la humedad se mantuvo a aproximadamente 50% en una habitación con un suministro de aire filtrado.
Tetrandrine tratamiento subcutáneo de BGC-823 tumores en ratones
Para establecer un BALB /c modelo de xenoinjerto de ratón de cáncer gástrico humano, BGC-823 células a una concentración de 5,0 x 106/150 l se inyectaron en el flanco derecho de cada uno /c ratón nude BALB. Aproximadamente 10 días más tarde (el tamaño del tumor alcanzó 120 a 150 mm3), ratones desnudos fueron divididos aleatoriamente en tres grupos (n = 5) y teniendo en cuenta los siguientes tratamientos: control (tratado con solución salina normal), grupo de dosis baja (tratado con 40 mg /tetrandrine kg), y el grupo de dosis alta (tratados con 120 mg /kg tetrandrine). ratones BALB /c se inyectaron por vía intraperitoneal con tetrandrina (200 l, 40 mg /kg o 120 mg /kg) o un volumen igual de solución salina normal, una vez al día durante 3 semanas, respectivamente. El tamaño del tumor se midió cada 3 días en dos dimensiones perpendiculares con calibradores Vernier, y el volumen tumoral (TV) se calculó por la fórmula: TV = longitud (mm) x anchura
2 (mm
2) × 0,5 . volumen tumoral relativo (RTV) se calculó según la siguiente fórmula: RTV = TV
t /TV
0, donde la televisión
0 es el volumen del tumor en el día 0 y TV
t es el tumor volumen en un día dado t. Mientras tanto, los animales se pesaron dos veces por semana. Al final del experimento, los tumores se extirparon y se fijaron en formalina para su posterior análisis.
El análisis inmunohistoquímico
Las muestras incluidas en parafina extirpados de BGC-823 ratones desnudos fueron teñidas utilizando los siguientes anticuerpos : Bcl-2 y Bax (Boster), Bcl-XL, que se activa la caspasa-3 y caspasa-9 (Santa Cruz) para inmunohistoquímica. Las imágenes fueron tomadas con un microscopio de fluorescencia (Carl Zeiss).
El análisis estadístico
Todos los experimentos se realizaron al menos tres veces, y se presentaron todos los datos como medias ± desviación estándar (SD). Las diferencias estadísticas se determinaron mediante ANOVA de una vía utilizando el software SPSS 16.0. Un valor de p inferior a 0,05 se consideró significativo.
Resultados
Efecto citotóxico sobre las células de tetrandrine BGC-823
La estructura química de tetrandrine se muestra en la Figura 1A. El efecto anti-proliferativo de tetrandrina se investigó en células BGC-823 usando el ensayo MTT. Como se muestra en la Figura 1B, las células se trataron durante 24, 48, y 72 h con diversas concentraciones de tetrandrina. La tetrandrina se encontró que inhibe significativamente el crecimiento de células BGC-823 de una manera dosis-y dependiente del tiempo. células BGC-823 se inhibió significativamente por tetrandrine a 10 mg /ml (
P Hotel & lt; 0,05). El IC
50 valor fue de 6.104 ± 0.786, 4.471 ± 0.650 y 3.744 ± 0.573 tras 24, 48 y 72 h de tratamiento tetrandrine, respectivamente. Por lo tanto, se determinaron 6, 8, y 10 mg /ml como las concentraciones representativos en los siguientes estudios.
(A) La estructura química de la tetrandrina. proliferación (B) las células se determinó mediante un ensayo de MTT, y las células BGC-823 fueron tratados con varias concentraciones de tetrandrina en 24, 48 y 72 h, respectivamente. La tasa de inhibición del grupo de control se establece en 0. Los datos se expresan como medias ± SD de tres experimentos independientes realizados por triplicado. *
P Hotel & lt; 0,05; **
P Hotel & lt; 0,01; ***
P Hotel & lt; 0,001 frente al grupo control, respectivamente.
