Extracto
Objetivo
procianidinas de semillas de uva (PC) son oligómeros flavan-3-ol y polímeros conocidos por su actividad biológica en el intestino. El extracto de semilla de uva (GSE) han sido reportados para reducir la lesión intestinal en un modelo de rata de la mucositis. Hemos tratado de investigar los efectos de las fracciones purificadas de PC que difieren en grado medio de polimerización (MDP) en combinación con 5-fluorouracilo (5-FU) la quimioterapia sobre la viabilidad de las células de cáncer de colon (Caco-2).
Diseño
SixPC fracciones (F1-F6) se aislaron a partir de semillas de Cabernet Sauvignon en dos estados de madurez: inmaduras pre-envero (inmaduros) y maduros (maduro), utilizando gradiente de paso, cromatografía de baja presión en una columna Sephadex LH-20 resina. Las fracciones se ensayaron en células Caco-2, solo y en combinación con 5-FU. Las fracciones eluidas se caracterizan por cromatografía de permeación en gel y phloroglucinolysis. La viabilidad celular se determinó por el (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil-tetrazolio) (MTT) ensayo de 3-.
Resultados
Todas las fracciones aisladas redujeron significativamente Caco-2 la viabilidad celular en comparación con el control (P & lt; 0,05), pero F2 y F3 (MDP 2-6) fueron las fracciones más activas (inmaduros F2 = 32% MDP 2.4, F3 = 35% MDP 5,8 y madurar F2 = 13 % MDP 3,6 y F3 = 17% MDP 5,9; porcentaje de células viables restantes) en células Caco-2. Cuando se combina con 5-FU, fracciones inmaduros F1-F3 mejorarse los efectos de toxicidad celular de 5-FU por 27 a 73% (
P & lt; 0,05
). semilla madura fracciones de PC (F1-F4) mejora de forma significativa la toxicidad de 5-FU por 60 a 83% contra células Caco-2 (
P & lt; 0,05
). Por otra parte, algunas fracciones solas eran más potentes en la disminución de la viabilidad en células Caco-2 (
P & lt; 0,05
; fracciones inmaduros = 65-68% y las fracciones maduros = 83-87%) en comparación con el 5-FU solo ( 37%).
Conclusiones
PCs de MDP (2-6 inmaduros F1-F3 y F1 maduro y F4) no sólo mejora el impacto de 5-FU en matar las células Caco-2, sino también superado estándar de quimioterapia con 5-FU como un anti-cáncer agent.The bioactividad de PC, por lo tanto se atribuye principalmente a los PC de bajo peso molecular
Visto:. Cheah KY, Howarth GS, Bindon KA, Kennedy JA, Bastian (SEP 2014) de bajo peso molecular las procianidinas de semillas de uva aumentar el impacto de la quimioterapia 5-fluorouracilo en
Caco-2 células
cáncer de colon humano. PLoS ONE 9 (6): e98921. doi: 10.1371 /journal.pone.0098921
Editor: Rajeev Samant, Universidad de Alabama en Birmingham, Estados Unidos de América
Recibido: 17 Noviembre 2013; Aceptado: May 7, 2014; Publicado: 6 Junio 2014
Derechos de Autor © 2014 Cheah et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El profesor Gordon Howarth es apoyado por una beca de investigación del Consejo Superior del cáncer del Instituto de Investigación médica de la Salud y el sur de Australia. El presente estudio se realizó bajo la colaboración entre el vino Ciencia y Business Group, la Universidad de Adelaida y del Instituto Australiano de Investigación del Vino (AWRI). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal tiene la mortalidad segunda más alta, y es la cuarta forma más frecuentemente diagnosticado de cáncer en los Estados Unidos [1]. El tratamiento primario para el cáncer de colon implica la resección del intestino quirúrgico y la quimioterapia, lo más a menudo por 5-fluorouracilo (5-FU) [2]. Por desgracia, la quimioterapia no puede discriminar entre células normales y cancerosas, y se dirige a áreas en las que se sustituyen las células a una alta velocidad, tales como en la boca y el intestino [3]. Esto conduce al desarrollo de mucositis (toxicidad gastrointestinal). tratamientos mucositis actuales son en gran medida ineficaces, ya que se dirigen sólo los síntomas, pero no la patogénesis de la enfermedad [3]. Por lo tanto, es importante buscar nuevos tratamientos alternativos que no sólo se dirigen a la mucositis, sino también mejoran la acción quimioterapéutica sin comprometer el bienestar de los pacientes.
