Extracto
Las alteraciones de Ef receptores tirosina quinasas son eventos frecuentes en los cánceres humanos. Las variaciones genéticas de EphB6 se han descrito, pero el resultado funcional de estas alteraciones es desconocido. El presente estudio se llevó a cabo a la pantalla de la presencia y la identificación de las consecuencias funcionales de las mutaciones EphB6 en cáncer de pulmón de células no pequeñas. Aquí, secuenciado la región codificante entera de EphB6 en 80 pacientes no pequeñas de cáncer de pulmón de células y 3 líneas de células tumorales. Tres mutaciones potencialmente relevantes se identificaron en muestras de pacientes primarias de pacientes con CPNM (3,8%). Dos mutaciones puntuales dirigidas a las proteínas inestables. Una mutación en el marco de su eliminación (del915-917) mostró aumento de la migración y acelera la cicatrización de heridas
in vitro
. Por otra parte, la mutación del915-917 aumentó la capacidad metastásica de las células de NSCLC en un
in vivo
modelo de ratón. Nuestros resultados sugieren que las mutaciones EphB6 promover la metástasis en un subgrupo de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas
Visto:. Granel E, Yu J, Hascher A, S Koschmieder, Wiewrodt R, T Krug, et al. (2012) Las mutaciones del EphB6 tirosina quinasa del receptor inducir un fenotipo pro-metastásico en células no pequeñas de cáncer de pulmón. PLoS ONE 7 (12): e44591. doi: 10.1371 /journal.pone.0044591
Editor: William C. S. Cho, Hospital Queen Elizabeth, Hong Kong
Recibido: 8 de Mayo, 2012; Aceptado: 3 Agosto 2012; Publicado: 4 de diciembre 2012
Derechos de Autor © 2012 granel y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. NSCLC investigación en nuestro laboratorio está financiado por la Deutsche Krebshilfe y el Wilhelm-Stiftung Sander. COMO. fue financiado por la DFG Schw 407 /9-3. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es la principal causa de muerte relacionada con el cáncer con la mayoría de los casos pertenecientes al grupo de cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) [1], [2]. El desarrollo de metástasis a distancia es la principal causa de muerte relacionada con NSCLC. Las tirosina quinasas receptoras (RTK) desempeñan papeles importantes en el proceso metastásico [3], [4]. Uno de los RTK más conocido asociado con un fenotipo metástasis, es el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), con su familia ErbB2 /HER2, ERBB3 y ERBB4. RTK como la familia EGFR, por tanto, son objetivos atractivos para la mejora de los enfoques de terapia moleculares en el cáncer [3], [5]. Hasta la fecha, la subfamilia de receptores Efrina (EPH) es la mayor subfamilia de las RTK comprenden de 16 miembros en los vertebrados, es decir, los receptores EPHA 1-10 (EphA1-A10) y los receptores de EphB 1-6 (EphB1-B6) [6], [ ,,,0],7]. receptores EphB interactuar con la familia Efrina de ligandos. Tras la interacción con sus ligandos Ephrin, receptores Eph modulan una variedad de actividades biológicas, incluyendo la interacción célula-célula y la migración celular [8], [9]. La pérdida de la EphB6 quinasa-muertos se asocia con estadios avanzados del tumor y la progresión del cáncer [10] - [16]. Varias publicaciones informan sobre la expresión de alto EphB6 ser un marcador de pronóstico favorable en neuroblastoma [10] - [12]. Además, la expresión de ARNm de EphB6 se redujo en melanoma metastásico y en líneas celulares de cáncer de mama invasivo con potencial metastásico [14] - [16]. Funcionalmente, EphB6 suprime invasividad, la tasa de crecimiento y la eficiencia de formación de colonias de células de cáncer de mama cultivadas [17] - [18]., Regula la adhesión celular y la migración afecta [19]
Anteriormente, hemos identificado varios RTK humanos cuya nivel de expresión correlaciona con el desarrollo de metástasis en la etapa inicial de NSCLC [20]. Mientras que la expresión elevada de ARNm de varios RTK se asoció con un aumento de la frecuencia de aparición de metástasis, los niveles de expresión de ARNm alta de los dos RTK EphB6 y DKFZ1 indican un menor riesgo de metástasis [20]. Recientemente, hemos identificado EphB6 como un supresor de la metástasis epigenetically silenciado en NSCLC, y la expresión de EphB6 evita la formación de metástasis en un modelo de xenoinjerto de metástasis [21].
