Extracto
C-reactiva (PCR) es un estableció marcador de la inflamación con actividades similares al receptor de reconocimiento de patrones. A pesar de la estrecha asociación de la concentración sérica de PCR con el riesgo y el pronóstico de varios tipos de cáncer, sigue siendo difícil de alcanzar si la PCR contribuye directamente a la tumorigénesis o simplemente representa un marcador transeúnte. Recientemente hemos identificado mutaciones recurrentes en la posición de SNP -286 (rs3091244) en el promotor de
CRP
gen en varios tipos de tumores, lo que sugiere que en lugar CRP producción local es un conductor de potencial de la tumorigénesis. Sin embargo, se desconoce si el sitio -286 es el único SNP posición de
CRP
gen diana para la mutación y si existe alguna asociación entre la
CRP
mutaciones SNP y otros genes mutados con frecuencia en los tumores . Aquí, hemos examinado los genotipos de tres común
CRP
SNP no codificante (rs7553007, rs1205, rs3093077) en tumores /pares de muestras normales de 5 tipos de cáncer (n = 141). No hay mutaciones somáticas recurrentes se encuentran en estas posiciones SNP, lo que indica que las mutaciones SNP -286 son preferentemente seleccionados durante el desarrollo del cáncer. Un análisis más detallado revela que las mutaciones SNP -286 de
CRP
tienden a co-ocurrir con mutado
APC
particularmente en el cáncer de recto (
p = 0,04
; n = 67) . Por el contrario, las mutaciones de
CRP
y
p53
o
K-ras
parece haberse desconectado. por lo tanto hay resultados subrayan la importancia funcional de la mutación de -286
CRP
en la tumorigénesis e implican una interacción entre la PCR y la vía de señalización Wnt
Visto:. Su HX, Zhou HH, Wang MI, Cheng J, Zhang SC, Hui F, et al. (2014) Las mutaciones de
Proteína C Reactiva gratis (
CRP
) -286 SNP,
APC
y
p53
en el cáncer colorrectal: Implicación para una CRP-Wnt Crosstalk. PLoS ONE 9 (7): e102418. doi: 10.1371 /journal.pone.0102418
Editor: Qing Song, Facultad de Medicina Morehouse, Estados Unidos de América
Recibido: 5 de Marzo, 2014; Aceptado: 18 Junio 2014; Publicado: July 15, 2014
Derechos de Autor © 2014 Su et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos se incluyen dentro del papel
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Ministerio de Ciencia y Tecnología de China [número de concesión 2011CB910500]; la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China [los números de subvención 30930024, 31222015, 31270813, 31170696]; el Ministerio de Educación de China [los números de subvención PCSIRT: IRT1137, 121108]; Provincia de Gansu [número de concesión: 1011FKCA089]; y Lanzhou Universidad [los números de subvención: 2013-bt05-lzujbky, lzujbky-2014-86]. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la inflamación es esencial para el desarrollo del cáncer [1], [2]. Como un importante reactante de fase aguda humana, proteína C-reactiva (CRP) es ampliamente utilizado como un marcador no específico de inflamación [3], [4]. Sin embargo, la evidencia acumulada ha puesto de manifiesto una estrecha asociación entre el nivel sérico de la PCR y el riesgo y pronóstico del cáncer [5]. Dadas las supuestas funciones de la PCR en la defensa del huésped y la inmunidad innata [6], [7], es plausible que la PCR puede desempeñar un papel directo en la tumorigénesis. De hecho, la PCR ha sido reportado para prevenir la apoptosis de células de mieloma [8] y para facilitar la invasividad de las células de cáncer de mama [9]. Además, la PCR puede contribuir a la creación de un microambiente del tumor favorable mediante la promoción de la angiogénesis [10], mediante la inhibición de la activación destructiva del complemento [11], [12], y mediante la inducción de citoquinas proinflamatorias de las células inmunes y endoteliales [3], [ ,,,0],13], [14].