Cada vez más, los extractos de semilla de uva (GSE) están siendo estudiados debido a su reportado beneficios de salud para una variedad de trastornos tales como el cáncer [4], la enfermedad cardiovascular [5], [6] y la colitis ulcerosa [7], [8]. Los efectos beneficiosos de GSE se han atribuido a procianidinas polifenólicos (PCs) [9], que comprenden subunidades flavan-3-ol. La longitud de polímero de PC se describe por el grado de polimerización (DP). Debido a su estructura polimerizada, absorción celular se limita a oligómeros con un DP inferior, dejando a las moléculas más grandes DP para la adsorción en la luz del intestino tras la administración oral [10], [11]. Varios estudios han informado de la polimerización y galoilación de PC a ser responsables de sus efectos antiproliferativos sobre las células transformadas [9], [12], [13].
Hay cada vez más pruebas que sugieren GSE son eficaces en la reducción de la proliferación de las células cancerosas sin ser citotóxica para las células normales [14]. Además, GSE ha demostrado mejoría parcial de daño intestinal en un modelo de rata de mucositis intestinal y ha reducido la toxicidad celular gastrointestinal después del tratamiento de quimioterapia en IEC-6 células intestinales normales [15]. Sin embargo, los componentes bioactivos en GSE siguen siendo desconocidos. El objetivo principal de este estudio fue identificar la composición química de las fracciones bioactivas de PC, e investigar su potencial en combinación con quimioterapia con 5-FU, por sus efectos sobre la viabilidad de las células de cáncer de colon. Cuando en combinación con 5-FU, ciertas fracciones de PC ampliado aún más la toxicidad en células de cáncer de colon.
Materiales y Métodos
declaraciones de ética
muestras de uva Cabernet Sauvignon se obtuvieron de fuentes comerciales viñedos, abrazo Vinos (Orlando) en la región de cultivo de Langhorne Creek de Australia del Sur, que tiene una latitud de 35 ° 16'11.56 "S y longitud 139 ° 00'14.47" e, con una elevación de aproximadamente 28 m sobre el nivel del mar. Se requiere de permisos para el estudio descrito, que cumple con todas las regulaciones pertinentes
toma de muestras y preparación de uva
muestras de uva fueron recolectados en diferentes etapas de madurez:. inmadura (preveraison, semillas verdes) y madura (25-26 ° Brix, semillas marrones) durante la temporada de crecimiento de 2009. bayas de uva se prepararon de acuerdo con un método descrito previamente [16] en el que se recogieron y se mantuvieron congeladas a -20 ° C uvas. Aunque todavía congelado, las semillas se retiran de la carne con un bisturí. Las semillas fueron entonces limpiarse de carne con una toalla de papel y volver a congelar a -20 ° C antes de la extracción.
Preparación y extracción de semillas procianidinas (PC)
extracción de PC comenzaron extrayendo semillas (100 g) durante la noche durante 18 h en 70% de acetona (200 ml, v /v) y ácido ascórbico (1 g /l). El extracto se concentró a presión reducida a 35 ° C (4011 HeidolphLaborota evaporador rotatorio, John Morris Scientific, Adelaide, Australia), y se liofilizó para dar un polvo seco (Dynavac FD3 secador por congelación, Dynavac Pty Ltd, Sydney, Australia). Los rendimientos de cada muestra fueron: inmaduro 6,31 g y maduro 10,29 g. polvo de semilla de PC (5 g) se disolvió en 50 ml de metanol (60%, v /v) que contenía ácido trifluoroacético (TFA) (0,05%, v /v) y luego se aplica (~18.3 mL /min) para un total de 300 mm x columna de vidrio de 21 mm (Michel-Miller, Vineland, NJ, EE.UU.) que contiene resina de cromatografía Sephadex LH20 (Amersham, Uppsala, Suecia) a un volumen de lecho aproximado de 93 ml, y se lavó fuera en 250 ml de metanol (60%, v /v) que contiene TFA (0,05%, v /v) para eliminar los monómeros de bajo peso molecular. entonces PC se recuperó en 150 ml de acetona acuosa (70%, v /v) y los extractos se concentró en un evaporador rotatorio a 35 ° C para eliminar la acetona. La solución acuosa se extrajo con hexano para eliminar el material lipófilo residual usando un embudo de separación. El extracto acuoso se liofilizó en polvo y se recuperó la cantidad de dos extractos se; inmaduro, 2,5 g y maduro, 0,9 g, respectivamente. Los polvos se mantuvieron en atmósfera de nitrógeno y a -20 ° C antes del fraccionamiento.
