Extracto
El cáncer de pulmón sigue siendo la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo, y el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) representa aproximadamente el 80% del total de casos de cáncer de pulmón. El uso de fitoquímicos dietéticos no tóxicos puede ser considerada como una estrategia quimioterapéutico para la gestión del NSCLC. En este caso, nos informan de que las proantocianidinas de semillas de uva (GSP) induce la apoptosis de las células NSCLC, A549 y H1299,
in vitro
que está mediada a través de una mayor expresión de la proteína pro-apoptótica Bax, disminución de la expresión de las proteínas anti-apoptóticos Bcl2 y Bcl-XL, la alteración del potencial de membrana mitocondrial, y la activación de las caspasas 9, 3 y poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP). Pre-tratamiento de la A549 y las células H1299 con el inhibidor de la caspasa-3 (z-DEVD-fmk) bloqueó de manera significativa la apoptosis inducida por GSP de estas células confirmó que la apoptosis inducida por GSP está mediada a través de la activación de las caspasas-3. Tratamientos de A549 y las células H1299 con GSP resultaron en un aumento de la detención en G1. G0 /fase G1 del ciclo celular es conocido para ser controlado por las quinasas dependientes de ciclina (CDK), inhibidores de la quinasa dependientes de ciclina (CDKI) y las ciclinas. Nuestro análisis de transferencia Western mostró que la detención del ciclo celular G1 inducida por GSP fue mediada a través de la mayor expresión de proteínas CDKI (Cip1 /p21 Kip1 y /p27), y una disminución simultánea en los niveles de Cdk2, Cdk4, Cdk6 y ciclinas. Además, la administración de 50, 100 o 200 mg GSP /kg de peso corporal de los ratones por alimentación forzada oral (5 d /semana) notablemente inhibió el crecimiento de
sc
A549 y de pulmón H1299 xenoinjertos de tumores en ratones desnudos atímicos, que se asoció con la inducción de la muerte celular apoptótica, aumento de la expresión de Bax, la expresión reducida de las proteínas anti-apoptóticas y la activación de caspasa-3 en células de xenoinjerto de tumor. Sobre la base de los datos obtenidos en el estudio animal, se calculó la dosis equivalente humano de GSP, que parece asequible y alcanzable. En conjunto, estos resultados sugieren que los GSP puede representar un potencial agente terapéutico para el cáncer no microcítico de pulmón de células
Visto:. Singh T, Sharma SD, Katiyar SK (2011) Las proantocianidinas de uva inducir la apoptosis por la pérdida de membrana mitocondrial potencial de las células humanas de células no pequeñas del cáncer de pulmón
in vitro
y
En Vivo
. PLoS ONE 6 (11): e27444. doi: 10.1371 /journal.pone.0027444
Editor: Surinder K. Batra, Universidad de Nebraska Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 6 Agosto, 2011; Aceptado: 17 de octubre de 2011; Publicado: 8 Noviembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Singh et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por fondos de la concesión de la revisión (SKK) Administración de Veteranos de Mérito. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón sigue siendo la causa principal de muertes relacionadas con el cáncer en los Estados Unidos y en todo el mundo [1]. Una de cada tres muertes relacionadas con el cáncer es atribuible al cáncer de pulmón, y la tasa de supervivencia a 5 años sombría de aproximadamente el 14% no ha mostrado ninguna mejora con respecto a las últimas tres décadas [2], [3]. cáncer de pulmón de células pequeñas y el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) representan el 90% de todos los cánceres de pulmón. NSCLC representa aproximadamente el 80% de todos los tipos de cáncer de pulmón e incluye carcinomas de células escamosas, adenocarcinomas y carcinomas de células grandes [4], [5]. Aunque una combinación de quimioterapia y terapia de radiación puede mejorar la supervivencia de los pacientes, la mayoría de los pacientes mueren de progresión de la enfermedad, a menudo como resultado de la resistencia adquirida o intrínseca a los fármacos quimioterapéuticos [6]. Por lo tanto, la exploración y desarrollo de agentes terapéuticos más eficaces y terapias que pueden dirigirse las moléculas asociadas con el crecimiento tumoral y la resistencia a la apoptosis dará lugar a mejores resultados en los pacientes con cáncer de pulmón.
