Extracto
Antecedentes
La mutación de los antagonistas de la señal Wnt de APC o axina activa la señalización de β-catenina en muchos tipos de cáncer, incluyendo la mayoría de los adenocarcinomas colorrectales humanos. El fenotipo de
apc
o
axin
mutación en la mosca de la fruta
Drosophila melanogaster
es sorprendentemente similar a la causada por una mutación en el gen de polaridad segmental,
desnuda cutícula (nkd)
. Nkd inhibe la señalización de Wnt mediante la unión a la familia Dishevelled (DSH /Dvl) de proteínas de andamiaje que enlazan la activación del receptor de Wnt a ß-catenina acumulación y la transcripción TCF-dependiente, pero humana
NKD
genes todavía tienen que estar implicados directamente en el cáncer de
Metodología /Principales conclusiones
identificamos para las mutaciones primera vez en
NKD1 CD -. uno de los dos humana
nkd
homólogos - en una subconjunto de ADN no coinciden los tumores colorrectales reparación deficientes que no se sabe que albergan mutaciones en otros genes Wnt-vía. Las proteínas mutantes son defectuosos Nkd1 en la inhibición de la señalización de Wnt; Además, las proteínas mutantes Nkd1 estabilizan β-catenina y promueven la proliferación celular, en parte debido a una disminución de la capacidad de cada proteína mutante Nkd1 para unirse y desestabilizar las proteínas Dvl.
Conclusiones /Importancia
nuestros datos plantean la hipótesis de que específicos
NKD1
mutaciones promueven la tumorigénesis Wnt-dependiente en un subgrupo de adenocarcinomas colorrectales ADN reparador de desajustes deficientes y los cánceres humanos posiblemente otros Wnt-señal impulsada
Visto.: Guo J, Cagatay T, Zhou G, Chan CC, Blythe S, Suyama K, et al. (2009) Las mutaciones en el humano
cutícula desnuda
Homólogo
NKD1 Hoteles encontrados en el cáncer colorrectal Alter Wnt /Dvl /β-catenina. PLoS ONE 4 (11): e7982. doi: 10.1371 /journal.pone.0007982
Editor: Neil A. Hotchin, Universidad de Birmingham, Reino Unido
Recibido: 5 de Agosto, 2009; Aceptado: 19 Octubre 2009; Publicado: 24 Noviembre 2009
Derechos de Autor © 2009 Guo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por la Sociedad Americana del cáncer de Investigación Institucional Grant (KW); los Institutos Nacionales de la Salud (R01-GM65404 a K.W .; R01-CA60117 a S.N.T.); y la Clínica Mayo /Fundación (a W. L.). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
la activación de "canónica" Wnt /señalización en casi todos los adenocarcinomas colorrectales humanos (CRC) β-catenina hace que la vía Wnt una diana terapéutica aún sin explotar prometedor [1]. El paradigma actual de la señalización de Wnt canónica se dedujo, en parte, a través de los estudios de desarrollo elegantes de la fruta
Drosophila melanogaster
y volar el anfibio
Xenopus laevis
: En ausencia de la señal Wnt, un "complejo de destrucción" compuesto de las proteínas Apc, Axin, GSK3, y CK1 fosforila β-catenina, lo que lleva a la ß-catenina ubiquitinación y degradación proteasomal [2]. La unión de ligandos Wnt a correceptores Frizzled /Lrp activa la proteína andamio Dishevelled (DSH; DVL1, Dvl2, DVL3 en los mamíferos), dando lugar al secuestro y la degradación de Axin, que permite β-catenina se acumule, entrar en el núcleo, y se unen de transcripción TCF factores para regular los genes diana [2].
La mayoría (60-85%) de exhibición CRC humanos activados señalización Wnt canónica debido a truncar mutaciones en
APC Windows que se estabilice β-catenina [3 ]. Alternativamente, las mutaciones en β-catenina
(CTNNB1)
que la fosforilación y degradación de bloques se encuentran en algunos CRC que carecen de
APC
mutación [4]. display CRCs al menos dos tipos de inestabilidad genómica: inestabilidad cromosómica (CIN) asociado con el mutante APC y p53 y dando lugar a aneuploidía, y de microsatélites-inestabilidad (MSI) causada por el ADN defectuoso reparación de apareamientos erróneos (MMR) y dando como resultado mutaciones en secuencias simples repeticiones (SSR) en todo el genoma [5], [6]. La mutación de SSR en las regiones codificantes o de las uniones de corte y empalme de genes reguladores clave puede crear punto mutante o proteínas truncadas que promueven la progresión del cáncer; de hecho, la deficiencia de MMR y MSI son característicos de los tumores en pacientes con síndrome de poliposis hereditario el cáncer colorrectal {HNPCC; Síndrome de Lynch alias (OMIM 120435)} y de 13-17% de CCR esporádico [7].