Para fraccionamiento de PCs, polvo de semilla de PC (0,5 g) se disolvió en metanol (60%, v /v) que contiene TFA (0,05% , v /v) y se aplicó a la misma columna en condiciones idénticas. extracto de semilla de PC se fraccionó según un método de elución paso a gradiente descrito anteriormente [16] para producir 6 fracciones con el aumento de grado medio de polimerización (MDP) y los pesos moleculares de PCs designadas como F1 a F6. Las fracciones eluidas se concentraron bajo presión a 35 ° C para eliminar los disolventes orgánicos y se liofilizaron más en polvo seco. Las fracciones aisladas se almacenaron a -20 ° C antes del análisis. El extracto de semilla de uva es un generoso regalo de Tarac Technologies (GraPex tanino de semilla; North Adelaide, Australia del Sur) y se incluyó en el estudio como control. GSE (1 g) se disolvió en metanol (60%, v /v) que contiene TFA (0,05%, v /v) y se fracciona en consecuencia.
catálisis ácida de PC en presencia de exceso de floroglucinol (Phloroglucinolysis)
Phloroglucinolysis se utilizó para determinar la composición de subunidades, MDP y galoilación de PC. Pholoroglucinolysis se realizó según un método descrito previamente [16]. fracciones de semillas se disolvieron en metanol (10 mg /ml, v /v) y volúmenes iguales (25 mu l) de extracto y la solución de floroglucinol (0,2 N HCL y 100 g /L floroglucinol y el ácido 20 g /L ascórbico) para dar una final concentración de PC de 5 g /L. La reacción phloroglucinolysis se realizó a 50 ° C durante 25 min y se analizó por RP-HPLC utilizando (-) -. Epicatequina (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) como el estándar cuantitativo
cromatografía de exclusión molecular ( )
cromatografía de exclusión molecular GPC se realizó sobre la base de un método descrito previamente [16]. La técnica GPC caracteriza información sobre la distribución del tamaño de PC para cada fracción. muestras fraccionadas (10 mg /ml) se disolvieron en metanol y se diluyó adicionalmente con 4 volúmenes de fase móvil de HPLC (
N, N-dimetilformamida
que contiene ácido acético glacial (1%, v /v), agua (5 %, v /v) y cloruro de litio 0,15 M). El caudal se mantuvo a 1 ml /min con una temperatura de columna de 60 ° C y la elución se monitorizó a 280 nm. La cantidad máxima de PC se inyectó en la columna fue de 40 mg. fracciones de semillas de PC a partir de un estudio previo [17] se utilizaron como patrones de calibración. Las curvas de calibración de los PC fraccionados con su distribución de masa acumulada se representaron y la masa molecular media de las fracciones se predijo en el 50%.
férrico reducción de la potencia antioxidante (FRAP) de ensayo
Este ensayo se llevó siguiendo un protocolo modificado [18]. En pocas palabras, el reactivo FRAP se preparó (300 mM de tampón acetato, pH 3,6, 10 mM de 2,4,6-tri [2-piridil] () TPTZ solución en HCl 40 mM, cloruro ferroso 20 mM-triazina -s; en 10: 01:01 v /v) y se mantuvo en la oscuridad a 37 ° C antes del análisis. Las fracciones se disolvieron en dimetilsulfóxido (DMSO) (0,1 mg /ml) y 15 l se añadieron a placas de 96 pocillos. 15 l de reactivo FRAP se añadieron a los pocillos que contienen las fracciones y la placa se leyó a 593 nm después de 4 minutos (Multiskan Spectrum, Therma Electron Corporation, Vantaa, Finlandia) usando el software SkanIt 2.2. sulfato ferroso (0,1-1 mM) se utilizó para construir un estándar de valores de la curva y el FRAP de los compuestos de ensayo se expresaron como mMFe (II) /g de muestra. Cada tratamiento se ensayó por triplicado y todo el experimento se repitió tres veces. Los datos se expresan como media ± SEM de 3 experimentos independientes.