productos naturales de plantas ofrecen nuevas opciones prometedoras para el desarrollo de estrategias quimioterapéuticos más eficaces para el cáncer de varios órganos. proantocianidinas de semillas de uva (GSP) son prometedores fitoquímicos que tienen antiinflamatorio [7] y anti-oxidante propiedades [8] - [10], y parecen exhibir un mínimo de toxicidad en animales de laboratorio [9], [10]. GSP se extraen fácilmente de uva semillas, un subproducto de las industrias de jugo de uva y el vino, y son una mezcla de varios componentes polifenólicos, que constituyen dímeros, trímeros, tetrámeros y oligómeros /polímeros de catequinas monoméricos y /o (-) -epicatechins, tal como se describe anteriormente [9], [10]. Creemos que al menos algunos de los constituyentes presentes en GSP actúan de forma sinérgica y puede proporcionar mejores efectos quimioterapéuticos que un solo constituyente.
Anteriormente, hemos demostrado que la suplementación dietética de GSP con dieta de control AIN76A resultó en una dosis- inhibición dependiente del crecimiento de A549 y xenoinjerto de tumor H1299 NSCLC en ratones desnudos atímicos, y el efecto inhibidor del crecimiento de GSP en los tumores de xenoinjertos de NSCLC se asoció con el aumento de los niveles de insulina como factor de crecimiento de unión a proteína 3 y anti- efectos angiogénicos en los microambientes del tumor (11). En otro estudio, también hemos informado de que los GSP inhiben la proliferación e inducir la apoptosis de las células de NSCLC
in vitro
y
in vivo
xenoinjertos de tumores, que se asoció con sus efectos inhibidores sobre la ciclooxigenasa 2 expresión y la producción de su metabolito de la prostaglandina, PGE
2 (12). En contraste, no se observó una inhibición significativa de la proliferación celular y la inducción de apoptosis en células epiteliales bronquiales humanas normales después del tratamiento GSP en condiciones idénticas [11], [12]. A pesar de los efectos anti-cancerígenos de GSP en las células de NSCLC, un mecanismo preciso del efecto inhibidor sobre el crecimiento de células NSCLC y la apoptosis por GSP no se entiende bien. En la presente comunicación, hemos llevado a cabo una investigación exhaustiva sobre el mecanismo responsable de la inhibición de la proliferación celular y la apoptosis cáncer de pulmón A549 y usando líneas celulares H1299 como un
in vitro
modelo de cultivo celular y
in vivo
modelo de xenoinjerto de tumor. Para estudiar el
in vivo
efecto de GSP en el crecimiento de tumores de xenoinjertos, GSP se le dio a los ratones mediante sonda nasogástrica 5 días /semana. Nos informan de que los GSP inducida por la muerte celular por apoptosis de las células de NSCLC es mediada a través de modulaciones en los niveles de expresión de proteínas pro y anti-apoptóticos, pérdida de potencial de membrana mitocondrial y la caspasa-3 vías de activación. GSP también la inspección de la progresión del ciclo celular desregulado y las proteínas reguladoras asociadas en las células NSCLC. Así, nuestros estudios proporcionan información sobre el mecanismo por el cual los GSP inducen apoptosis en estas células. Además, nuestros resultados proporcionan una justificación convincente para la actividad farmacológica de los GSP contra no pequeñas células de cáncer de pulmón de células humanas.
Materiales y Métodos
Los reactivos, productos químicos y anticuerpos
los GSP utilizados en este estudio se obtuvieron de Kikkoman Corporation (Noda, Japón). La membrana mitocondrial kit de detección de potencial JC-1 y anti-fosforilación oxidativa Complejo IV subunidad IV (Cox IV) se adquirieron de Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR). La muerte celular ELISA de detección de los kits se obtuvieron de Roche Diagnostic Corporation (Indianapolis, IN). Los anticuerpos primarios fueron adquiridos de la siguiente manera: anticuerpos para Bcl-2, Bcl-XL, Bax, caspasa-9 y -3, anti-poli (ADP-ribosa) polimerasa caspasa-9, se escindió (PARP) y β-actina se compraron de Señalización celular Tecnología (Beverly, MA); anticuerpos para el citocromo c, Smac /DIABLO, ciclina D1, ciclina D2, ciclina E, CDK2, CDK4 Cdk6, Cip1 /p21, Kip1 /p27 y los anticuerpos secundarios, peroxidasa de rábano vinculado anti-ratón inmunoglobulina G y anti-inmunoglobulina G de conejo eran obtenido de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Caspasa-3-inhibidor específico (z-DEVD-fmk) se adquirió de Calbiochem (San Diego, CA). se obtuvo ApoTarget Kit específico para ensayo de actividad de caspasa-3 de Biosource International, Inc. (San Diego, CA). de Ham F-12, RPMI 1640, penicilina, estreptomicina y tripsina /EDTA se obtuvieron de Cellgro (Herndon, VA). Los occidentales reactivos de detección de transferencia mejorado de quimioluminiscencia se compraron de Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ).