APC
mutaciones son frecuentes en CIN-CRC [3], pero el espectro de mutaciones de genes vía Wnt en MSI-CRC está tan bien caracterizados, con mutaciones en el homólogo Axin
AXIN2
y el TCF factor de transcripción -family
TCF7L2
identificado en ~ 25% y ~ 35% de MSI-CRC, respectivamente [8], [9].
APC
mutación es menos frecuente en MSI-CRC que en CIN-CRC [10], [11], mientras que la activación de mutaciones en
CTNNB1
, aunque generalizado en todo el espectro de cáncer humano, son rara en MSI-CRC [11]. Estos datos sugieren que los mecanismos adicionales activan la señalización de Wnt /β-catenina en MSI-CRC
La cutícula desnuda (Nkd) atenúa la familia de proteínas canónica de señalización Wnt mediante la unión y proteínas posiblemente desestabilizadoras Dsh /Dvl [12] -. [ ,,,0],17].
Drosophila NKD
mutantes desarrollan defectos de segmentación letales muy similares a los observados en
apc
o
axin
mutantes [12], [18], [19] (fig. 1A ). Por lo tanto, la hipótesis de que la alteración de
actividad de los genes en los mamíferos nkd
podrían activar la señalización de Wnt y el cáncer causa. Aquí identificamos nuevas mutaciones en el ser humano
NKD1
gen en MSI-CRC que altera la señalización de Wnt y reducir NKD /interacciones Dsh. Nuestros datos sugieren que la específica
NKD1
mutaciones alteran la señalización de Wnt /β-catenina en una minoría de MSI-CRC, así como, posiblemente, en otros tumores dependientes de señales β-catenina en el que las mutaciones en los reguladores Wnt conocidos son poco frecuentes .
(A) de tipo salvaje,
axina, apc
, y
Drosophila NKD
cutículas. de tipo salvaje ha alternando bandas denticle (flecha) y la cutícula desnuda (punta de flecha), con cada mutante que carece de bandas denticle. (B)
NKD1
locus tiene 10 exones. Nkd1 esquemática (naranja) incluye miristoilación N-terminal, EFX, 30aa (azul), y los motivos carboxi-terminal-Su ricos. Se muestran las secuencias de exón 10 en torno poli- (C) extensiones (rojo) por encima nativa (negro) y los residuos mutantes (azul). (C)
NKD1
electroferogramas que muestran de tipo salvaje (WT) poli (C)
7, línea celular TC7 con C-eliminación (C6), línea celular RKO con C-inserción (C8), y HCT15 línea celular con G & gt; Una mutación (flecha) 3 'de poli (C)
7. (D, E) borrones α-Nkd1 de extractos de células enteras (D) y X-100 fracciones soluble e insoluble Triton (E) a partir de líneas celulares con indicado
NKD1
mutación. Las flechas designan proteínas Nkd1. β-actina se está cargando de control en D. CCD841 ha longitud completa Nkd1, con un producto de degradación de menor importancia en ~ 35 kDa también se observa con transfectadas
NKD1
(por ejemplo, Fig. 1E, 5C), mientras que SW480 con más abundante pero de tipo salvaje Nkd1 tiene varios productos de degradación.
Resultados
NKD1
mutaciones en el adenocarcinoma colorrectal
Se identificaron tres diferentes
NKD1
exón 10 de codificación región mutaciones en 5/11 líneas celulares de CRC y 2/40 CRC tumores esporádicos con MSI (Tabla 1), pero sin
NKD1
de codificación región mutaciones o de las uniones de empalme en 5/5 de células CRC líneas y 50/50 tumores sin MSI. Dos mutaciones, o bien una desoxicitidina (C) deleción o inserción debido al deslizamiento de la polimerasa dentro de un exón-10 poli- (C)
7 vías, dan como resultado la síntesis de las proteínas truncadas de 345 o 298 aminoácidos (aa) (Fig . 1B, C). A (C)
7-adyacente mutación sin sentido (G & gt; A) convierte Arg-288, conservado en Nkd2, a su (Fig 1B, C)..
NKD1
mutaciones no se detectaron en 32/40 tumores MSI-CRC, que contienen mutaciones en otros genes Wnt-vía, incluyendo
APC
,
CTNNB1
,
AXIN2
y
TCF7L2
, pero se encontraron en 2 de los 8/40 restantes tumores sin lesiones en estos conocidos genes Wnt-vía (p = 0,036, de una cola de prueba exacta de Fisher) (Tabla 1; véase Materiales y métodos). Estos datos indican una exclusividad mutua entre las mutaciones en
NKD1
y otros genes Wnt-vía en nuestra cohorte de muestras de tumores MSI-CRC, lo que sugiere que el
NKD1
mutaciones son de importancia patológica.