Inducción de apoptosis por tetrandrine
han sido reportados mediadas por Tetrandrine capacidades anti-cáncer que se asocia con la apoptosis [9-12]. En consecuencia, se determinó la capacidad de la apoptosis inducida por tetrandrine de células BGC-823 utilizando una citometría de flujo ensayo. Como medida por citometría de flujo, los efectos de la tetrandrina sobre la apoptosis de células BGC-823 se muestran en la Figura 2A y B, con los tratamientos tetrandrina 24 h a las 0, 6, 8, y 10 mg /ml que resulta en 4,35%, 11,4% , 17,72% y 32,34% de las células apoptóticas, respectivamente, y la tetrandrina (8 mg /ml) durante 0, 12, 24, y 48 h resultando en 3,4%, 6,64%, 19,15% y 25,85% de las células apoptóticas, respectivamente (Figura 2C y D). Estos datos indicaron claramente que la apoptosis inducida en células tetrandrine BGC-823 de una manera dosis-y dependiente del tiempo. El número de células apoptóticas aumentado junto con la concentración de tetrandrina y tiempo de tratamiento.
A ensayo de unión de PI-Anexina V-FITC se usó para detectar la apoptosis de células BGC-823. Las células (A) tratados con tetrandrina durante 24 h a las 0, 6, 8, y 10 mg /ml. (C) las células tratadas con 8 mg /ml tetrandrine de 0, 12, 24, y 48 h. (B, D) Las columnas representan las medias ± SD de células apoptóticas obtenidas a partir de tres experimentos independientes. **
P Hotel & lt; 0,01; ***
P Hotel & lt; 0,001 en comparación con el grupo control.
mediada por la expresión Tetrandrine de miembros de la familia Bcl-2
Para investigar el mecanismo más específica sobre la inducción de la apoptosis en las células BGC-823 por tetrandrine, hemos detectado la expresión de proteínas relacionadas con la apoptosis por Western Blot y su nivel de mRNA en tiempo real (RT)-PCR. A continuación, se estudió la expresión de Bax, Bad, Bak, Bcl-2 y Bcl-XL en células BGC-823 tratadas con tetrandrine. Después de 24 h de exposición a la tetrandrina, Bax, Bad, y expresión de la proteína Bak se aumentó dependiendo de la dosis, mientras que Bcl-2 y Bcl-xl expresión de la proteína fue dependiente de la dosis disminuyó (Figura 3A). También se encontró que la tetrandrina puede regular al alza la expresión de Bax y regular a la baja la expresión de Bcl-2 de una manera dependiente del tiempo (Figura 3B). Para determinar si la tetrandrina afectaría a la transcripción de genes de bcl-2, bcl-XL, y bax, su expresión mRNA fue examinado por RT-PCR (Figura 3C). Los resultados de RT-PCR claramente coinciden con los presentados en la Figura 3A.
(A) Western blot de la expresión de proteínas relacionadas con la apoptosis en las células BGC-823 tratadas con 6, 8, y 10 mg /ml La tetrandrina para 24 h. (B) Análisis de transferencia Western de bcl-2 y bax tratados con 8 mg /ml tetrandrine para 12, 24, 48, y 72 h. (C) Los efectos de la tetrandrina sobre se determinaron usando PCR en tiempo real (1), el control de los niveles de expresión de bcl-2, bcl-XL, y bax (2) 6 g /ml (3) 8 mg /ml (4) 10 g /ml. expresión de ß-actina se utilizó como control interno. Los datos se presentan como la media ± SD de al menos tres experimentos. *
P Hotel & lt; 0,05; **
P Hotel & lt; 0,01; ***
P Hotel & lt; 0,001 en comparación con el grupo control.