Cultivo de células y líneas celulares
líneas celulares de carcinoma de pulmón de células no pequeñas Humanos, A549 y H1299, y células epiteliales bronquiales humanas normales fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). Las líneas celulares A549 y H1299 se cultivaron como monocapas en medio de Ham F-12 y RPMI 1640 cultura, respectivamente, suplementado con 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (Hyclone, Logan, UT), 100 mg /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina y se mantuvieron en una incubadora con una atmósfera humidificada de 95% de aire y 5% de CO
2 a 37 ° C. Los GSP se disolvieron en una pequeña cantidad de dimetilsulfóxido [DMSO, la concentración máxima, 0,1% (v /v)], que después se añadió para completar medio de cultivo celular antes de la adición a las células subconfluentes (60-70% confluentes). Las células tratadas con vehículo solamente (DMSO, 0,1% en medios de comunicación) sirvieron como control.
Análisis de la muerte celular apoptótica por ELISA
Las células se trataron con GSP para 48 h y después cosechado. se determinó GSP la apoptosis inducida por el uso de la muerte celular de detección ELISA Kit (Roche Diagnostics, Palo Alto, CA), que cuantifica los fragmentos de ADN de las histonas asociadas citoplasmáticos en forma de mononucleosomes o oligonucleosomas, siguiendo las instrucciones del fabricante.
caspasa-3 ensayo de actividad
la actividad de la caspasa-3 en los lisados celulares se midió usando el kit de ensayo de proteasa ApoTarget colorimétrico (BioSource International, Inc., CA) siguiendo el protocolo del fabricante. Brevemente, A549 o células H1299 se trataron con GSP (20, 40, 60 y 80 mg /ml) durante 48 h. A partir de entonces, se recogieron las células mediante breve tripsinización y lisados celulares preparados siguiendo el protocolo del fabricante. Las muestras de los lisados celulares (proteína 100 g por muestra) se mezclaron con tampón de reacción y el sustrato /L 200 mol (DEVD-pNA para la caspasa-3) y se incubaron durante 3 horas a 37 ° C en la oscuridad. A continuación, la absorbancia se midió a 405 nm y las lecturas de la muestra calcula restando la absorbancia de las muestras en blanco.
ADN del ciclo celular análisis
células subconfluentes (50-60%) fueron tratados con concentraciones variables de GSP en medio completo durante 48 h. a continuación, se recogieron las células, se lavaron con PBS frío, y se procesaron para análisis del ciclo celular, como se detalla anteriormente [13], [14]. Brevemente, las células (1 × 10
5) se resuspendieron en 50 l de PBS frío al que se añadió 450 l de metanol frío y las células se incubaron durante 1 hora a 4 ° C. Las células se centrifugaron a 1100 rpm durante 5 minutos; el sedimento se lavó con PBS frío, se volvieron a suspender en 500 l de PBS, y se incubaron con 5 l de RNasa (20 mg /ml de concentración final) durante 30 minutos. Las células se incubaron con yoduro de propidio (50 mg /ml) en hielo durante 1 h en la oscuridad. La distribución del ciclo celular de las células luego se determinó usando FACSCalibur instrumento (BD Biosciences, San Jose, CA) equipado con el software CellQuest 3.3 en el (FACS) máquina de células activadas por fluorescencia en las instalaciones de la base del Centro de Cáncer de la UAB exhaustiva.
inmunoprecipitación y análisis de transferencia Western
Después del tratamiento de A549 y células H1299 con GSP, se recogieron las células, se lavaron con PBS frío y se lisaron con tampón de lisis enfriado en hielo suplementado con inhibidores de la proteasa, como se detalla anteriormente [12], [13]. Para la inmunotransferencia de citocromo
c
, Smac /DIABLO y Cox IV, fracciones mitocondriales y citosólicas se prepararon a partir de las células y las proteínas se resolvieron en 10% geles de Tris-glicina y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Después de bloquear los sitios de unión no específicos, la membrana se incubó con el anticuerpo primario deseado a 4 ° C durante la noche. A continuación, la membrana se incubó con anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa apropiado y las bandas inmunorreactivas se visualizaron usando los reactivos de quimioluminiscencia. Cada membrana fue despojado y volvieron a sondar con el anticuerpo anti-β-actina para garantizar la igualdad de la carga de proteínas.