Tanto el colon CCD841 línea de células epiteliales y la línea celular SW480 CRC, este último con una C & gt; T mutación en
APC
codón#1338 [20], codificar un tipo salvaje Nkd1 (470 bis) de 53,2 kDa que migra a ~ 50 kDa en el western blot (Fig. 1D, E). Las líneas celulares Co115 y TC7, cada uno con el (C)
6 mutación, tienen una banda de ~39 kDa que corresponde a la 38,1 kDa Nkd1
C6, mientras que la línea celular RKO, con el (C)
8 mutación, tiene una banda de ~ 33 kDa que corresponde a la 33,4 kDa Nkd1
C8; las tres líneas celulares con truncada Nkd1 también tienen menos abundante de larga duración Nkd1, lo que sugiere que la de tipo salvaje
NKD1
locus no experimenta pérdida de heterocigosidad (Fig. 1D). Por Western blot con anticuerpos Nkd1 somos incapaces de distinguir de tipo silvestre del mutante Nkd1 en la línea celular HCT15, que alberga
NKD1
R288H gratis (Fig. 1D).
proteínas son NKD asociada a la membrana, los Nkds de mamíferos en virtud de N-terminal miristoilación [14], [21], [22]. Las proteínas Nkd1 truncados tienen una afinidad reducida para las membranas en comparación con los de longitud completa Nkd1 como se infiere por Triton X-100 Solubilidad: 95% de Nkd
C6 o Nkd
C8 a partir de líneas de células mutantes es TX-100 soluble, mientras 0-26% de larga duración Nkd1 de todas las líneas celulares es TX-100 soluble (Fig. 1E).
Nkd1 proteínas mutantes son defectuosos en la inhibición de Wnt /Dvl señalización
ratón Nkd1 puede inhibir la duplicación del eje inducido por la señalización de Wnt ectópico en
Xenopus
embriones [16]. Como se muestra en la Fig. 2A, & gt; 90% de
Xenopus
embriones inyectados con
XWnt8
ARNm desarrollada parcial a completa la duplicación del eje; consistente con la actividad de Nkd1 como un antagonista de Wnt, de tipo salvaje humano
NKD1
mRNA co-inyección de reducción de la frecuencia eje duplicación a 42%, con sólo el 3% duplicaciones completas. Por el contrario, la co-inyección de cada humano mutante
NKD1
dio lugar a frecuencias de duplicación de eje similar a la observada con
XWnt8
inyección sola (Fig. 2A). Al igual que en líneas celulares, misexpressed Nkd1
C6 y Nkd1
C8 fueron más abundantes que los de tipo salvaje o Nkd1 Nkd1
R288H por Western blot (no mostrados). De acuerdo con el
Xenopus
resultados, de tipo salvaje Nkd1, pero ninguno de los tres mutantes, suprimió la activación inducida por Dvl del TOPflash TCF-informador en células HEK-293 (Fig. 2B). La expresión del mutante Nkd1 solo aumentó ligeramente la actividad basal y TOPflash tuvo ningún efecto sobre endógena de
Xenopus
eje de formación (no se muestra), lo que indica que el efecto de Nkd1, como el de
nkd
en la mosca , depende de la señalización de Wnt [23].
(a)%
Xenopus
embriones con fenotipo eje indicado después de la inyección de
XWnt8
+/- de tipo salvaje o mutante
NKD1
. (N) =#embriones inyectados. Los paneles de la derecha muestran las direcciones lateral representativa (L) y dorsal (D) vistas de embriones obtenidos como un solo eje (blanco), eje corto A /P (gris claro), la duplicación del eje parcial (gris oscuro), y la duplicación del eje completo (negro) de acuerdo con los Materiales y Métodos. En los embriones con un solo eje en los paneles de la izquierda, tenga en cuenta tronco (flecha blanca) y la glándula de cemento (flecha negro). Las puntas de flecha designan cada eje en embriones con duplicaciones de eje (paneles de la derecha). Los embriones con la duplicación del eje parcial han duplicado los tejidos del tronco, pero una sola glándula de cemento, mientras que los embriones con la duplicación del eje completo han duplicado los tejidos del tronco y las glándulas del cemento. (B) la actividad luciferasa normalizada TOPflash (RLU) en células HEK-293 células transfectadas con el reportero de +/- +/- Dvl2 indicó Nkd1 construir.