apoptosis inducida por Tetrandrine través de una vía mitocondrial en células BGC-823
Para explorar si la apoptosis inducida por tetrandrine se asoció con la activación de caspasas miembros, que mide la expresión de las caspasas en las células BGC-823 tratadas con diversas concentraciones de tetrandrina por transferencia Western. Los resultados mostraron una elevación dependiente de la dosis de exfoliados caspasa-3 y caspasa-9 escindida en tetrandrine- células tratadas (Figura 4A). Sin embargo, los niveles no detectables de caspasa-3 escindido y escinde la caspasa-9 se encuentra en las células en ausencia de tratamiento tetrandrine (datos no mostrados). A fin de determinar el papel de la activación de caspasas en la apoptosis tetrandrine inducida, las células BGC-823 se trataron previamente con el pan-caspasa inhibidor z-VAD-fmk (10 mM) durante 4 h, y luego tratados con 8 mg /ml tetrandrine para 24 marido. En comparación con el control, las actividades relativas de la caspasa-3 se incrementaron en las células BGC-823 tratados con tetrandrina solamente (Figura 4B). Además, la liberación de citocromo
c
se aumentó de una manera dependiente de la dosis por la tetrandrina. Un representante de la citometría de flujo resultado mostró que las células pretratadas con z-VAD-FMK redujeron fuertemente la apoptosis inducida por tetrandrine y que sólo se detectó un pequeño número de células apoptóticas (Figura 4C). A continuación, se analizó el nivel de expresión del citocromo citoplasmática
c
, que se libera de la mitocondria en el citoplasma durante la apoptosis, actuaron en la proteasa apoptótica factor activador-1 (Apaf-1) mediante el aumento de la unión de Apaf- 1 a ATP /dATP, y inducida por la activación de la caspasa-9-dependiente de la caspasa-3 [20-22]. Se encontró que la tetrandrina aumentó significativamente la expresión de citocromo citoplásmica
c
y Apaf-1 en BGC-823 células de una manera dependiente de la dosis (Figura 4D). En conjunto, estos hallazgos sugieren que una vía cascada de caspasas mitocondrias mediada estaba involucrado en la apoptosis inducida por la tetrandrina.
(A) análisis de transferencia de Western de la expresión de la procaspasa-3, exfoliados caspasa-3 y caspasa escindido 9 en las células BGC-823 tratados con tetrandrina a 6, 8, y 10 mg /ml durante 24 h. (B) Las células se trataron previamente con o sin pan-caspasa inhibidor z-VAD-fmk (10 mM) durante 4 h seguido de tratamiento con tetrandrina a 8 g /ml durante 24 h, y se midió la actividad relativa de la caspasa-3 usando un ensayo de la actividad de caspasa-3. (C) BGC-823 células fueron pretratadas con o sin z-VAD-fmk (10 mM) durante 4 h seguido de tratamiento con tetrandrina a 8 mg /ml para 24 h. Un ensayo de unión de PI-Anexina V-FITC se usó para detectar la apoptosis de células BGC-823. (D) Análisis de transferencia Western de la expresión de citocromo citoplásmica
c
y Apaf-1 en las células BGC-823 tratados con tetrandrina a 6, 8, y 10 mg /ml para 24 h. expresión de ß-actina se utilizó como control interno. Los datos se presentan como la media ± SD de al menos tres experimentos. *
P Hotel & lt; 0,05; **
P Hotel & lt; 0,01; ***
P Hotel & lt; 0,001 en comparación con el grupo control.
Los efectos antitumorales de tetrandrine en BGC-823 xenoinjertos de ratones desnudos
Desde tetrandrine se encontró que inhibe significativamente el crecimiento de las células BGC-823
in vitro
, además, evaluó el efecto antitumoral de tetrandrine
in vivo
con modelos de xenoinjertos establecidos. Como se muestra en la Figura 5A, la tetrandrina puede inhibir eficazmente el crecimiento del tumor después de un tratamiento de 24 días. Al final de 24 días, los volúmenes promedio de tumor eran 493.06 mm
3 y 1243.00 mm
3 en el grupo de dosis alta y el grupo de dosis baja, respectivamente, correspondientes a 80,52% y la tasa de inhibición del 50,9% en comparación con el control grupo. Además, el peso del tumor se reduce como resultado del tratamiento con tetrandrina a ambas concentraciones (Figura 5B & amp; Tabla 2). Este resultado mostró que una dosis alta de tetrandrina tuvo un efecto anti-tumor más fuerte que una dosis baja en el modelo de xenoinjerto de BGC-823.