Preparación de las células y el tratamiento experimental
La línea celular de cáncer de colon humano, Caco-2 se obtuvo de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, EE.UU.). Las células se mantuvieron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) a 37 ° C y en un CO 5%
2 incubadora. Los medios se reemplazan dos veces en cada semana. fracciones de PC se disolvieron en DMSO y se mantuvieron a -20 ° C antes del análisis. Caco-2 células se sembraron a 1000 células /pocillo en placas de 96 pocillos de cultivo de tejidos (Grenier Bio-One, Victoria, Australia) y se incubaron a 37 ° C en 5% de CO
2 para 48 h para permitir la unión. Después de 48 h de incubación, los medios se sustituyeron con diferentes concentraciones de las fracciones de semillas disueltos en DMEM (g /ml) que contiene & lt; 0,025% (v /v) de DMSO y 5-FU (100 mM) (DBL, Mayne Pharma Pty . Ltd., Victoria, Australia). Las células fueron incubadas a 37 ° C, 5% de CO
2 por 24, 48 y 72 hrs.
MTT ensayo
El (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il ) -2,5-difenil-tetrazolio) (MTT) ensayo se realizó sobre la base de un método descrito previamente, con ligeras modificaciones [19]. Después de la exposición a los tratamientos (extractos de semillas y 5-FU), 50 l de MTT (/ml en fosfato de Dulbecco solución salina tamponada con 1 mg) se añadió a cada pocillo y además se incubó a 37 ° C, 5% de CO
2 para 4 h. Después de 4 h, el medio se aspiró y 100 l de DMSO añadió para disolver el producto formazan. Las placas se colocaron en una incubadora de agitación durante 15 min y se leyó a 570 nm mediante un espectrofotómetro UV. Cada tratamiento se ensayó por triplicado y todo el experimento se repitió tres veces. Los datos se expresan como media ± SEM de 3 experimentos independientes. Los datos se expresaron como el número de células viables en comparación con el porcentaje de control de las células tratadas con DMEM libre de suero. Las células de control representan ya sea de células tratadas con DMEM libre de suero solamente o de células tratadas con 100 mM 5-FU.
El análisis estadístico
Cada experimento basado en células se realizó al menos 3 veces. Los análisis estadísticos se realizaron con XLSTAT versión 12.0 para Windows o la versión estadística SPSS 18. El análisis estadístico se determinó mediante ANOVA de dos vías con
prueba post-hoc de Tukey
.
Un coeficiente de correlación de Pearson se calculó para determinar la relación entre las viabilidades de células, composición PC y el valor antioxidante. La significación estadística se consideró a
P
. & lt; 0,05
Productos químicos
La acetona, ácido ascórbico, metanol, ácido trifluoroacético (TFA), floroglucinol, (-) - epicatequina, N, N-dimetilformamida, cloruro de litio, acetato de sodio (CH3COONa), 2,4,6-tri [2-piridil] -s-triazina (TPTZ), cloruro ferroso y metanol fueron adquiridos de Sigma Chemical Co. Ltd, St Louis , MO. El ácido clorhídrico (HCL), ácido acético glacial, el reactivo de Folin-Ciocalteu y sulfato ferroso se adquirieron de AnalaR, BDH, Merck, Pty. Ltd., Australia. soluciones de cultivo de tejidos incluyen Modificado Mínimo Medio de Dulbecco de Eagle esencial (DMEM), fosfato de Dulbecco solución salina tamponada, sulfóxido de dimetilo (DMSO) y 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil-tetrazolio) (MTT) fueron adquirido de Gibco BRL, vida Tehnologies Pty Ltd, Australia.Pty. Ltd.
Instrumentación
Un modelo Agilent 1100 HPLC (Agilent Technologies Australia Pty Ltd., Melbourne, Australia) fue utilizado con el software ChemStation de análisis de cromatografía.