Para inhibidor de CDK (CDKI) -CDK ensayo de unión, las células A549 se trataron con vehículo o 60 mg /ml GSP durante 48 h, se lavaron con PBS enfriado en hielo, y los lisados de células completas preparados como se describe anteriormente [13]. Las alícuotas que contenían 200 g de proteína se limpiaron con /G-plus perlas de agarosa con proteína A (Santa Cruz, CA). proteínas Cip1 /p21 y Kip1 /p27 se inmunoprecipitaron a partir de lisados de células enteras utilizando anticuerpos específicos después de incubación durante 8 horas, seguido de la adición de /G-más perlas de agarosa con proteína A (50 l, Santa Cruz, CA) y se continuó la incubación durante la noche a 4 DO. Los inmunoprecipitados se lavaron, y posteriormente se sometieron a análisis de transferencia de Western usando geles de Tris-glicina seguido por inmunotransferencia utilizando anticuerpos Cdk2, Cdk4 y CDK6.
Ensayo para el potencial de membrana mitocondrial
El cambio en la membrana mitocondrial potencial en las células de cáncer de pulmón después del tratamiento con GSP se determinó por citometría de flujo utilizando la sonda fluorescente catiónica lipófila JC-1 (5,5 ', 6,6'-tetracloro-1,1', 3,3'-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine yoduro) Detección Kit siguiendo las instrucciones del fabricante, y como se describe por nosotros previamente [13], [14]. JC-1 se acumula selectivamente dentro de las mitocondrias intactas para formar multímeros J-agregados de emisión de luz de fluorescencia a 590 nm. La forma monomérica emite luz a 527 nm después de la excitación a 490 nm. Por lo tanto, el color de los cambios de colorante de naranja a verde, en función del potencial de membrana mitocondrial, y se puede analizar por FACS con fluorescencia verde en el canal 1 (FL1) y la emisión de naranja en el canal 2 (FL2).
Animales y xenoinjerto de tumor estudio
ratones desnudos atímicos hembras (4-5 semanas de edad) fueron adquiridos de National Cancer Institute (Frederick, MD), que se encuentra de acuerdo con las directrices Institucional de Cuidado de Animales y el empleo, y siempre con la dieta y el agua esterilizada AIN76A
ad libitum
. Todos los ratones se mantuvieron bajo condiciones estándar de un ciclo de luz oscuridad /12-h 12-h, una temperatura de 24 ± 2 ° C, y humedad relativa de 50 ± 10%. El protocolo animal utilizado en este estudio fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Alabama en Birmingham, y aprobado Animal Número de protocolo es: 101109267.
Para determinar el
in vivo
eficacia de GSP contra el crecimiento de xenoinjerto de tumor de cáncer de pulmón humano, que crecen exponencialmente células A549 y H1299 (2 × 10
6) se mezclaron en una proporción 1:01 con Matrigel (Becton Dickinson, Bedford, MA), y un 100 l suspensión que contiene 2 × 10
6 células se inyectó sc en el flanco derecho de cada ratón. Después de 24 h, los ratones se dividieron al azar en cuatro grupos (n = 10). Los animales experimentales fueron tratados por sonda oral con 50, 100 o 200 mg /GSP kg de peso corporal /día en 100 l de PBS cinco días a la semana (lunes a viernes) comenzando un día después de la implantación de las células tumorales. Los ratones control recibieron un volumen igual de PBS. El experimento se terminó 58 días después de la inoculación de células tumorales. El crecimiento tumoral se monitorizó 2 veces por semana. El peso corporal /ratón y el consumo de la dieta /ratón se registraron con regularidad durante todo el experimento. Los animales también fueron monitoreados si llegan a ser (conductas de evitación y de aseo normales falta) o enfermos que sufren durante todo el período del experimento. En la terminación del experimento, se recogió toda la masa tumoral, se pesó, y una parte del tumor se utilizó para la preparación de lisados tumorales para analizar los niveles de expresión de diferentes proteínas de interés y una parte restante se utilizó para el análisis inmunohistoquímico.