BGC-823 células se inocularon por vía subcutánea en ratones BALB /c desnudos para establecer la modelo de xenoinjerto. (A) El crecimiento del tumor se controló a los puntos de tiempo indicados, y el volumen del tumor se midió cada 3 días. El día de inicio del tratamiento con fármacos se definió como día 0. Los datos representan la media ± SD del volumen relativo del tumor para cada grupo. peso (B) del tumor se midió al final del experimento. Los datos representan la media ± SD del peso del tumor para cada grupo. ***
P Hotel & lt; 0,001 en comparación con el grupo control.
Grupo (n = 5): perfil del volumen del tumor (mm
3)
inhibitoria Tasa (%)
peso del tumor (g)
inhibitoria tasa (%)
control2531.78 ± ± 153.251.194 0.10Tet (40 mg /kg) 1243.00 ± 55.19
*** 50.900.641 ± 0,06
*** 46.31Tet (120 mg /kg ) 493.06 ± 145.63
*** 80.520.298 ± 0,09
*** 75.04Table 2. inhibición de la tetrandrine (Tet) sobre el crecimiento tumoral en ratones desnudos.
***
P Hotel & lt; 0,001
frente al grupo de control. Descargar CSV CSV
apoptosis inducida por Tetrandrine en BGC-823 xenoinjertos
El análisis inmunohistoquímico de tejidos tumorales extirpados de BGC-823 ratones desnudos xenoinjertado volvió a confirmar que se había producido la apoptosis en los tumores tratados con tetrandrina y que la vía mitocondrial jugados un papel importante durante la apoptosis. Había cinco ratones desnudos en cada grupo. Se observó que la expresión de Bcl-2 y Bcl-XL se disminuyó, mientras que los niveles de proteína de Bax, que se activa la caspasa-3, y se activa la caspasa-9 se mejoraron de manera significativa por la tetrandrina (Figura 6). Todos estos hallazgos corroboraron firmemente que tetrandrine puede inducir la apoptosis, en consonancia con el
in vitro
estudio
La tinción inmunohistoquímica de las proteínas relacionadas con la apoptosis:. Bcl-2, Bcl-XL, Bax, caspasa activado -3, y activado capase-9. La ampliación es de 200 ×. Se muestran microfotografías representativas de tres grupos. DAB tiñe las células inmunorreactivas (marrón oscuro).
Discusión
El cáncer gástrico, la cuarta neoplasia más comúnmente diagnosticado detrás del cáncer de pulmón, mama, colon y recto, hace casi una millón de muertes anuales y ha sido la segunda causa de muerte por cáncer en todo el mundo [23-26]. La cirugía, la quimioterapia y la terapia dirigida molecular han sido las principales estrategias de tratamiento en el tratamiento del cáncer gástrico [27]. Aunque la resección quirúrgica ha sido el tratamiento curativo más eficaz, los resultados son inconsistentes y limitado por la recurrencia del tumor y la quimiorresistencia. fármacos quimioterapéuticos convencionales, tales como Ptx, 5-fluorouracilo, y las células tumorales cisplatino Kill mediante la inducción de apoptosis y la autofagia; pero las células tumorales pueden hacerse resistentes a la apoptosis inducida por drogas [17,28,29].