Caracterización de las fracciones de PC
GSE se incluyó en el estudio como control. La composición de PC de GSE se ilustra en la Tabla 1. En comparación con los extractos de semilla de Cabernet Sauvignon, GSE tenía conversión baja masa (23,8% w /w) y también una masa molecular inferior, tal como se mide por phloroglucinolysis y GPC. Las subunidades terminales PC en GSE fueron dominados principalmente por (-) - epicatequina-3-
O
-gallate. Debido a la aparente baja contribución de PC en GSE, aislamos los PC de la semilla fresca Cabernet Sauvignon cosechado en diferentes etapas como los informes previos mostraron una alta conversión en masa en las semillas de uva sin procesar [16].
Al comparar purificada PC de ambas muestras de semilla, la semilla inmadura tenía mayor conversión de masa (87%) en comparación con semillas maduras (71%) (tabla 2). Los PCs purificados se fraccionaron adicionalmente en 6 fracciones con el aumento de MDP o la masa molecular. El rendimiento de conversión en masa para la conversión de PC en PC conocido era & gt; 49%, a excepción de la más alta MDP F6 (aproximadamente 37%). Las principales diferencias entre las fracciones de semillas inmaduras y maduras estaban maduras que las fracciones tenían una mayor proporción de (-) - epicatequina subunidades terminales (9-30%) en comparación con las fracciones inmaduros (2-11%). Ambas fracciones de semillas maduras e inmaduras mostraron un patrón similar de la disminución de subunidades terminales epicatequina con el aumento de MDP - (-). Curiosamente, los aumentos en la polimerización o el peso molecular fueron controlados principalmente por (-) - epicatequina-3-
O
subunidades de extensión -gallate. El galoilación de fracciones inmaduros varió desde 15 hasta 35% y las fracciones maduros cubre 9-24%. Inmadura F2 tuvo el mayor galoilación (35%), impulsado principalmente por una alta proporción de (-) -. Epicatequina-3-
O
-gallate (88%) guía empresas
Antioxidante capacidad de las fracciones de semillas
la capacidad antioxidante de las fracciones de semillas se midió por el ensayo FRAP (Figura 1). GSE, que contenía una mezcla de oligómeros y polímeros de los PC, se incluyó como control positivo para determinar la actividad antioxidante de las fracciones de semillas. En comparación con GSE (5 mM /g), todas las fracciones tenían valores más altos FRAP, que van desde 5,4 hasta 8,8 mM /g. La capacidad antioxidante de las fracciones disminución en las fracciones de PC más polimerizados. Los valores FRAP se correlacionaron negativamente con MDP (r
2 = -0.81,
P Hotel & lt; 0,05).
Los resultados se expresan como media ± SEM de 3 experimentos independientes. El análisis estadístico se determinó mediante ANOVA de una vía con
post-hoc
la prueba de Tukey. Los valores con diferentes letras (a, b, c) en cada columna son estadísticamente diferentes a P & lt;. 0,05
Efectos de las fracciones de semillas sobre la viabilidad de las células Caco-2
La efectos citotóxicos de fracciones de semillas en células Caco-2 se determinaron por el ensayo MTT (Figura 2). Caco-2 células fueron expuestas a las semillas de fracciones para 72 hr y los datos expresados como IC
50, definidos como la dosis de cada compuesto que inhibió la viabilidad celular a 50%, lo que representa el valor medio de tres experimentos independientes. Todas las fracciones mostraron un grado de toxicidad según lo indicado por los valores de absorbancia disminuyó. El IC
50value (media de los tres experimentos independientes) para las fracciones de semillas inmaduras (F1-F6) osciló desde 17,7 hasta 70,2 mg /ml (Figura 2A). El número de células viables se correlacionó positivamente con el MDP de fracciones de semillas inmaduras (r
2 = 0,48,
P Hotel & lt; 0,05), es decir, las fracciones con mayor MDP (F5 y F6) eran menos tóxicos a células Caco-2. También se observaron tendencias similares en cuanto a los efectos citotóxicos de la aplicación de las fracciones de semilla madura (Figura 2B), donde el número de células viables fue de manera similar correlacionado con el MDP de las fracciones (r
2 = 0,50,
P Hotel & lt; 0,05). fracciones de semillas maduras mostraron citotoxicidad más fuerte en comparación a las fracciones de semillas inmaduras (Figura 2A y 2B).