Aquí, la variación examinaron las EphB6 por secuenciación del ADN, y caracteriza el consecuencias funcionales de las mutaciones EphB6
in vivo
y
in vitro
con respecto a su papel potencial en el CPNM metástasis.
a) los dominios funcionales del gen EphB6 se muestran en la relación a sus exones y mutaciones identificadas para EphB6. La descripción de las mutaciones corresponden a su localización en la secuencia de la proteína. El R52C mutaciones, Q498H, y DPG915-917del fueron identificados en muestras de pacientes con CPNM en el estudio actual. B) electroferograma de la secuencia de tipo salvaje-EphB6 y el mutante de deleción de EphB6. C) Los niveles de expresión de EphB6 mutantes en las células transfectadas. células transfectadas a granel fueron ordenados GFP y ampliado en medios de selección. Los niveles de expresión se muestran para cultivos en masa con & gt; 90% la expresión de GFP. se muestran las diferencias de análisis de expresión entre los niveles de proteína y los niveles de ARNm. Para cuantitativa en tiempo real PCR se muestra la media y la desviación estándar de tres experimentos independientes. El western blot muestra un ejemplo representativo.
Materiales y Métodos
Cultivo de células
Las líneas celulares de cáncer que participan en el estudio actual se han descrito anteriormente [21]. Brevemente, las células de adenocarcinoma de pulmón A549 se cultivaron a 37 ° C, alta humedad y 5% de CO
2 en DMEM (Dulbecco medio de Eagle modificado, Invitrogen, Carlsbad, CA). El medio se suplementó con 10% de suero de ternera fetal (FCS) y 1% de estreptomicina y penicilina. HTB56 y HTB58 células de adenocarcinoma de pulmón se cultivaron a 37 ° C, alta humedad y 5% de CO
2 en MEM (medio de Eagle modificado, Invitrogen, Carlsbad. CA). El medio se suplementó con 10% de FCS, 1% de estreptomicina y penicilina, 1% de glutamina, piruvato de sodio 1%, y 1% aminoácidos no esenciales identidad de la línea acid.Cell fue confirmada por STR-genotipo.
las muestras
muestras de tumores primarios de pacientes y los tejidos pulmonares libres de tumor se obtuvieron en el momento de la cirugía inicial de 80 pacientes con NSCLC histología probada en un hospital universitario en Alemania. Las muestras fueron shock inmediatamente congelados y almacenados en nitrógeno líquido. Las muestras tumorales fueron comprobados para el porcentaje de las células tumorales por la histología, y sólo biopsias de tumores con células de cáncer de por lo menos 70% se utilizaron para análisis posteriores. Del mismo modo, las muestras de control sin cáncer también se confirmaron por examen histológico. Todos los pacientes dieron su consentimiento por escrito y el estudio fue aprobado por el comité de ética de la Universidad de Münster.
A) Expresión de proteínas de líneas de células A549 transfectadas de forma estable que expresan EphB6 tipo salvaje o el mutante de deleción EphB6. Las células fueron co-transfectadas utilizando un EGFP -pcDNA3.1
+ vector para la identificación de clones seleccionados. Múltiples clones se agruparon y se seleccionan adicionalmente como cultivos en masa. B) los ensayos de migración Transwell se realizaron con células de control de vector vacío, mutante EphB6 y células de tipo salvaje EphB6. Se analizaron cinco experimentos diferentes en triplicado. *: Significativo (p & lt; 0,05) por (SEA ANOVA o t-test) El p-valor previsto entre las tres líneas celulares fueron analizados estadísticamente diferentes de todas las células migraron mediante el uso de la prueba de ANOVA-OneWay. El análisis de los resultados de la prueba t por pares en un valor de p significativo para las células de control vs células EphB6-peso (p & lt; 0,015) y entre las células EphB6-peso y las células EphB6-mut (p & lt; 0,005) . C)
in vitro
ensayo cero cicatrización de heridas. Las células se rascaron por una punta de pipeta de 10 l. Las áreas de rascar se registraron durante un periode de 17 horas. Se muestran las medias de tres experimentos diferentes, calculado como porcentaje de un punto inicial para las tres líneas celulares. El ANOVA-test (p & lt; 0,002) indicó diferencias estadísticamente significativas entre las tres líneas celulares. D) Imágenes representativas de los ensayos de cero al principio y al final de los experimentos.