Se ha informado de que tetrandrine tiene una fuerte actividad antitumoral tanto
in vitro
y
In vivo
en muchas células cancerosas, tales como células de carcinoma de pulmón humano A549, células de cáncer de vejiga, células de cáncer de colon, células de hepatoma, y así sucesivamente [9-12]. Un estudio anterior indicaba que la tetrandrina podría desempeñar un papel prometedor por interacción sinérgica con agentes quimioterapéuticos, posiblemente por sus efectos sinérgicos en la inducción de apoptosis y regulación negativa de los genes de agentes quimioterapéuticos asociada en MKN-28 células y BGC-823 células [18]. Sin embargo, el mecanismo de tetrandrine en cáncer gástrico células BGC-823 humanos no ha sido identificado. En este estudio, hemos demostrado que tetrandrine exhibieron una potente actividad antitumoral hacia el cáncer gástrico humano
e in vitro
in vivo
, elucidar los mecanismos subyacentes de la acción.
En primer lugar, nuestra resultados mostraron que inhibe eficazmente la proliferación celular tetrandrine BGC-823 ensayó mediante MTT de una manera dosis-y dependiente del tiempo. Mientras tanto, el IC
años 50 del tetrandrina fueron aproximadamente 6.1, 4.5, y 3.7 mg /ml en BGC823 células durante 24, 48, y 72 h, respectivamente. De acuerdo con estudios anteriores, los fármacos quimioterapéuticos matan tumores sólidos principalmente por la inducción de la apoptosis [30 a 32]. Se encontró que la apoptosis fue inducida por tetrandrine de una manera dependiente de la concentración a través de análisis de citometría de flujo con un aumento de células apoptóticas tempranas y finales de células apoptóticas en el cáncer gástrico células BGC-823.
En células de mamíferos, la apoptosis puede ser desencadenada por la vía extrínseca activada por el receptor de la muerte y la vía intrínseca reguladas por miembros de la familia Bcl-2 y cascadas de caspasas en la mitocondria [33,34]. En nuestro estudio, tetrandrine aumentó la expresión de las proteínas pro-apoptótica Bax, Bad y Bak y la disminución de los niveles de la proteína Bcl-2 y Bcl-XL. Por lo tanto, un aumento de la relación de expresión anti- y pro-apoptótica de proteínas, tales como la relación de Bax /Bcl-2, llevaría a la pérdida de potencial de membrana mitocondrial. mitocondrias disfunción de comunicados de citocromo
c
, que se acumula en el citosol y forma un complejo con Apaf-1. En la vía intrínseca, tal como un efector, caspasa-3 se escinde por la activación de la caspasa-9 [35-37]. En el presente estudio, hemos demostrado que la caspasa-9 y caspasa-3 fueron activadas por tetrandrine. La reducción de la apoptosis inhibidor de pan-caspasa z-VAD-FMK en las células BGC-823, lo que indica que la vía mitocondrial juega un papel central en la apoptosis inducida por tetrandrine.
Se informa que tetrandrine podría revertir la resistencia a muchos medicamentos de quimioterapia, tales como Ptx y doxorrubicina en el KBv200 y K562 modelos de xenoinjertos de ratón nude [38,39]. Tetrandrine también posee una fuerte capacidad de inhibir la angiogénesis en los gliomas en ratas [40]. Además, nuestros resultados indicaron que la tetrandrina exhiben una fuerte actividad anti-tumor mediante la inhibición de crecimiento tumoral y la inducción de apoptosis en el modelo de xenoinjerto de ratón desnudo establecido BGC-823.
En conclusión, nuestros datos demostraron que la tetrandrina indujo significativamente la apoptosis en humanos cáncer gástrico BGC-823 células y sus modelos de xenoinjertos de ratones desnudos. apoptosis inducida por Tetrandrine se asoció con la activación de la vía de apoptosis intrínseca. Sobre la base de estos resultados, tetrandrine podría tener un gran potencial en el tratamiento del cáncer gástrico humano en el futuro.
Reconocimientos
Nos gustaría dar las gracias a los miembros del Departamento de Medicina Clínica de la Universidad de Jiangsu para su asistencia técnica.