detección inmunohistoquímica de células PCNA positivas y TUNEL-positivas
Cinco micras de espesor secciones de tumor se deparaffinized y rehidratada en una serie graduada de alcoholes. Después de la rehidratación, un proceso de recuperación de antígeno se llevó a cabo mediante la colocación de los portaobjetos en tampón de citrato sódico 10 mM, pH 6,0 a 95 ° C durante 20 minutos, seguido de 20 minutos de enfriamiento. Las secciones se lavaron en PBS y los sitios de unión no específicos se bloquearon con 1% BSA con suero de cabra al 2% en PBS antes de la incubación con anticuerpos anti-PCNA de 2 h a temperatura ambiente. Después del lavado, las secciones se incubaron con anticuerpo secundario biotinilado durante 45 min seguido de estreptavidina conjugada con HRP, lavado en PBS, la incubación con sustrato de diaminobencidina, y la contratinción con hematoxilina. La muerte celular apoptótica en los tejidos tumorales se detectó utilizando dUTP nick-etiquetado final transferasa mediada ensayos terminal deoxynucleotidyl (TUNEL). El número de células PCNA positivas y TUNEL-positivas se detectaron y se contaron usando un microscopio de luz. Los resultados se presentan como el número de células positivas x 100 /número total de células.
El análisis estadístico
Los resultados de la
in vivo
estudios son representativos de al menos 2-3 experimentos independientes. La significación estadística de la diferencia entre el control y los grupos tratados con GSP se calcularon mediante la prueba t de Student (Sigma Stat 2.03, Jandel Scientific, San Rafael, CA). Todos los datos cuantitativos se muestran como media ± desviación estándar. En el estudio de xenoinjerto de tumor, la significación estadística de la diferencia entre el control y los grupos tratados con GSP se determinó por ANOVA seguido de la prueba t de Bonferroni, y en cada caso P & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
células de NSCLC son sensibles a la apoptosis inducida por GSP
Hemos demostrado que el tratamiento de las células A549 y H1299 de NSCLC con diversas concentraciones de GSP inhibe el potencial de crecimiento o la proliferación de estas células de la dosis y dependiente del tiempo manera. GSP también indujo la muerte celular apoptótica de estas células de una manera dependiente de la concentración [11], [12]. La apoptosis inducida por GSP de las células A549 y H1299 después del tratamiento de 48 h utilizando el análisis de FACS se resume en la Figura 1A. Sin embargo, un mecanismo preciso de los efectos anti-apoptóticos de GSP contra las células de NSCLC no se entiende claramente. Por lo tanto, se realizaron los estudios para determinar el mecanismo preciso implicado en la muerte celular apoptótica de las células de NSCLC por el tratamiento con GSP.
(A)
in vitro
de tratamiento de A549 y células H1299 con GSP induce la apoptosis de una manera dependiente de la dosis. La muerte celular apoptótica se analizaron mediante análisis de FACS, y el porcentaje total de células apoptóticas en células A549 y H1299 se resumen como media ± SD, n = 3. Los controles Diferencia significativa en comparación con los no tratados GSP-:
*
P
& lt; 0,05;
¶
P Hotel & lt; 0,01;
†
P Hotel & lt; 0,001. (B) El tratamiento de células A549 y H1299 con GSP como resultado una reducción dependiente de la dosis en la expresión de proteínas anti-apoptóticas, Bcl-2 y Bcl-XL, mientras que el aumento de la expresión de la proteína pro-apoptótica, Bax, según lo determinado por El análisis de transferencia Western. Los datos son representativos de tres experimentos independientes con resultados similares.