Los datos se expresan como IC
50 o la dosis (mg /ml) la inhibición de la viabilidad celular a 50% (media ± SEM ) de 3 experimentos independientes. El análisis estadístico se determinó mediante ANOVA de una vía con
post-hoc
la prueba de Tukey. Valores con letras diferentes (a, b, c) en cada columna fueron estadísticamente diferentes a P & lt;. 0.05
El efecto combinado de fracciones aisladas de semillas y 5-FU en la viabilidad de las células Caco-2
El efecto combinado de las fracciones de semillas y 5-FU en células Caco-2 se investigó (Figura 3). Para las fracciones de semillas inmaduras, la viabilidad de las células Caco-2 se inhibió significativamente por todas las fracciones de semillas (Figura 3A). En comparación con GSE (67%), F2 y F3 de extractos de semillas inmaduras fueron más tóxicos para células Caco-2 (F2, F3 y 32%, 35% del valor de control,
P
& lt; 0,05). Sin embargo, cuando las fracciones de semillas estaban presentes con 5-FU (100 uM), los efectos inhibidores del crecimiento de 5-FU se mejoraron significativamente (
P Hotel & lt; 0,05) (Figura 3A). 5-FU redujo significativamente la viabilidad celular a 62% de los valores de control (
P Hotel & lt; 0,05). F1-F3 mejora de forma significativa la actividad inhibidora del crecimiento de 5-FU (27%, 73% y 56% respectivamente, en comparación con el control de 5-FU;
P
& lt; 0,05). por lo tanto, F2 podría ser considerado un agente de quimioterapia más potente que no fraccionada GSE disponible en el mercado, que sólo aumentó el efecto inhibidor del crecimiento de 5-FU en un 55% (
P
& lt; 0,05, en comparación con el control de 5-FU). Por otra parte, también se encontró que F2 inmadura (32%) y F3 (35%) eran más potentes que el 5-FU (62% del valor de control;
P Hotel & lt; 0,05) en la reducción de las células Caco-2 viabilidad.
Los datos se presentan como porcentaje de la viabilidad celular en relación con la viabilidad de las células de control. Los datos se expresan como media ± SEM de 3 experimentos independientes. El análisis estadístico se determinó mediante ANOVA de dos vías con
post-hoc
la prueba de Tukey. Valores con letras diferentes (a, b, c) en cada columna fueron estadísticamente diferentes a P & lt; 0,05. * Indica una diferencia significativa en 5-FU grupo tratado en comparación con el control de 5-FU.
fracciones de semillas maduras se comportaron de manera similar a las fracciones de semillas inmaduras (Figura 3B). fracciones de semillas maduras reducido significativamente la viabilidad celular (
P Hotel & lt; 0,05). F2 y F3 fueron más citotóxicos para las células Caco-2 (13% y 17%, respectivamente,
P
& lt; 0,05) que GSE (47%) (Figura 3B). Cuando las células se expusieron a las semillas de las fracciones y 5-FU, todas las fracciones de semillas mejorado la capacidad de 5-FU para reducir la viabilidad celular. GSE mejora de forma significativa la inhibición del crecimiento de 5-FU en un 49%. Sin embargo, F1-F4 mejoró significativamente el efecto inhibidor del crecimiento de 5-FU (62%, 83%, 80% y 60% respectivamente, en comparación con el control de 5-FU;
P
& lt; 0,05). Por otra parte, la F2 (13%), F3 (17%) y F4 (50%) Las fracciones fueron más potentes que el 5-FU solo (65% del valor de control;
P
& lt; 0,05) (Figura 3B ).
Discusión
PCs de semilla de uva se han reportado para ejercer propiedades beneficiosas para la salud, especialmente en el intestino [14], [15], [20], [21]. Además de su eficacia anti-cáncer, GSE se ha demostrado para reducir la toxicidad gastrointestinal después del tratamiento de quimioterapia en animales sanos y en células intestinales normales [15]. Aunque existe una creciente evidencia para apoyar las propiedades quimioterapéuticos de GSE en el cáncer de colon, la identificación de los componentes bioactivos responsables aún no está definido.