Por otro lado, los polimorfismos de nucleótido único (SNPs) que se asocian con concentraciones genéticamente elevados de CRP no confieren un mayor riesgo de cáncer para la población general [15]. Esto sugiere que la PCR de circulación no es causalmente implicado en la tumorigénesis. Curiosamente, a diferencia de las actividades pro-cáncer antes mencionados, los primeros estudios han documentado también acciones anti-cáncer de PCR a través de la activación de macrófagos /monocitos [16] - [18]. En consecuencia, ha sido difícil definir si la PCR es un marcador exclusivamente pasivo o un jugador activo en el cáncer, o para diseccionar la contribución exacta de la PCR en la tumorigénesis
Suero CRP es producida por los hepatocitos del hígado.; Sin embargo, la acumulación de evidencia también revela una producción local de PCR por las células extrahepáticas [3], [19]. Curiosamente, se ha encontrado recientemente que el promotor de
CRP
está mutado específicamente en la posición de SNP (rs3091244) 286 pb aguas arriba del sitio de inicio de transcripción en 109 de 453 muestras de tumor pero no en los controles normales de la misma [19 ]. Estas mutaciones se asocian con una mayor local de
CRP
la inducción de tumores probablemente a través de la interrupción de la metilación CpG motivo conservado. Además, la mayoría de los tipos de cáncer examinados puerto de la -286 mutación y la fracción del alelo mutado es alta (0,487, IC del 95%: 0,477-0,517). Por tanto, estos resultados apoyan el papel de la PCR producido
In situ
como conductor potencial de cáncer que probablemente está implicada en los mecanismos generales que favorece la tumorigénesis [19].
Además del SNP -286, hay varios SNPs no codificantes comunes adicionales que afectan significativamente a los niveles basales de proteína C reactiva en suero. Los representantes incluyen rs7553007, rs3093077 y rs1205, [15], [20], [21]. Por tanto, es de interés si estos SNP sitios también son objeto de mutación en los tumores. Mostramos aquí por genotipo de 141 pares de muestras tumorales /normales que no hay mutaciones recurrentes se producen al 3
CRP
sitios de SNP, que pone de relieve que los -286 mutaciones son muy específicos a la tumorigénesis. Además, examinó si existe alguna correlación entre las mutaciones de -286
CRP
y otros genes mutados con frecuencia en los tumores. La asociación definida entre el -286 y
APC
mutaciones implica una interacción de la PCR con la señalización de Wnt.
Materiales y Métodos
tumoral congelado /pares de muestras de tejidos normales se obtuvieron de el banco de tejidos del hospital Provincial de Gansu del tumor. ADN genómico se aisló a partir de tejidos o muestras de sangre usando el reactivo DNAiso o del genoma DNA Extraction Kit de Sangre (Takara) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la identificación de mutaciones de genes, el ADN genómico se amplificó con los cebadores específicos (humanos
CRP
: hacia adelante: 5'-AGGGGGGAGGGATAGCATTAGAA-3 '; inversa: 5'-CGTCCTGCTGCCAGTGATACAAG-3'; humana
p53
: hacia adelante: 5'-CTGTCCCTTCCCAGAAAACCT-3 '; inversa: 5'-CCTGGGCATCCTTGAGTTC-3'; humana
APC
: hacia adelante: 5'-TAATACCCTGCAAATAGCAGAAATA-3 '; inversa: 5'-3-GTGGCAAAATGTAATAAAGTATCAG '; humanos
K-ras
: hacia adelante: 5'-ATGACTGAATATAAACTTGTGGTA-3'; inversa: 5'-CAACACCCTGTCTTGTCTT-3 ') seguido por secuenciación. Genotipado de 24 SNPs (rs7553007, rs1205, rs3093077, rs4073, rs1143627, rs720816, rs723504, rs1876054, rs746961, rs2371923, rs487616, rs953183, rs400328, rs950487, rs759394, rs726402, rs1568645, rs929689, rs2254896, rs1951096, rs1843026, rs1543193, rs718015 , rs16091) se llevó a cabo por el servicio de Sequenom basada en la espectrometría de masas (Genergy Biotecnología, Shanghai, china). escrito el consentimiento informado se obtuvo de los pacientes. Todos los pacientes son chinos. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Provincial de Gansu del tumor.