NKD1
mutaciones estabilizan β-catenina y promover la proliferación celular
de acuerdo con el
NKD1
mutaciones activadoras de señalización Wnt en el CCR, los niveles citoplasmáticos y nucleares de β-catenina en las células son más altos que en las células Co115 CCD841 (Fig. 3A). En consecuencia, β-catenina nuclear era prominente en las células Co115 pero no en células CCD841 (Fig. 3B, C). células HEK-293T transfectadas con Nkd1
C6, Nkd1
C8, o Nkd1
R288H tenía niveles más altos de citosólico β-catenina que las células transfectadas con el tipo salvaje Nkd1 o un control (Fig. 3D), lo que indica que cada proteína mutante Nkd1 puede estabilizar β-catenina.
(A) Western blot de extractos citosólicos y nucleares de las células de tipo salvaje (CCD841) o mutante (Co115)
NKD1
. GAPDH y HDAC2 se probaron como controles de carga. las células (B-B ", C-C") β-catenina (rojo) y la distribución de ADN (azul) en las células CCD841 (B-B ") y Co115 (C-C"). Las flechas designan núcleos. las imágenes fusionadas en B "y C". (D) Western blot de extractos citosólicos de células HEK-293 transfectadas con
lacZ
de control (-), de tipo salvaje Nkd1 (WT) o mutante indicó Nkd1 construcción y pruebas de reconocimiento de β-catenina, Nkd1, y cargar GAPDH control. Tenga en cuenta que cada mutante Nkd1 pero no de tipo salvaje Nkd1 aumenta los niveles de β-catenina. (E) el número de células relativa como una función de días después de la infección retroviral de células CCD841 con control de vector vacío, de tipo salvaje Nkd1, o indica Nkd1 mutante (p = 0,016, 0,012, y 0,0091 para C6, C8, y los mutantes R288H en comparación con control) (F) el número de células relativa como una función de días después de la infección retroviral de células Co115 con control o de tipo salvaje Nkd1 (p = 0,022). α-Nkd1 transferencias Western de extractos celulares, con GAPDH o control de carga β-actina, se muestran a continuación en cada parcela E y F.
Desde la proliferación de células de señalización Wnt canónica promueve [2], se ensayó la acumulación de células que expresan uniformemente niveles comparables de ya sea de tipo salvaje o mutante Nkd1. retrovirales expresión de cada proteína mutante en células Nkd1 CCD841 aumentó el número de células en comparación con el de tipo salvaje Nkd1 o control de vector vacío (Fig. 3E). el número de células por el contrario, la expresión de tipo salvaje en las células Co115 Nkd1 reducida (Fig. 3F). Estos datos indican que el
NKD1
mutaciones pueden promover la estabilización de β-catenina y la proliferación de las células del colon.
Altered localización subcelular y la colocalización de Dvl truncado Nkd1
No se pudo detectar Nkd1 endógena en líneas celulares mediante inmunocitoquímica, por lo que investigar más a fondo la relación entre Nkd1 localización y actividad se analizó la localización de las proteínas marcadas en células HEK-293. Nkd1 localiza en una puntiforme, distribución predominantemente citoplasmática similar a
Drosophila
Nkd
GFP cuando se expresa en la glándula salival mosca (Fig. 4A, F). Por el contrario, Nkd1
C6 y Nkd1
C8 distribuir de forma difusa en el citoplasma (Fig. 4B y no se muestra), de acuerdo con su solubilidad detergente mejorado con relación a Nkd1 (Fig. 1E), mientras que Nkd1
agregados R288H como de tipo salvaje Nkd1 (no se muestra).
(A, B) Las células HEK-293 que expresan Bandera de etiquetado HA /Nkd1 (A) o Nkd1
C8 (B) teñidas con α-HA (verde ). Nkd1 acumula en puntos lagrimales (flechas), mientras que Nkd1
C8 se distribuye de manera difusa en el citoplasma. Nkd1
C6 distribuyen en un patrón similar al Nkd1
C8 (no mostrados). (C, D) Las células que expresan co-DVL3 y de tipo salvaje (C) o C8 (D) Nkd1
construcciones de GFP. Nkd1-GFP (verde, C) muestra cerca de colocalización completa (flechas) con DVL3 (rojo, C '), mientras que Nkd1
C8-GFP (D) se acumula en los agregados citoplasmáticos rodeados de DVL3 (flechas). las imágenes fusionadas están en C ", D", el ADN es azul en A-D. Se observaron resultados similares en las células que coexpresan Nkd1
C8-GFP y DVL1 o Dvl2, y en células que expresan Nkd1
C6-GFP y DVL1, Dvl2, o DVL3 (no mostrados). (E) de las glándulas salivales de tipo salvaje tercer instar
Drosophila
larva manchado con α-DSH (rojo) que muestra tinción difusa y punteada. (F-F ")
A8-GAL4 /UAS-Nkd
GFP
glándula salival teñidas con α-DSH y fotografiado para GFP (F) y DSH (F '; fusionó en F"). Fly Nkd
GFP relocaliza DSH a perinuclear agregados (flechas) similares a los observados con Nkd1
GFP /DVL3 en C.