En el estudio actual, las fracciones aisladas de PC disponible en el mercado GSE mostró diferentes MDPS y tamaños moleculares. Sin embargo, estas fracciones tenían rendimientos muy bajos de conversión (& lt; 37%), lo que indica que menos del 40% de las fracciones se caracterizaron utilizando las técnicas de análisis seleccionados, lo cual era inaceptable para este estudio. La explicación para el bajo rendimiento de conversión en el PC fractionsmay haber sido debido a la oxidación que ocurre durante la generación de GSE de la elaboración del vino. Por lo tanto, se decidió aislar fracciones de PC a partir de uvas frescas recogidas a diferentes vencimientos: inmaduros (pre-envero) y maduros (madura). Esta decisión se basa en la observación de que las semillas inmaduras tienen un rendimiento de conversión más alto que las semillas maduras [22], fundamentadas en el estudio actual. Por otra parte, se necesitan estudios futuros que utiliza la espectrometría de masas para definir aún más la pureza de PC aislados a partir de semillas de uva
.
Los efectos citotóxicos de fracciones de PC en las células cancerosas se han descrito anteriormente [9], [12], [13 ]. Sin embargo, si estos efectos se produjeron a través de señalización extracelular o después de la captación de los PC no se intentó. El presente estudio demostró que las fracciones más activas que afectan a la viabilidad de las células Caco-2 contenían oligómeros más pequeños: F2 y F3. Los efectos citotóxicos más potentes observados en Cabernet Sauvignon fracciones de semillas en comparación con GSE pueden haber reflejado un menor rendimiento de la PC en GSE (~ 24%) en comparación con el PC aislado de uvas frescas (~ 60%).
La absorción de PC a través de las membranas celulares dependía en gran medida de sus MDPS [23], [24]. Sólo ciertos inferiores PC MDP son absorbidos durante el tránsito en el intestino, dejando a los ordenadores más grandes MDP (MDP & gt; 7) depositado en la luz intestinal. Este resultado es compatible con los datos de hoy, con F2 y F3 (MDP 2-6) y susceptibles de ser absorbidos a través de las membranas celulares eran más potentes que las fracciones con un mayor MDP, que sólo ejercen un efecto de superficie. Sin embargo, F2 y F3 eran más bioactivo que F1, posiblemente debido a su mayor porcentaje de galoilación y la proporción de epicatequina-3-
O
-gallate subunidades como terminales, en comparación con F1. Este resultado está de acuerdo con otros estudios en los que las fracciones de PC con mayor galoilación eran más citotóxicos que las fracciones de PC con galoilación menor cuando se probó en células de cáncer de colon [9], [25]. Sin embargo, aún se desconoce el mecanismo real de los ordenadores sobre el crecimiento celular. PC absorbida puede jugar un papel vital en interferir con las vías de señalización celular. PCs se han informado de que los inhibidores de los receptores de andrógenos en células de cáncer de próstata [26], [27] y los receptores del factor de crecimiento epidérmico en células de cáncer de colon [28]. Además, se conocen PCs para atenuar la PI3-quinasa (serina /treonina proteína quinasa) vía [14] lo que podría conducir a la inducción de la detención del ciclo celular en la fase G1 [20] y la activación del inductor de apoptosis vía [29]. Se requieren estudios futuros que investiguen los criterios de valoración del crecimiento celular y la apoptosis, incluyendo la captación de PI, actividad de caspasa 3 y el contenido de ADN sub-G1.
hallazgos previos han demostrado que los efectos citotóxicos de los PC son dependientes de su MDP [9] , [13]. Sin embargo, el presente estudio mostró que las fracciones de mayor MDP (7-16) no pudieron ejercer efectos citotóxicos sobre las células del cáncer de colon. Sin embargo, el presente estudio se utilizó un sistema de disolvente diferente para aislar fracciones de PC en comparación con otros estudios [9], [30]. Este sistema disolvente aísla fracciones de PC con una gama más amplia de masa molecular (619 a 6063 g /mol) y MDP (2-9) en comparación con otros métodos (masa molecular de 552 a 1.232 g /mol, MDP 1-4); lo que implica que los estudios anteriores sólo se miden las fracciones limitadas de PC (& lt; 1.200 g /mol). por sus actividades biológicas
La capacidad antioxidante de los ordenadores depende en gran medida de su grado de polimerización y galoilación [9]. La reducción de iones metálicos, tal como se mide por el ensayo FRAP, se cree que se correlaciona positivamente con el número de grupos hidroxilo presentes en las moléculas, y que los puntos de unión a la transición iones metálicos en las moléculas de flavonoides están en el
O
-catechol grupo de anillo B [31]. Sin embargo, este no fue el caso en el estudio actual. fracciones de PC con mayor MDP eran antioxidantes más débiles, que está de acuerdo con estudios previos [32], [33]. Las fracciones con subunidades más grandes tienden a auto-agregado y causan obstáculo estereoquímica [33], [34], exponiendo de esta manera un menor número de grupos hidroxilo para las actividades de barrido de radicales. Los estudios futuros deben llevarse a cabo para hacer frente a las propiedades antioxidantes de los PC semilla de uva, incluido el impacto en el estado antioxidante celular.