Resultados
No hay mutaciones somáticas recurrentes se producen a 3 común
CRP
SNP sitios en los tumores
Para ver si otros no codificante SNP sitios de
CRP
están mutados en tumores, hemos determinado los genotipos de 3
CRP
SNPs comunes (rs7553007, rs1205, y rs3093077) junto con 21 nuevos SNPs en 141 pares de muestras tumorales /normales de 5 tipos de cáncer,
es decir
gástrico, de pulmón, esófago, colon y del recto. Las frecuencias de los alelos asociados con los niveles de PCR inferiores son 48,9% para un alelo de rs7553007, 47,9% para el alelo T de rs1205, y 79,1% para el alelo T de rs3093077 en muestras normales (Tabla 1), proporcionando de este modo suficientes tamaño de las muestras para la detección de mutaciones recurrentes. Por lo tanto, hemos identificado solamente 1 caso de G & gt; A mutación en rs7553007, 0 caso de mutación en rs1205, y 2 casos de G & gt; T mutaciones en rs3093077 en las muestras tumorales emparejados. También se encontró tal una baja incidencia de mutación somática para otros 21 sitios SNP no codificante examinados repartidos en 9 cromosomas diferentes (Figura 1). Estos indican que, a diferencia de los
CRP
-286 SNP rs3091244 (mutaciones) de alta recurrencia [19], el 3
CRP
SNP sitios ensayadas en este documento están mutados al azar solamente en los tumores en el fondo frecuencia de mutación.
3
CRP
SNPs (rs7553007, rs1205, y rs3093077) y 21 nuevos SNPs de 141 pares de muestras tumorales /normal se genotipo por Sequenom. Estas muestras se obtuvieron de 37 gástrico, 12 de pulmón, 27 de esófago, colon y 24 de 41 pacientes con cáncer rectal. (A) Las frecuencias de mutación en cada SNP sitios. Ninguno de estos sitios se muta de forma recurrente en los tumores. La frecuencia de la
CRP
mutación -286 SNP (rs3091244) en estas muestras se muestra para la comparación. (B) Las frecuencias de mutación agrupados de SNPs con o sin genes asociados. SNP sitios genes asociados tienden a exhibir más bajas frecuencias de mutación aunque sin alcanzar significación estadística (dos muestras
t
prueba, de dos colas,
p = 0,47
).
de acuerdo con los resultados de genotipado, las frecuencias de mutación de SNP sitios con y sin los genes asociados son 0,97% (IC del 95%: 0,35 a 1,59%) (IC del 95%: 0,78 a 1,82%) y 1,30%, respectivamente . Aunque no es estadísticamente significativo, esto sugiere que los sitios de SNP de genes asociadas tienden a ser menos propenso a la mutación aleatoria que aquellos con asociación desconocido, posiblemente debido a las limitaciones que limitan los daños a loci genómico con importancia funcional. Del gen asociado a SNPs, rs1143627 y rs4073 son dos SNPs promotor que ubican a 31 y 199 pb aguas arriba de los sitios de inicio de la transcripción de
IL-1β
y
IL-8
, respectivamente. Sus frecuencias de mutación bajas (0,7-1,4%) argumentan que la localización promotor
per se
no es probable que la causa de la hipermutación somática en el
CRP
-286 SNP -sitio en los tumores; más bien, la alta incidencia de la mutación -286 sería el resultado de las consecuencias funcionales relacionadas con la inducción mejorada de
CRP
, que puede conferir clones de células huésped suficiente ventaja para sobrevivir y expandirse en el desarrollo del cáncer.
CRP
-286 SNP mutación se asocia con mutado
APC Hoteles en cáncer de recto
El
CRP
-286 SNP mutación es más frecuente en los cánceres de colon [19], en el que
p53
,
K-ras
y
¿Cuáles son APC entre los genes más frecuentemente mutado que promueven la tumorigénesis a través de distintos mecanismos [22 ] - [24]. por lo tanto tratamos de examinar si existe alguna asociación entre estos eventos de mutación. Mutado
p53
,
K-ras
y
APC
fueron identificados por secuenciación de sus respectivas regiones de mutación hotspot,
es decir
301 a 1044 de
p53
, 24-442 de
K-ras
, y 3922 a 4453 de
APC Hoteles en cDNA secuencia oscila, según las estadísticas de la base de datos cósmicos. A pesar de sus altas incidencias (aproximadamente 50%), el
CRP-
286 SNP mutación no muestra ninguna relación aparente con mutado
p53 gratis (n = 35; Tabla 2 y Fig. 2A) o
K-ras
(n = 35; Tabla 3 y en la Fig 2B.). La falta de asociación entre la
p53
y el
CRP
-286 mutaciones SNP también se confirmó en el cáncer de esófago (n = 36;. Tabla 4 y Figura 2C), en el que
p53
representa el gen más frecuentemente mutado.