GSP reducen la expresión de las proteínas anti-apoptóticas Bcl-XL y Bcl-2, mientras que el aumento de la expresión de la proteína pro-apoptótica Bax en A549 y células H1299
las proteínas de la familia Bcl-2 juegan un papel importante en la regulación de la apoptosis al funcionar como promotores (
por ejemplo
., Bax) o inhibidores (Bcl-2 o Bcl-XL ) de la muerte celular [15] - [17]. Utilizando el análisis de transferencia Western, se encontró que el tratamiento de la A549 y células H1299 con GSP durante 48 h como resultado una reducción dependiente de la dosis en los niveles de las proteínas anti-apoptóticas Bcl-XL y Bcl-2, y un aumento en los niveles de la proteína pro-apoptótica, Bax, en comparación con las células de control tratadas con vehículo (Figura 1 B). Así, el tratamiento de estas células de cáncer de pulmón con GSP puede alterar los niveles de proteína de los miembros clave de la familia Bcl-2 en una forma que favorece un aumento en la relación de Bax: Bcl-2, que puede contribuir a la susceptibilidad de las células cancerosas a la apoptosis [15] SGP-inducida.
GSP inducen la pérdida de potencial de membrana mitocondrial y un posterior aumento de la liberación de citocromo cy Smac /DIABLO en las células NSCLC
la pérdida de potencial de membrana mitocondrial se ha relacionado con la iniciación y activación de proceso de apoptosis en las células [15], [16]. La liberación de citocromo c y Smac /DIABLO de las mitocondrias en el citosol contribuye a la activación de las caspasas y, posteriormente, lleva a la muerte celular apoptótica. Para explorar los efectos de GSP en este proceso en el A549 y células H1299, citosólica y mitocondrial fracciones se prepararon a partir de células que habían sido tratados con GSP para 48 h. Los resultados del análisis de transferencia Western reveló que el tratamiento de GSP resultó en un incremento dependiente de la dosis en el citocromo c y la liberación de Smac /DIABLO en el citosol y la correspondiente reducción en los niveles de citocromo c y Smac /DIABLO en las fracciones mitocondriales en tanto A549 y células H1299 (Fig. 2A y 2B), lo que sugiere por lo tanto la pérdida de potencial de membrana mitocondrial en el tratamiento GSP en estas células. Los blots fueron despojados y re-probaron con anticuerpo anti-IV de la COX para descartar la posibilidad de contaminación cruzada de las fracciones mitocondriales y citosólicas. La presencia de la COX IV no se detectó en las fracciones citosólicas
(A & amp; B). Inmunotransferencia de citocromo
c
y Smac /DIABLO usando citosólica y las fracciones mitocondriales preparadas a partir de A549 y células H1299 siguiente el tratamiento con concentraciones indicadas de GSP para 48 h. Los blots fueron despojados y re-probaron con anticuerpo anti-IV de la COX para garantizar la igualdad de carga de proteína mitocondrial, así como para descartar la contaminación cruzada de las fracciones mitocondriales y citosólicas. (C) Tratamiento de células A549 y H1299 con GSP induce la pérdida de potencial de membrana mitocondrial. Las células fueron tratadas con dosis indicadas de GSP para 48 h. JC-1 de células de tinte teñidas se analizaron por citometría de flujo, como se describe en Materiales y Métodos. Los datos son representativos de dos experimentos independientes con observaciones idénticas.
A fin de verificar que los GSP inducir una pérdida de potencial de membrana mitocondrial, se utilizó el colorante lipófilo catiónico, JC-1, que se acumula dentro de las mitocondrias en una de manera dependiente del potencial. En la interrupción del potencial de membrana mitocondrial, la emisión de fluorescencia de JC-1 cambia de tinte de rojo a verde. Cuarenta y ocho horas después de la adición de los GSP, la A549 y H1299 células se recogieron, se incubaron con JC-1 tinte y la emisión de fluorescencia se analizaron usando citometría de flujo. Como se muestra en la Figura 2C, el tratamiento GSP de A549 y células H1299 resultó en un incremento dependiente de la dosis en el número de células verde-fluorescencia positiva, como se muestra en el cuadrante inferior derecho (LR) del histograma FACS. En conjunto, estos estudios sugieren que el tratamiento GSP inducir la apoptosis de las dos células de carcinoma de pulmón A549 y H1299 a través de la interrupción del potencial de membrana mitocondrial.