El presente estudio se realizó sobre la base de la base de un estudio previo de GSE y la quimioterapia sobre la viabilidad de cáncer de colon células del cáncer [35]. Se seleccionaron las dosis de fracciones de semilla de uva en el estudio actual, basado en la base de este estudio previo. 5-FU es un drogas anti-metabolitos que bloquean la síntesis de ADN a través de la inhibición de la timidilato sintasa [3] fracciones del extracto de semillas .Cuando se combinaron con 5-FU, que no sólo mejoran el impacto de 5-FU en matar las células Caco-2, sino también superado 5-FU como agente anti-cáncer. En el estudio actual, los efectos de las fracciones de PC y 5-FU en Caco-2 viabilidad de las células se examinaron más de 24 a 72 hr. 5-FU (100 uM) redujo significativamente el cáncer de células viabilidad a 60-80%, la toxicidad gastrointestinal en pacientes con cáncer. La exposición de la fracción de PC y 5-FU a las células durante 24 a 48 horas mostraron una tendencia hacia un efecto sinérgico, pero no fue significativa (datos no mostrados). Además, una mayor exposición de tiempo (72 h) a las fracciones de PC y 5-FU resultó en mayor reducción de la viabilidad celular. El estudio también reveló que las fracciones de semillas maduras fueron superiores a las fracciones de semillas inmaduras como agentes quimioterapéuticos contra el cáncer de colon
in vitro
. El perfil químico de las fracciones de semillas maduras mostró que estos efectos podrían ser impulsados por su mayor proporción de (-) - epicatequina subunidades como terminales en comparación con el extracto de semilla inmadura. Otra posible explicación podría haber sido la distribución dentro de cada fracción de una mayor proporción de material de peso molecular bajo en las semillas maduras de las semillas inmaduras.
El actual estudio mostró que las fracciones más activas que afectan a la viabilidad de las células Caco-2 fueron F2 y F3. Sin embargo, si estos efectos se produjeron a través de señalización extracelular o después de la captación de los PC no se conoce. Se necesitan más estudios para determinar la absorción intestinal de las fracciones de PC en líneas celulares intestinales normales. ensayo TheMTT es una medida indirecta de la viabilidad celular basado en la actividad metabólica. La reducción de la viabilidad celular observada en el estudio actual se podría atribuir a un efecto sobre el ciclo celular o la proliferación celular. Por lo tanto, la investigación de estudios adicionales del ciclo celular, la proliferación celular y la actividad de muerte celular (Anexina V /PI tinción, ensayo de liberación de LDL, caspasa-3 y Bcl-2) cuantificación podría proporcionar evidencia del impacto de tamaños específicos de PC OnCell señalización. fracciones de pruebas de PC en otras líneas celulares de colon (normales y neoplásicas) podría excluir la toxicidad general y proporcionar otras pruebas del potencial de PC.
En conclusión, se justifican más estudios para determinar el mecanismo molecular de F2 y F3 en vías celulares asociado con neoplasia de colon. Maduros extractos de semillas de PC no sólo tienen usos potenciales en la salud humana, pero a su vez alsoin de valor agregado para la industria vinícola, como las semillas de uvas maduras son la principal subproductos de la vinificación. Nuestros datos proporciona evidencia convincente de que la combinación de fracciones de PC y 5-FU puede ser un agente quimiopreventivo potencial en los regímenes de tratamiento de cáncer de colon; Sin embargo, más de confirmación
in vitro
se requieren estudios con diferentes clases de fármacos de quimioterapia seguido de
in vivo
ensayos modelo de cáncer para definir mejor el papel potencial de los ordenadores de semilla de uva contra el cáncer de colon.