Dvl proteínas se localizan en dinámico, citoplasmática y el plasma asociado a la membrana los agregados que se han propuesto para amplificar Wnt /β-catenina de señalización [24]. En consonancia con
in vitro
asociación Nkd /DSH, expresión de Nkd1
GFP en células HEK-293 o volar Nkd
GFP en las glándulas salivales dio lugar a agregados intracelulares con colocalizó Nkd y DSH /Dvl ( La Fig. 4C-C ", F-F", y no se muestra). Por el contrario, cada Dvl co-sintetizado con cada Nkd1
GFP truncado (C6 o C8) agregados formados, pero colocalización en cambio se observó en las interfaces agregadas, con agregados Dvl normalmente rodean truncadas agregados Nkd1 (Fig. 4D-D "y no mostrado). A pesar de la importancia de estas localizaciones vis-à-vis la señalización de Wnt está claro, las proteínas truncadas Nkd1 identificados en el CCR exhiben una capacidad reducida para colocalize con proteínas Dvl en comparación con los de larga duración Nkd1.
proteínas mutantes son Nkd1 defectuosas en proteínas Dvl
a continuación se investigó el mecanismo bioquímico de la inhibición de la señal Wnt defectuosa por las proteínas de unión a Nkd1 mutantes. El motivo Nkd EFX une la región básica /PDZ de Dsh /proteínas Dvl [14]. Sorprendentemente, cada mutante Nkd1, a pesar de tener un motivo EFX intacto, unido cada proteína Dvl menos de tipo salvaje Nkd1 por la levadura de dos híbridos de ensayo (Y2H) (Fig. 5A). truncamiento Nkd1 en (C)
7-vías (Nkd1
1-286) también redujo Dvl unión (Fig. 5A), lo que indica que la reducción Dvl unión no se debió a C-terminal del marco de lectura-inducida único en el dos mutantes truncadas. Cada proteína truncada Nkd1 conserva cerca de su extremo C-terminal un 30aa anfipático motivo α-helicoidal que está altamente conservado (28/30 aa) en Nkd2 [14]. En fly Nkd, un motivo 30aa posicionado de manera similar es crítico para la función y la localización nuclear [25], pero se desconoce el papel del motivo 30aa en las proteínas Nkd vertebrados. Supresión del motivo 30aa en Nkd1
1-286 restaurado Dvl unión, mientras que aún eliminación del motivo EFX eliminado Dvl unión (Fig. 5A). Estos datos sugieren que una de las funciones del vertebrado motivo Nkd 30aa es oponerse Nkd1-EFX /interacciones Dvl, que es en sí aparentemente opuesto por más secuencia C-terminal que se elimina en nuestros tumores MSI-CRC.
( a) Y2H entre Nkd1-cebos y DVL-presa ensayados para el crecimiento en el triple de deserción (3D + 3AT) o medios dobles de deserción (2D). Los gráficos de barras en unidades adecuadas espectáculo de ensayo ONPG Y2H cuantitativa. transferencia de Western indica que las proteínas mutantes Nkd1 son de la abundancia comparable (no mostrado). (B) Ensayo de GST-menú desplegable de
in vitro
traducido,
35 [S] que llevan la etiqueta Dvl1-3 con cada proteína GST-Nkd1. gráfico de barras es la intensidad de banda cuantitativa. gel teñido con Coomassie muestra cada proteína de fusión con GST, con puntas de flecha indican proteínas de longitud completa. (C) Las transferencias Western de Bandera-IPs de extractos de células HEK-293 con cantidades iguales de cada Nkd1 Bandera de etiquetado HA /, y luego probaron con α-HA (superior) y α-DVL3 (en el centro). β-actina se está cargando control (inferior). Tenga en cuenta que menos se DVL3 IP'd por Nkd1
C6 o Nkd1
C8 en comparación con los de larga duración Nkd1. No hay co-IP se observó entre los de tipo salvaje o mutante Nkd1s y DVL1 o Dvl2, que recuerda a la falta de cooperación estable entre IP
Drosophila
Nkd y DSH [13].