el
CRP
-286 mutaciones SNP no muestran asociación con mutado
p53
o
K-ras en
dos puntos (AB) o cánceres de esófago (C) (prueba exacta de Fisher, de dos colas). Cada rectángulo representa una muestra del tumor con el color gris indica el estado de tipo salvaje. Los gráficos de barras de la derecha muestran los porcentajes de pacientes portadores de las mutaciones indicadas en dos grupos de pacientes con o sin mutaciones de PCR-286.
Por el contrario, en dos -fold enriquecimiento de mutantes
APC
se observaron en los tumores de colon con el concurrente
CRP
-286 mutaciones SNP (n = 38; Tabla 5 y la Figura 3A). Sin embargo, esta correlación no alcanzó la significación estadística, probablemente debido al tamaño limitado de la muestra que se podrían obtener. así Asimismo, examinó 67 tumor /pares de muestras normales de cáncer rectal (Tabla 6 y la Figura 3B), que es muy similar a la del cáncer de colon, tanto en el origen tipo celular y alteraciones genómicas [25] que muestra alta incidencia de ambos
APC
[25] y los
CRP
-286 mutaciones SNP [19]. De hecho, la co-ocurrencia de estos dos mutaciones en este conjunto de muestras se hizo más evidente (odds ratio: 5,56 IC del 95%: 1,17 a 26,36) y significativa (
p
= 0,04). Por tanto, estos resultados sugieren que la PCR y APC pueden cooperar en la superposición de las vías durante el desarrollo del cáncer colorrectal.
El
CRP
-286 SNP mutaciones tienden a co-ocurrir con
APC
mutaciones en dos puntos (A) (prueba exacta de Fisher, de dos colas,
p = 0,47
) y el cáncer rectal (B) (prueba exacta de Fisher, dos colas,
p = 0,04
). Cada rectángulo representa una muestra del tumor con el color gris indica el estado de tipo salvaje. Los gráficos de barras de la derecha indican los porcentajes de pacientes portadores de mutaciones en APC en dos grupos de pacientes con o sin mutaciones de PCR-286.
Discusión
La
in vitro
actividades de PCR [3], [4], [6], [11], [13], [14], incluyendo el reconocimiento de las señales de peligro endógenos o exógenos, la regulación de la activación del complemento, la inducción de las respuestas de células proinflamatorias, conduce a la idea de que la PCR puede funcionar como un receptor de reconocimiento de patrones soluble en la inmunidad innata y la defensa del huésped [6], [7]. Sin embargo, la falta de un apoyo constante por la investigación en modelos animales [26] - [34], los sujetos humanos [35], [36] y la epidemiología genética [15], [20], [21], [37] hace que sea incierta si la PCR desempeña un papel significativo en la inflamación crónica
in vivo
o simplemente representa un marcador inespecífico como dio a entender por su patrón de expresión fase aguda. En este sentido, la identificación de la alta recurrencia
CRP
-286 SNP mutaciones en múltiples tipos de cáncer humano [19] proporciona una evidencia convincente de que esta proteína es un factor potencial de la tumorigénesis y un componente fundamental de la reglamentación la red de la inflamación.
mutaciones promotor en
de TERT
[38], [39] y
CRP
[19] constituyen los primeros ejemplos de que las regiones reguladoras no codificantes pueden también ser dirigidos a promover la tumorigénesis mediante la modulación de la expresión en lugar de las actividades de los genes clave. Sin embargo, es algo único en caso de
CRP
que la mutación se produce en un sitio de SNP común. Esto plantea el problema de si los sitios de SNP en general son más vulnerables a las alteraciones genéticas, lo que lleva a la alta incidencia de mutaciones de pasajeros. Para solucionar este problema, genotipo 24 SNPs de 141 pares de muestras tumorales /normales. Estos SNP se encuentran en 9 cromosomas distintos, y constan de 3 SNPs de
CRP
, 2 promotor SNPs de citocinas inflamatorias, 1 SNP de un gen no codificante, 18 SNPs con asociación desconocido. A pesar de ello, todos los sitios de SNP se comprobó que estaban mutados en tumores con baja frecuencia única de fondo. Por lo tanto, la mutación altamente recurrente en el
CRP
-286 sitio de SNP es muy probablemente el resultado de la selección por el desarrollo del cáncer, pero no simplemente debido a las propiedades generales asociados con el sitio de SNP o localización genómica. Es, sin embargo, todavía es posible que la mutación -286 es solo una consecuencia de la tumorigénesis y se requieren ensayos funcionales adicionales para aclarar este punto.