A) Número de metástasis pulmonares en ratones NOD /SCID evaluables cuatro semanas después del trasplante, cada uno con 3 × 10
5 células A549 transfectadas de forma estable que expresa EphB6-wT células (n = 9), EphB6-del915-917 (n = 9) o vacío de control de vector (n = 2). Los puntos representan ratones individuales y las líneas horizontales al valor medio de las metástasis. B) Las imágenes de los pulmones enteros representativas de los ratones NOD /SCID, trasplantados con células A549 que expresan EphB6-peso, EphB6-del915-917, o el control de vector vacío. Las metástasis pulmonares son marcados por flechas negras. C) Las imágenes de secciones de pulmón de ratones NOD /SCID, teñidas con hematoxilina. Las metástasis están marcados por flechas negras. Tres ejemplos representativos se muestran para cada uno de los ratones transplantados con células A549 que expresan EphB6-en peso o EphB6-del915-917.
A) la actividad proliferativa de control de vector vacío, de tipo salvaje EphB6 y células mutantes se analizaron utilizando una ensayo colorimétrico MTT después de 72 horas. Los datos se muestran como medias +/- la desviación estándar de tres experimentos independientes. Las diferencias no fueron estadísticamente significativas (ANOVA). B) el tamaño de la célula de las células individuales (n = 20) que crecen en placas de plástico se analizó por microscopía de vídeo en directo y grabado. EphB6 células mutantes mostraron un tamaño de celda reducido significativamente en comparación con el tipo salvaje EphB6 y con las células control (p & lt; 0,05, t-test).
EphB6 Secuenciación
se extrajo
El ADN genómico utilizando DNAzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Los cebadores se diseñaron con el software Primer3 (distribuidor) para amplificar la polimerasa-reacción en cadena (PCR) de fragmentos de tamaño entre 400 y 800 bps y que cubre la región de codificación completa del gen EphB6 (los detalles de la PCR se proporcionan en Material complementario). Todos Todos los fragmentos fueron amplificados por PCR con Taq ADN polimerasa (reacción de volumen total 20 l) suplementado con un potenciador de PCR casera como se describe [22]. Ambas cadenas se secuenciaron utilizando los cebadores de PCR. cebadores internos adicionales fueron utilizados para productos de PCR más largo que 600 pb para asegurar que la información de doble cadena de secuencia para todo el fragmento de PCR. La secuenciación se realizó en secuenciadores de ADN automatizados ABI3730xl con el Ciclo de Secuenciación Kit BigDye Terminator V3.1 (Applied Biosystems). La región de codificación de secuenciado
EphB6
se comparó con la secuencia de referencia (GenBank nº de acceso NM_004445).
mutagénesis dirigida
La región codificante del ADNc humano EphB6 (base de 833-3.853 NCBI Nº de Acceso NM_004445) se clonó en el vector de expresión pcDNA4 a /hisa /myc (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Las mutaciones en la secuencia de codificación de EphB6 se introdujeron con el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange XL (Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.), utilizando cebadores con las secuencias: hacia adelante (5'-AGGCTGGCGGGGAAAGGCCTTCCCAGG), marcha atrás (5'-CCTGGGAAGGCCTTTCCCCGCCAGCCT) y usando vector pcDNA4-EphB6 como la plantilla. Después, la secuencia correcta se verificó mediante secuenciación. Los cebadores para mutaciones adicionales se pueden proporcionar a petición.
construcciones de expresión y transfección
células A549 humanas fueron co-transfectadas usando el reactivo de transfección Nanofectin (PAA, Austria) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La co-transfección se llevó a cabo, ya sea con pcDNA4 (control de vector vacío), de tipo salvaje construcción de expresión EphB6 (pcDNA4-EphB6-WT) o mutante EphB6 expresión construye, cada uno con un constructo de vector que expresa EGFP (pcDNA3.1-GFP, expresando mejorada verde EGFP proteína fluorescente) para la selección y la identificación de las células transfectadas. Se seleccionaron las células transfectadas con 700 mg /ml de G418 (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) y 400 g /ml de zeocina (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). cultivos en masa eran FACS para GFP-expresión y se expandió. Además de cultivos en masa, también se agruparon los múltiples clones que expresan GFP alta para obtener suficientes niveles de expresión. La expresión se verificó mediante Western Blot y en tiempo real de RT-PCR.