Se confirmó los resultados Y2H por GST-menú desplegable experimentos y coimmunoprecipitation. Como se muestra en la Fig. 5B, cada proteína Dvl presentaron menor unión a GST-Nkd1
C6 y GST-Nkd1
C8, en comparación con el de tipo salvaje GST-Nkd1, mientras que GST-Nkd1
R288H mostraron asociaciones redujeron con DVL1 y Dvl2, pero menos que con DVL3, similar a la observada por Y2H. Cuando se expresa en células HEK-293, Nkd1
C6 y Nkd1
C8 acumulan a niveles más altos que Nkd1 y Nkd1
R288H (no mostrado); por la normalización de los lisados de entrada para que se inmunoprecipitaron cantidades iguales de tipo salvaje Nkd1 y cada proteína Nkd1 mutante, se observó una reducción de dos veces en la cantidad de DVL3 co-inmunoprecipitó por Nkd1
C6 o Nkd1
C8 en comparación a Nkd1 o Nkd1
R288H (Fig. 5C). Por lo tanto, el
NKD1
mutaciones reducen Nkd1 /asociaciones Dvl
in vitro
y
in vivo
.
Mutant Nkd1s son defectuosos a alterar los niveles Dvl
Dvls pueden ser ubiquitinated y degradados por el proteasoma, y la unión de Nkd u otras proteínas de unión a DVL-conduce a la rotación Dvl [17], [26] - [28]. Por consiguiente, el
NKD1
mutaciones podrían comprometer la capacidad de desestabilizar Nkd1 Dvls. Al expresar
Drosophila
Nkd
GFP a diferentes niveles en las células adyacentes del tercer estadio
Drosophila
glándula salival, se observó consistentemente una relación inversa entre los niveles de Nkd
y GFP DSH (Fig. 6A-A "). Desde
DSH
la transcripción no se sabe que está regulada en
Drosophila
, Nkd
GFP es probable desestabilizando DSH, como se observa cuando Nkd1 se sobreexpresa en células de mamífero en cultivo [17]. A continuación, se co-transfectadas de tipo salvaje o mutante con cada Nkd1 DVL1, Dvl2, o DVL3 en células HEK-293 y se examinaron los niveles de cada proteína Dvl por Western blot. Como se muestra en la Fig. 6B, DVL1 y Dvl2, y en menor medida DVL3, fueron menos abundantes cuando se co-expresa con el tipo salvaje Nkd1 que cuando se expresa solo. Ni vacío-vector ni co-GFP expresado afectados los niveles de cada Dvl (no mostrados). En contraste, la cantidad de DVL1 detectable con la co-expresión de cada Nkd1 mutante era similar al control DVL1 de sólo transfectadas (Fig. 6B). Dvl2 niveles se redujeron en parte por cada Nkd1 mutante, mientras que los niveles DVL3 se redujeron a menos de la co-expresión de cualquiera truncada Nkd1 que por la de tipo salvaje Nkd1. Similar a la relación inversa entre Nkd
GFP y niveles Dsh en
Drosophila
de las glándulas salivales (Fig. 6A-A "), bien punteada DVL1 inmunoreactividad en las células con altos niveles de Nkd1
GFP apareció reducida en comparación con las células adyacentes con niveles más bajos de Nkd1
GFP (Fig. 6C, C '). Tomados en conjunto, nuestros datos apoyan la hipótesis de que la alteración específica de la capacidad de Nkd1 para promover la renovación Dvl podrían activar la señalización de Wnt /β-catenina durante la progresión tumoral CRC.