GSP inducen la activación de las caspasas y PARP tanto en células H1299
la liberación del citocromo
c
y Smac /DIABLO en citosol activa procaspasa 9 en el apoptosome y conduce a la activa la caspasa-9 de escisión y la escisión de la caspasa-3 [18] - [20]. La activación de la caspasa-3 conduce posteriormente a la muerte celular por apoptosis a través de la escisión de un amplio espectro de proteínas diana incluyendo PARP. Por lo tanto, se determinó si la inducción de la apoptosis de las células A549 y H1299 por GSP está mediada a través de la activación de la caspasa-3 y PARP proteínas procaspasa-9,. El tratamiento de células A549 y H1299 con GSP durante 48 h dio como resultado una reducción dependiente de la dosis en los niveles de caspasa-9, mientras que el aumento de la disociación de caspasas-9, caspasa-3 y proteínas PARP en comparación con las células tratadas con vehículo (Figura 3A ). la activación de la caspasa-3 Los GSP inducida en A549 y células H1299 también se determinó usando un ensayo de actividad de caspasa-3 colorimétrico. El tratamiento tanto de las células de cáncer de pulmón A549 y H1299 con GSP durante 48 h dio como resultado una significativamente más alta (p & lt; 0,05; p & lt; 0,001) la actividad de caspasa-3 de una manera dependiente de la dosis a la observada en las células de control tratadas con vehículo (Figura 3B).
(a) Tratamiento de la A549 y las células H1299 con GSP reduce el nivel de la caspasa-9, mientras que aumenta la activación /escisión de caspasa-9, caspasa-3 y PARP en una forma dependiente de la dosis. Las células se trataron con concentraciones variables de GSP (0, 20, 40, 60 y 80 mg /ml) durante 48 h, después se recogieron las células, lisados de células preparados y sometidos a análisis de transferencia Western para detectar los niveles de caspasa-9, troceados caspasa-9, caspasa-3 y PARP. A blot representativo se muestra a partir de tres experimentos independientes con resultados similares. (B) La actividad de la caspasa-3 en lisados celulares de las muestras del panel A se midió usando un ensayo de proteasa colorimétrico (ApoTarget Kit). tratamiento GSP a A549 y células H1299 aumenta la actividad de la caspasa-3 dependiente de la dosis. diferencia significativa frente al grupo de tratamiento no GSP,
¶
P Hotel & lt; 0,01 y
*
P Hotel & lt; 0,001. (C) El efecto de GSP (60 y 80 mg /ml) se determinó sobre la apoptosis de A549 y H1299 células después de 48 h en ausencia o presencia de 60 mmol /L del inhibidor de la caspasa-3 (z-DEVD-fmk) . El contenido de las células apoptóticas se determinó usando la detección de la muerte celular kit ELISA, como se detalla en Materiales y Métodos. Las células tratadas con z-DEVD-fmk bloquearon la apoptosis GSP-inducidas en A549 y células H1299. El porcentaje de células apoptóticas en los diferentes grupos de tratamiento se resumió y los datos se presentan como media ± DE de dos experimentos repetidos. inhibición significativa por el inhibidor de la caspasa-3 frente a los GSP células tratadas solo,
*
P Hotel & lt; 0,001. CI = caspasa-3 inhibidor, C = control, sin ningún tratamiento.
apoptosis inducida por GSP El tratamiento con el inhibidor de la caspasa-3 (z-DEVD-fmk) bloquea tanto de A549 y células H1299
Para confirmar aún más que la activación GSPS inducida de la caspasa-3 está involucrada en la inducción de la muerte celular apoptótica de A549 y las células de cáncer de pulmón humano H1299, determinamos si la apoptosis GSP-inducidas de A549 y células H1299 se vio afectada por la adición del inhibidor de la caspasa-3-específica (z-DEVD-fmk). A549 y células H1299 habían sido tratados con GSP con o sin z-DEVD-fmk (60 mmol /L) durante 48 h. Se recogieron las células y la muerte celular se analizó utilizando la célula kit ELISA de detección de muerte siguiendo las instrucciones del fabricante. Como se muestra en la Figura 3C (panel izquierdo), el tratamiento de células A549 con GSP a las concentraciones de 60 y 80 mg /ml dio como resultado 31% y 49% de apoptosis o muerte celular, respectivamente, en comparación con 6,5% en las células de control no tratados con GSP . El tratamiento de células A549 con GSP (60 o 80 mg /ml) en presencia de z-DEVD-fmk resultó en sólo el 14% y el 17% de apoptosis, respectivamente, lo que indica claramente que la presencia de inhibidor de caspasa 3-específica significativamente bloqueados GSP-apoptótica inducida por la muerte de células (
P Hotel & lt; 0,001) en las células A549. Se encontraron resultados similares cuando H1299 células fueron tratadas con GSP en presencia o ausencia de Z-DEVD-fmk, como se muestra en la Figura 3C (panel derecho). Estos resultados indican que la apoptosis tanto de las células de cáncer de pulmón humano A549 y H1299 GSP-inducida está asociada con la activación de la caspasa-3.