Aislamiento de ARN y la transcripción reversa
El ARN total fue aislado utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Una cantidad total de 1 g de ARN de cada muestra fue inverso-transcrito utilizando cebadores aleatorios y la transcriptasa inversa MMLV acuerdo con el protocolo del fabricante (Promega, Madison, Wisconsin, EE.UU.).
Análisis de la expresión génica por cuantitativa Real- tiempo de RT-PCR
Para cuantitativa en tiempo real RT-PCR, cDNA se amplificó en un detector de secuencia 7700 ABI Prism (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). EphB6 se detectó con los siguientes cebadores y sondas: hacia adelante (5'-TGGACTATCAGCTCCGCTACTATG), atrás (5'-GTGGCAGTGTTGGTCTCGC) y la sonda (5'-FAM-TAMRA CCAGGCAGAAGACGAATCCCACTCCTT). Las cantidades relativas de expresión de genes se calcularon mediante el uso de la expresión de GAPDH como patrón interno
análisis de transferencia Western
Las proteínas se detectaron utilizando los siguientes anticuerpos:. EphB6 anti-humana (1 mg /ml, Abnova Corporation, Neihu, Taipei, Taiwán, o Abgent, San Diego, CA, EE.UU.) y β-actina (40 ng /ml, Sigma, EE.UU.) como anticuerpos primarios, de cabra anti-ratón y de cabra anti-conejo (tanto de Dianova, Hamburgo, Alemania) como anticuerpos secundarios. El análisis de transferencia Western se llevó a cabo como se describe [23]. El
Ver Azul Plus2
marcador de proteína (Invitrogen) se utilizó como un indicador de talla.
Boyden Cámara Ensayo
Un total de 5 × 10
5 células A549 ( en 100 l DMEM con 5% de FCS) se sembraron en la parte superior de una cámara Transwell® (transwell insertos de filtro en 6,5 mm de diámetro con un tamaño de poro de 5 micras, Corning Inc., Corning, NY), que era 30 min recubrió previamente con 50 mg de fibronectina. En la parte inferior de la cámara 600 l de medio DMEM con 20% de FCS (un gradiente de suero se utilizó como quimioatrayente) se añadió y el ensayo se realizó durante 16 horas a 37 ° C y 5% de CO
2 antes de células migradas fueron se analizaron por citometría de flujo. Todos los ensayos se repitieron cuatro veces y de forma independiente realizado por triplicado
In vitro Wound Healing -. Arañazos Ensayo
células A549 se sembraron en un matraz de cultivo de tejidos de 25 ml a una densidad de 350.000 células por matraz y se cultivaron durante un período de tres días. monocapas de células confluentes se rascaron luego usando una punta de 10 l-pipeta. El medio se intercambió y la curación de la herida se registró por microscopía de vídeo en directo. Las imágenes fueron capturadas en intervalos de 10 × min durante 17 h utilizando un Zeiss (luz) microscopio Axiovert 40C, vinculado a una cámara de vídeo CCD (Hamamatsu). La adquisición de imágenes se controla mediante HIPIC 32 (Sistema de Control de imagen de alto rendimiento) o WASABI (Hamamatsu software de imágenes). El análisis de la cicatrización de la herida se realizó utilizando el programa de procesamiento de imágenes ImageJ basado en Java. Los ensayos se realizaron de forma independiente por tres veces.
Análisis del Tamaño de celda
A549 células que expresan el tipo EphB6-salvaje, el EphB6-mutante o baja EphB6 (control /vector vacío transducidas) se sembraron en frascos de cultivo de células que fueron recubiertas previamente con una matriz de colágeno. Las células se dejaron adherir durante cinco horas y luego se controlaron utilizando un Zeiss (luz) microscopio Axiovert 40C, ligado a una cámara de vídeo CCD (Hamamatsu). La adquisición de imágenes se controla mediante HIPIC 32 (Sistema de Control de imagen de alto rendimiento) o WASABI (Hamamatsu software de imágenes). Se realizó el análisis del tamaño celular de las células individuales como se describe anteriormente [24], utilizando el software de visualización del programa de procesamiento de imágenes basado en Java ImageJ Amira y. El software de análisis de los parámetros de las funciones celulares a partir de células individuales, incluyendo la determinación de la superficie celular (en m
2).