(A-A ")
71B-Gal4 /UAS-Nkd
GFP
tercer estadio
Drosophila
glándula salival teñidas con α-DSH y fotografiado para GFP (a) y DSH distribuciones (a ') (imagen fusionada en a "). La cuantificación de la intensidad de los píxeles DSH (caja blanca en A ') revela redujo la tinción de células que expresan más (a la derecha, asterisco verde) Nkd
GFP que en celda adyacente expresa menor Nkd
GFP. (B) Las transferencias Western de células HEK-293 transfectadas con la bandera indicada /HA-etiquetados construcciones probaron con α-HA, α-Dvl1-3, y α-βtubulin como control de carga y Nkd1 DVL1, Dvl2, o DVL3. Cada uno de los borrones Dvl1-3 fue cargado con cantidades iguales de extracto, como se confirma mediante el sondeo cada mancha con α-βtubulin. (C) HEK-293 células co-expresando Nkd1
GFP y DVL1, teñidas con α-DVL1, y la imagen de GFP (verde), DVL1 (rojo), y el ADN (azul) que muestra fina punteada distribución DVL1 en células que expresan baja y ausente Nkd1
GFP (flecha blanca). En las células que expresan adyacentes Nkd1
GFP, se DVL1 relocalized a Nkd1
GFP /agregados DVL1 (flecha amarilla), con pérdida de fina punteada DVL1 de tinción (puntas de flecha). (D, E) Modelos de función Nkd en
Drosophila gratis (D) y
NKD1
-mutant CRC (E). Las líneas dobles: = membrana plasmática superior; = menor membrana nuclear. (D) de la mosca Wg (Wnt) se une Fz /Flecha receptores (Lrp5 /6), que inhibe el complejo APC /Axin /CK1 /GSK3 que promueve la degradación del brazo (β-catenina). complejos de brazo con Pan (TCF) para activar genes diana incluyendo
nkd
. Nkd promueve la renovación DSH para inhibir parcialmente la señalización, y emplea el factor de importación nuclear de Imp-α3 a entrar en el núcleo e inhibir aún más la señalización a través de mecanismos desconocidos [31]. (E) En
NKD1
-mutant CRC, la proteína mutante se une Nkd1 y ya no promueve la renovación Dvl, la estabilización de β-catenina y la activación de la transcripción TCF dependiente de los genes diana.
Discusión
la mutación del gen supresor tumoral
APC
eleva señalización /β-catenina Wnt en la mayoría de los & gt; 1 millón de nuevos casos de CCR diagnosticados anualmente en todo el mundo [3], [29 ]. La hipótesis de que mutaciones en otros antagonistas de Wnt podrían elevar la señalización en el subconjunto de CRC, en particular MSI-CRC, sin mutaciones en reguladores Wnt conocidos. Presentamos tres casos de cáncer asociados humana
NKD1
mutaciones que alteran la señalización /β-catenina vía e interrumpen la unión Nkd1 /Dvl. Sobre la base de la frecuencia de
NKD1
mutación (5%) identificados en nuestra cohorte de MSI-CRC, se estima que
NKD1
mutaciones ocurren en hasta aproximadamente 1% de los nuevos diagnósticos de CRC, o ~10,000 casos por año.
Dado que los tumores MSI son propensos a la mutación en el genoma, se plantea la cuestión de si el
NKD1
mutaciones conducen progresión del tumor o son meramente mutaciones "espectador". Un taller Instituto Nacional del Cáncer [30] propuso cinco criterios para distinguir genes diana de buena fe a partir de mutaciones espectador, incluyendo a) una alta frecuencia de mutación, b) la inactivación bialélico, c) un papel en una ruta supresora de crecimiento, d) la inactivación de la misma vía de crecimiento de supresión en los tumores MSI sin través de la mutación en el mismo gen o en otro gen dentro de la misma vía, y e) estudios supresores funcionales, si bien la validez de estos criterios en la evaluación de mutaciones conductor raros o nuevos se ha cuestionado {por ejemplo, [6]}. Nuestro trabajo sugiere que el
NKD1
mutaciones cumplen cuatro de los cinco criterios - a, c, d, y e. Si bien la frecuencia de
NKD1
mutación era relativamente bajo en comparación a la de conocidos genes de la ruta de Wnt, una exclusividad mutua entre las mutaciones en
NKD1
y otros genes de la ruta de Wnt fue estadísticamente significativa en las muestras tumorales. La ausencia de
NKD1
mutaciones en nuestra muestra de tumores sin MSI podría ser debido a la naturaleza poco común de truncamiento específico Nkd1 en los tumores con triple vírica intacta, o debido a nuestro tamaño pequeño de la muestra. Sin embargo, otros genes en la vía de señalización de Wnt como
APC
con frecuencia están mutados, se elimina o metilado en los tumores con triple vírica intacta. bialélicas inactivación de
NKD1
no se observó, pero la presencia de tipo salvaje Nkd1 en líneas de células tumorales, así como la capacidad del mutante Nkd1 para estabilizar β-catenina, sugiere que el
NKD1
mutaciones podrían actuar dominantemente (ver abajo). Finalmente, la familia de las proteínas Nkd inhibe la señalización Wnt canónica, y esta actividad es defectuoso en las tres proteínas Nkd1 mutantes, lo que sugiere que las mutaciones alteran la señalización Nkd1 /β-catenina Wnt
in vivo
.