GSP inducir la detención del ciclo celular en fase G1 en las células NSCLC
Based en los estudios preliminares, donde se observó una fuerte efecto inhibidor del crecimiento de GSP en células de NSCLC, se determina entonces el posible mecanismo de la actividad anti-proliferativa de GSP que puede conducir a la muerte celular apoptótica. Para este propósito se determinó el efecto de GSP en la progresión del ciclo celular en células A549 y H1299 tras el tratamiento con GSP para 48 h. Como se resume en la Figura 4, (Paneles A-D), el tratamiento de células A549 con GSP resultó en un mayor número significativo de células en la fase G1 a todas las concentraciones utilizadas: 20 mg /ml (58,3%,
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& lt; 0,05), 40 mg /ml (67,9%,
P Hotel & lt; 0,001) y 60 mg /ml (75,5%,
P Hotel & lt; 0,001) en comparación con la no -GSPs bajo tratamiento de control (52,7%). Como se indica en la Figura 4 (izquierda paneles A-D), el efecto dependiente de la dosis de GSP en arresto G1 en células A549 fue en gran medida a costa de células en fase S con un cambio mínimo en la población de células G2-M en comparación con la no las células de control tratadas con -GSPs (Panel A). efecto similar de GSP de detención en la fase G1 también se encontró en las células H1299 (Figura 4, paneles de la derecha A-D). Los resultados de la distribución del ciclo celular en cada dosis de GSP también se resumen en el panel de E, que indica la detención significativa de las células A549 y H1299 en la fase G0-G1 después del tratamiento GSP.
Las células fueron tratadas ya sea con vehículo ( 0,1% de DMSO en medio) o 20, 40 y 60 mg de dosis /ml de GSP en medio completo. Después de 48 h de tratamiento, se recogieron las células y se digirieron con ARNasa. El ADN celular se tiñó con yoduro de propidio y análisis de citometría de flujo se realizó para analizar la distribución del ciclo celular, como se detalla en los Materiales y Métodos. (A-D) la distribución del ciclo celular en A549 (paneles de la izquierda) y H1299 (paneles de la derecha) de las células con el tratamiento de diversas concentraciones de GSP. (E) Los datos de la distribución del ciclo celular se resume y se presentan como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes. Estadísticamente significativa frente a la no tratada GSP grupo de control,
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P Hotel & lt; 0,05 y
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GSP disminuir la expresión de proteínas reguladoras G1 de las CDK y ciclinas en las células NSCLC
los estudios han demostrado que las Cdk y ciclinas desempeñan un papel crucial en la regulación de la progresión del ciclo celular [21], por lo tanto, se determinó el efecto de los GSP en el los niveles de proteína de las CDK y ciclinas que están regulados negativamente por CDKI (Cip1 /p21 Kip1 y /p27) durante la progresión del ciclo celular fase G1. Como se muestra en la Figura 5 (Panel A), el tratamiento de células A549 con GSP dio como resultado una marcada disminución en la expresión de CDK2, CDK4 y Cdk6 de una manera dependiente de la dosis a las 48 h después del tratamiento GSP. Se observó una fuerte reducción en las Cdk a las dosis de 40-80 concentraciones g /ml de GSP. Del mismo modo, se observó una marcada reducción en la expresión de las ciclinas D1, D2 y E de una manera dependiente de la dosis. También se encontró efecto idéntico de GSP cuando las células H1299 se trataron con GSP y en condiciones idénticas (Figura 5A, paneles de la derecha).
Las células se trataron con vehículo (0,1% DMSO en medio) o GSP (20 , 40, 60 y 80 mg /ml) durante 48 h y a partir de entonces cosechada, lisados de células preparados y después se sometieron a SDS-PAGE seguido de análisis de transferencia Western, como se describe en Materiales y métodos.