Los experimentos metástasis in vivo
Para todos los experimentos con ratones, hemos utilizado 8 a 10 semanas de edad NOD.CB17-Prkdc & lt; scid & gt; J (/SCID NOD) ratones /obtenidos de Charles River. Para analizar el desarrollo de metástasis después de la inyección de las células tumorales por vía intravenosa, los ratones NOD /SCID 22 se irradiaron con una única dosis de 3,5 Gy de una unidad de 1 día de cobalto-60 antes del trasplante. Un total de 3 × 10
se inyectaron 5 células transfectadas de manera estable (disuelto en 200 l de PBS) por vía intravenosa en la vena de la cola. Cuatro semanas después del trasplante, los ratones se sacrificaron y se analizó el desarrollo de metástasis de pulmón. En dos casos, los ratones murieron dentro de una semana después del trasplante: un ratón trasplantado con expresan en peso EphB6-células A549 y un ratón trasplantados con células A549 EphB6-mutante que expresan. desarrollo de metástasis se evaluó contando nódulos metastásicos individuales. Para los análisis histológicos, los pulmones se fijaron en 4% de paraformaldehído. En todos los experimentos, se asignaron al azar grupos de tratamiento para evitar los efectos de la jaula.
Análisis estadístico
Todos los datos experimentales se muestran como media más desviación estándar si no se indica lo contrario. Los valores medios de los tres grupos se compararon mediante ANOVA OneWay de datos en bruto o en caso de dos grupos por la prueba t de Student. A p de dos caras. & Lt; 0,05 fue considerado significativo
Resultados
EphB6 variantes en el CPNM
Todos los exones de la región codificadora de EphB6 se secuenciaron por secuenciación de Sanger basado en una cohorte de pacientes con CPNM. Entre 80 pacientes con CPNM, se encontró que tres (3,8%) casos de tener mutaciones no sinónimas de EphB6 (R52C, n = 1; Q498H, n = 1, y DPG915-917del, n = 1). No hay mutaciones EphB6 fueron identificados en el A549 líneas de células, o HTB56 HTB58. Un análisis de la bioinformática por SIFT y Polyphen indicó la R52C mutaciones puntuales y Q498H como probablemente dañar (Tabla 1). Una búsqueda en la base de datos de los recientes esfuerzos de secuenciación a gran escala reveló mutaciones adicionales que hasta el momento no han sido investigados aún más (fig. 1A).
mutaciones EphB6 se identificaron en varios exones y los dominios funcionales del gen. Curiosamente, la eliminación del915-917 (fig. 1B) se encuentra adyacente a dos mutaciones (D915G y G914V) recientemente identificados en pacientes con cáncer colorrectal [25], [26]. El conjunto de mutaciones en esta región entre el catalítica de la tirosina quinasa de dominio (Tyrkc) y el motivo alfa estéril (SAM) sugiere además relevancia funcional. Esta mutación se identificó en un paciente con adenocarcinoma de pulmón. La mutación era heterocigoto y también fue detectado en correspondiente tejido pulmonar normal que indica una mutación de línea germinal. Las otras mutaciones se detectaron exclusivamente en el tumor y no en el tejido sano emparejado inficating una mutación somática.
Para los ensayos funcionales, EphB6-wildtype y varios mutantes (R52C, Q498H, del915-917 y la mutación P728S descrito previamente en el cáncer de ovario [LIT]) fueron establemente co-transfectadas con un plásmidos que expresan EGFP en la línea de células A549 NSCLC que expresa niveles muy bajos de EphB6. EGFP clones positivos se recogieron y el análisis de expresión se realizó por transferencia de Western usando el anticuerpo EphB6 en clones individuales y en cultivos a granel (Fig. 2A). A pesar de la transfección exitosa con un aumento de los niveles de mRNA, expresión de proteínas de la mayoría de los mutantes EphB6 no aumentó más allá de los niveles observados en las células transfectadas del vector vacío (Fig. 1C). Sólo para la mutación del915-917, se logró la expresión de proteínas en niveles similares a wildtype EphB6 (Fig. 2A). Debido a la insuficiencia de la expresión de la proteína adecuada de los R52C y G498H mutantes y el mutante P728S anteriormente descrito, que funcionalmente enfocados en la mutación del915-917 en NSCLC en experimentos posteriores.