No obstante, es intrigante que, aunque el 4 examinado
CRP
SNPs afectan a todos los niveles séricos de proteína C reactiva, sólo el SNP -286 es el blanco de la tumorigénesis. Esto sugiere que los efectos de los otros 3 SNP son secundarios a la SNP -286, lo que puede ser explicado en parte por la dependencia de
CRP
expresión de promotor de la metilación CpG, un mecanismo epigenético esencial en el silenciamiento de genes [ ,,,0],40]. De hecho, recientemente hemos demostrado que la expresión de niveles altos de PCR se correlaciona con una baja metilación del promotor, y viceversa [19]. De los 5 motivos CpG en
CRP
promotor, la conservadas evolutivamente -286 CpG parece ser la clave, en particular para los tipos de células extrahepáticas, al determinar el nivel basal de
CRP
expresión [19] . Como la mayoría de las mutaciones son -286 C & gt; transiciones A /T que interrumpen el motivo metilación, es concebible que tales alteraciones genéticas a su vez, contribuirá a conectar la actividad del promotor de
CRP
probablemente a través de la reducción de la señal de metilación inhibidora y facilitar la unión de factores de transcripción para la secuencia de e-box subyacente [41]. Estos pueden llegar a permitir la participación posterior de elementos reguladores distales contienen el otro
CRP
SNPs.
La alta recurrencia y la omnipresencia de la
CRP
-286 SNP mutaciones en los tumores sugieren la producida localmente CRP, en lugar de CRP circulante, impulsa el desarrollo de cáncer. Esta paradoja se puede explicar por la dependencia apretado de las acciones de CRP en microambientes inflamatorias [3], [13], [14], [36]. CRP circulante es producida por el hígado como un pentámero que muestra principalmente las actividades anti-inflamatorias [7], [42], [43]. Además de los hepatocitos, las células extrahepáticas también son capaces de secretar CRP localmente en respuesta a estímulos inflamatorios. Por otra parte, los disparadores enriquecido en loci inflamatoria induce cambios de conformación con prontitud en el CRP pentamérica publicar su
In situ
de producción [44] - [49], para liberar todo el potencial en la unión del ligando [47], [48] , [50], complementar la regulación [46], [48], [51] - [54] y la estimulación de respuestas de células proinflamatorias y angiogénicas [48], [49], [55] - [61]. Como tal, la abundancia local de CRP y sus interacciones con el microambiente estresante debe ser más relevantes a la progresión de la enfermedad; mientras que los niveles circulantes de CRP principalmente reflejar el estado inflamatorio subyacente.
La desregulación de la vía de señalización de Wnt es el caso más frecuente observado en el cáncer colorrectal, que generalmente se manifiesta mediante la inactivación de mutaciones de
APC
o activar mutaciones de
β-catenina
[25]. Una consecuencia directa de
APC
inactivación es la estabilización de
β-catenina
y la activación aberrante de los genes diana aguas abajo [62]. Por lo tanto, de interés que
CRP
ha demostrado ser un objetivo de es
β-catenina
[63]. Por otra parte, nuestros resultados ponen de manifiesto que el
CRP
-286 SNP mutaciones tienden a co-ocurrir con el mutante
APC Hoteles en tumores de colon y de recto. Estos implicarían que las dos moléculas de secreción,
es decir.
CRP y Wnt, puede actuar en retroalimentación y los modales de cooperación para promover la tumorigénesis, que merece más investigaciones. Dada la señalización de Wnt aberrante activado y altamente inducida por
CRP
expresión en tumores, tópica dirigida tanto a moléculas pueden ser una opción potencial para el tratamiento del cáncer colorrectal.
Reconocimientos
Agradecemos al Sr. . Jing Zhao por su excelente asistencia técnica.