además, demuestran que Nkd puede limitar la abundancia DSH /Dvl tanto en cultivos celulares de mamíferos y sistemas de volar, con la mosca Nkd tener, además, las funciones nucleares desconocidos pero esenciales [25], [31] (Fig. 6D). Proponemos que las proteínas Nkd1 humanos mutantes, cada uno con una capacidad reducida para unirse y limitar la abundancia de Dvls, aumentan la actividad de Dvl Wnt-dependiente, atenuando de esta manera la degradación de β-catenina y el aumento de la transcripción TCF-dependiente de genes diana que promueven la proliferación (Fig . 6E). Sin embargo, la prevención de Nkd1 asociación directa /Dvl es aparentemente insuficiente para promover la neoplasia, como la supresión de la DVL-unión
Nkd1
motivo EFX ni ratones mutantes que son más susceptibles al cáncer ni potenció la frecuencia de
Apc
adenomas intestinales mutación impulsada por [32]. Del mismo modo, los ratones que llevan truncamiento N-terminal
Nkd1
y /o
Nkd2
mutaciones no desarrollaron tumores espontáneos [33]. Desde Nkd es parte integral de los bucles de retroalimentación en las moscas y vertebrados [12], [34], que previamente la hipótesis de que en los mamíferos la falta de actividad Nkd se puede compensar mediante mecanismos de retroalimentación redundantes, mientras que en las moscas hay tal compensación es posible dada la ausencia de genes que codifican antagonistas de señalización Wnt extracelular [33].
el apareamiento no aleatorio de las disímiles
APC
mutaciones en tumores {por ejemplo, el truncamiento de proteínas cerca de la región de la mutación grupo (MCR) con deleción alélica o metilación}, junto con los estudios funcionales de las proteínas Apc mutantes [35], [36], se ha sugerido que la célula debe retener cierta capacidad para regular la señalización /β-catenina Wnt durante la progresión tumoral - el llamado "justo" hipótesis [ ,,,0],37]. Una consideración de los papeles conocidos para la señalización Wnt /β-catenina durante la progresión del carcinoma colorrectal proporciona un razonamiento de base para esta hipótesis: en las primeras etapas, el aumento de la señalización promueve la renovación de células madre y altera la migración de las células epiteliales de las criptas [38], mientras que después actúa como un interruptor para regular epitelial mesenquimales transiciones durante la invasión y metástasis [39]. Por lo tanto, la progresión tumoral podría requerir arriba transitoria o baja regulación de la expresión del gen diana dependiendo de la carga mutacional y las condiciones ambientales locales. Dado que la proteína de tipo salvaje Nkd1 persiste en los
NKD1
líneas celulares ensayadas -mutant, la hipótesis de que las proteínas mutantes Nkd1 - cada una de las cuales conserva múltiples motivos funcionales (miristoilación N-terminal, EFX, y los motivos 30 aa ) - activar la señalización de Wnt
in vivo
, quizás análogo a la forma en que las proteínas truncadas Apc cerca del MCR activar la señalización Wnt [36]
a pesar de la abrumadora evidencia de que anormal Wnt /β-. catenina causa el cáncer, el papel de las proteínas DSH /Dvl en la neoplasia sigue siendo oscuro. señalización Wnt puede promover DSH acumulación /Dvl [40], y Dvl sobreexpresión puede imitar la activación de los /β-catenina eje de señalización Wnt [41], lo que sugiere que Dvl hiperactividad, como la estabilización de β-catenina debido a la mutación, podría ser una causa primaria de la señalización de Wnt elevada en el cáncer. De hecho, la amplificación y la sobreexpresión Dvl se ha identificado en la neoplasia {por ejemplo, cáncer de pulmón [42]}, pero la acumulación de Dvl en el cáncer también podría ser una consecuencia secundaria de oposición Wnt autoactivación ligando impulsada de señalización [43]. Dadas las funciones cruciales para DSH /Dvls en "no-canónicos" vías de Wnt que rigen plana de células-polaridad y la migración celular en vertebrados [44], el
NKD1
mutaciones también podría alterar la actividad en Dvl no canónica vías de Wnt que controlan la polaridad celular o la migración durante la progresión del cáncer. experimentos futuros se centrarán en la comprensión de cómo las proteínas mutantes Nkd1 alteran la señalización de Wnt durante la progresión del cáncer de
in vivo
.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Este estudio se realizó de acuerdo con los principios expresados en la Declaración de Helsinki. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de los hospitales de la Clínica Mayo. Todos los pacientes proporcionados consentimiento informado por escrito para la recogida de muestras y su posterior análisis. cría de rana, la fertilización in vitro y cultivo de embriones y puesta en escena se realizaron de acuerdo con protocolos estándar y todos los animales se manejaron en estricta conformidad con las buenas prácticas de los animales tal como se define por la Asociación Americana de Ciencia Animal de Laboratorio, y el
Xenopus
Para Fig. En la Fig.