Efectos de EphB6 mutaciones sobre la migración y la metástasis Las células de NSCLC
Como se informó, de tipo salvaje EphB6 inhibe la migración de las células A549 transfectadas de forma estable en una cámara transwell (cámara Boyden) de ensayo. En contraste, las células transfectadas con el mutante EphB6 del915-917 migran significativamente más rápido en este ensayo (Fig. 2B). Además, hemos realizado ensayos de cero con el microscopio de vídeo repetida a seguir el cierre cero con el tiempo. EphB6 tipo salvaje inhibe
in vitro
cicatrización de la herida en comparación con el vector vacío, mientras que las células mutantes EphB6 cierran la brecha mucho más rápida que la de tipo salvaje (tres experimentos independientes, p & lt en; 0,002, ANOVA; p & lt; 0,0004, prueba t ) (Fig. 2C, D). Parece que el mutante EphB6 no sólo inhiben la actividad de tipo salvaje EphB6, pero se aceleró el cierre de la herida en comparación con el vector vacío y de tipo salvaje. Después de ocho horas de la adherencia, el área abierta de las células mutantes EphB6 comienza a disminuir dos veces (3%) más rápido, ya que podría ser reconocido por las células de tipo salvaje EphB6 (1,6%). Incluso las células de control mostraron una menor aceleración del cierre de la herida (2%) en este punto temporal.
Para analizar la
in vivo
efectos de las mutaciones EphB6 en la capacidad metastásica de las células de NSCLC, se realizó
in vivo
ensayos de metástasis. ratones NOD /SCID se inyectaron por vía intravenosa con células EphB6-WT (n = 10), las células EphB6-del915-917 (n = 10) y las células de control de vector vacío (n = 2). se sacrificaron y se analizaron cuatro semanas después del trasplante ratones. Un ratón de cada grupo de ratones trasplantados con células que expresan EphB6-en peso y EphB6-Mut murió dentro de una semana después del trasplante. Los ratones inyectados con células que sobreexpresan EphB6 tipo salvaje mostró un menor número de metástasis de pulmón en comparación con los ratones inyectados con células de control de vector vacío o células EphB6-mutante (Fig. 3): un ratón se encontró sin metástasis, 2 ratones con cada 1 o 3 metástasis y un ratón con cada 4, 5 o 8 metástasis. Un ratón trasplantado con células de tipo salvaje EphB6 se encontró con un alto número de metástasis de pulmón. Curiosamente, en todos los ratones inyectados con células mutantes metástasis EphB6 pulmón fueron detectables (Fig 3;. P = 0,011, t-test de los datos de los ratones trasplantados con EphB6-en peso en comparación con las células EphB6-mut). Un
in vitro
ensayo de proliferación in después de 72 horas (Fig. 4A) mostró que las células mutantes EphB6 no difieren de los de tipo salvaje EphB6 células que expresan en términos de actividad proliferativa. Se obtuvieron resultados similares en ensayos de proliferación analizados después de 48 horas (datos no mostrados). Los experimentos en lugar sugieren que el aumento de la actividad metastásica
in vivo
se asoció con la alteración de las propiedades intrínsecas migratorias. la expresión del receptor EphB6 de tipo salvaje no cambió de manera significativa la forma de las células (aunque la variación de tamaño de la forma aumenta) mientras que el tamaño de las células mutantes EphB6 que crecía en placas de plástico regulares disminuyó significativamente (Fig 4B;. p & lt; 0,05, prueba t de datos de 20 células de células que expresan EphB6-en peso y EphB6-mut). En línea con estos descubrimientos, la quimiotaxis de las células en platos de plástico EphB6 pareció reducirse, muy probablemente debido a la reducción de propiedades de adhesión. Pero las diferencias no fueron estadísticamente significativas (datos no mostrados)
Discusión
Efrina -. La interacción del receptor Eph están desreguladas con frecuencia en el cáncer (de referencia). En el estudio actual se identificaron mutaciones de EphB6 como una característica pro-metastásico en el cáncer de pulmón de células no pequeñas. Una mutación, del915-917, también estuvo presente en el tejido normal correspondiente, lo que sugiere fuertemente una alteración de la línea germinal. germinal alteraciones se han descrito previamente para EphB6 en el cáncer colorrectal familiar Hasta la fecha, no se conocen las consecuencias funcionales de estas alteraciones genéticas en un nivel celular [25].
Las alteraciones de los receptores Eph se producen con frecuencia en el cáncer de pulmón. Un estudio de secuenciación a gran escala encontraron mutaciones en 10 de los 13 genes del receptor Eph en adenocarcinoma de pulmón [27]. Debido a la multiplicidad de los receptores de asociada eventos de señalización Eph y el complejo de redes de receptores, el resultado funcional de las aberraciones del receptor Eph siguen sin estar claros [28]. Para la mayoría de las alteraciones del receptor Eph identificados hasta la fecha, las consecuencias funcionales no se han estudiado.
Varias mutaciones somáticas del gen EphB6 se han identificado anteriormente en el cáncer de pulmón [27], el cáncer colorrectal [25], [26 ], el cáncer de ovario [29] y el glioma [26].
En este estudio, la proyección de 80 muestras de pacientes con CPNM y 3 líneas celulares de cáncer identificaron 3 mutaciones previamente desconocidas para el gen EphB6. Uno de este mutaciones, del915-917, reside en el dominio entre la tirosina quinasa y el dominio estéril motivo alfa (SAM), donde 2 mutaciones somáticas se identificaron recientemente en el cáncer de colon [25], [26]. La función de este dominio se sugiere estar relacionado con el cáncer, y nuestros resultados de este trabajo hacen apoyar esta sugerencia. La
in vivo
experimentos muestran claramente que la expresión del EphB6 mejorada metástasis mutado. Además EphB6-mutante células que expresan mostró un triple mejorado la migración transwell hacia un gradiente de suero (quimiotaxis). Estos resultados son consistentes con nuestros
in vivo
resultados. Los ratones trasplantados con células EphB6-mut desarrollado de manera significativa (p = 0,011) más metástasis pulmonares como ratones trasplantados con células EphB6-WT. Además de las funciones alteradas de la EphB6 del (915-917) mutante, algunos aspectos podría también sugieren una ganancia de función. Por ejemplo, los patrones de la cicatrización de heridas diferían entre wildytpe EphB6 y mutante. Es posible que existan diferencias de señalización entre el tipo salvaje y el receptor mutante. Por otro lado, también podría ser interesante especular que el receptor mutante podría actuar dominante negativo hacia otros receptores inhibitorios Ef. Esta actividad dominante negativa podría dar lugar a la observación de la ganancia potencial de la potencia función. Claramente, los estudios futuros podrían revelar las diferencias subyacentes en la señalización y la influencia de otro miembro de la EPH y redes EPH-receptor. Los estudios futuros también podrían revelar los efectos funcionales de las mutaciones no del915-917. Es probable que estos también inactivan EphB6 pero esto necesita ser confirmado en el futuro.
Recientemente, hemos podido demostrar que con frecuencia se EphB6 silenciados por mecanismos epigenéticos en el cáncer de pulmón [21], y otros podrían mostrar la misma mecanismo de inactivación en el cáncer de mama [14]. Nuestros estudios también indicaron que la pérdida de EphB6 induce un fenotipo altamente metastásico. En línea, EphB6 es la tirosina quinasa del receptor para el que la baja expresión fue la más estrechamente relacionada con un mal pronóstico en etapa temprana el cáncer no microcítico de pulmón de células [20]. EphB6 podría desempeñar un papel importante en la metástasis del cáncer de pulmón, dado que con frecuencia se epigenetically silenciado y /o mutado en una fracción significativa de los pacientes. Esto hace que sea posible que EphB6 es un modificador relevante de la capacidad metastásica en el cáncer de pulmón.
En su conjunto, las mutaciones en EphB6 que ocurren en el cáncer de pulmón de células no pequeñas podrían conducir hacia un fenotipo pro-metastásico. La pérdida de función EphB6 por disminución de la expresión o inactivación mutacional por tanto, podría contribuir a la metástasis del cáncer de pulmón.
Reconocimientos
Estamos muy agradecidos con el Dr. Wu Jianping (Universidad de Montreal, Quebec, Canadá) para proporcionar EphB6 ADNc.