Extracto
El cáncer de ovario es un tumor maligno reactivo inmunológico con una compleja red de supresión inmune que embota la erradicación exitosa inmunológico. Este microambiente supresivo puede ser mediada por el reclutamiento o la inducción de células T reguladoras CD4
+ (Tregs). Nuestro estudio trata de investigar la asociación de CD4 infiltrantes de tumor
+ CD25
+ FOXP3
+ células T reguladoras, y otros factores inmunológicos, con el resultado clínico en pacientes con cáncer de ovario seroso. Se realizó inmunofluorescencia y cuantificación de células T reguladoras positivas triples infiltrantes de tumor intraepitelial (CD4
+ CD25
+ FOXP3
+), así como CD4
+ CD25
+ FOXP3
-, CD3
+ y CD8
+ células T en muestras tumorales de 52 pacientes con carcinoma de la etapa alta de ovario seroso. Treinta y uno de los pacientes tuvieron una buena supervivencia (es decir, & gt; 60 meses) y 21 tenían escasa supervivencia de & lt; 18 meses. el total de células, así como relaciones de células fueron comparados entre estos dos grupos de resultados. El número total de CD4
+ CD25
+ FOXP3
+ células T reguladoras CD4
+ CD25
+ FOXP3
-, CD3
células
+ y CD8 + eran no significativamente diferente entre los grupos. Sin embargo, las proporciones más altas de CD8
+ /CD4
+ CD25
+ FOXP3
+ Treg, CD8
+ /CD4
+ y CD8 /CD4
+ CD25
+ FOXP3
- se observaron células en el grupo de buen resultado en comparación con los pacientes con mal pronóstico. Estos datos demuestran por primera vez que las proporciones de CD8
+ para tanto CD4
+ CD25
+ FOXP3
+ células T reguladoras y CD4
+ CD25
+ FOXP3
- células T están asociados con el resultado de la enfermedad en el cáncer de ovario. La asociación ser aparente en relaciones en lugar de recuento absoluto de las células T sugiere que la relación efector /supresor puede ser un indicador más importante del resultado de recuento de células individual. Por lo tanto, las estrategias de inmunoterapia que modifican la relación de CD4
+ CD25
+ FOXP3
+ células T reguladoras o CD4
+ CD25
+ FOXP3
- células T CD8
+ efector Las células pueden ser útiles para mejorar los resultados en el cáncer de ovario
Visto:. Preston CC, Maurer MJ, Oberg aL, Visscher DW, Kalli KR, Hartmann LC, et al. (2013) Las relaciones de CD8
+ células T CD4 a
+ CD25
+ FOXP3
+ y FOXP3
- Las células T se correlacionan con el pobre resultado clínico en cáncer de ovario seroso humano. PLoS ONE 8 (11): e80063. doi: 10.1371 /journal.pone.0080063
Editor: Muriel Moser, Universidad Libre de Bruselas, Bélgica
Recibido: 14 Agosto, 2013; Aceptado: 8 Octubre 2013; Publicado: 14 Noviembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Preston et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas a KLK, ELG, LCH: P50-CA116201, CA122443-R01, P50 y financiadores-CA136393.The tenido ningún papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario tiene la mayor tasa de mortalidad de los cánceres exclusivos para mujeres. A pesar de muchos esfuerzos terapéuticos que utilizan nuevas quimioterapias, la tasa de curación no ha mejorado sustancialmente en las últimas décadas [1-3]. Es bien sabido que los resultados clínicos en cáncer de ovario son muy heterogéneos y no fácilmente predecibles por las características clínicas y patológicas estándar (por ejemplo, el grado, la histología del tumor) [4-6]. Esto sugiere que puede haber otras características microambiente tumoral o huésped con un papel dominante en la supervivencia. En los últimos años, ha habido interés en la comprensión del papel de la respuesta inmune del paciente para su cáncer de ovario, como la enfermedad se piensa que es un tumor maligno reactiva naturalmente inmunes con una red de supresión complejo que embota eficazmente la erradicación inmune éxito. Durante la última década, los estudios han demostrado la importancia del sistema inmune en que afecta a los resultados del paciente. En particular, Zhang y sus colegas publicaron un estudio que mostró que la mayoría de los pacientes con cáncer de ovario tenía tumores infiltrantes CD3
+ células T y que la infiltración se asoció positivamente con la supervivencia [7]. La presencia de células T era particularmente beneficioso para aquellos individuos que demostraron una respuesta clínica completa a cirugía y quimioterapia en el que la supervivencia a cinco años fue del 74% frente al 12% para aquellos que no tienen células T. Estudios posteriores han refinado nuestra comprensión de las células T intra-tumorales, tales como el trabajo por Sato et al., que mostró que los pacientes que tenían altos niveles de la infiltración de linfocitos T citotóxicos (CTL) tuvieron una supervivencia media de 55 meses en comparación con aquellos con pocos o sin CTL que tenía una supervivencia de 26 meses [8]. Una característica única de las estrategias terapéuticas convencionales para el cáncer de ovario es que la función de células T se recupera rápidamente después de la quimioterapia convencional [9]. Los antígenos a los que los pacientes son, naturalmente, respondiendo ahora están siendo sistemáticamente estudiadas [10,11]. En conjunto, estos resultados demuestran que la inmunidad anti-tumor se provoca contra los cánceres y los efectos del curso clínico de la enfermedad de ovario. Sin embargo, ahora es evidente que la inmunidad anti-tumor es contrarrestada por un microambiente de supresión inmune [7,12-15].
Uno de los factores celulares que pueden mediar esta supresión inmune en el microambiente tumoral es la población de células T reguladora (Treg). La investigación sobre células T reguladoras ha avanzado rápidamente, sobre todo en el contexto del cáncer. Células T reguladoras son un grupo heterogéneo de CD4
+ subpoblación de células T cuya función principal es la regulación inmune al bloquear la función de las células T activadas. CD4
+ células T reguladoras se puede dividir en dos subgrupos principales: células T reguladoras de origen natural con un CD4
+ CD25
+ FOXP3
+ fenotipo y células T reguladoras inducidas con una variable de la expresión de CD25 [12]. Estudios anteriores han demostrado que la caja forkhead P3 (FOXP3) es un factor de transcripción central que regula el desarrollo y la función de CD4
+ Tregs [16,17]. Por otra parte, los estudios también han demostrado que la expresión de CD25, un componente de la alta afinidad del receptor de IL-2, es esencial para la supervivencia de Treg, que es dependiente de IL-2 [18,19] altamente. En la última década se han realizado varios estudios que relacionan las Treg con la supervivencia en muchos tipos de cáncer. En el cáncer de ovario, Curiel y sus colegas mostraron inicialmente una fuerte asociación de CD4
+ CD25
+ T células con baja supervivencia [14]. Es de destacar que la función específica de triples manchadas de CD4
No se ha evaluado + CD25
+ FOXP3
+ T células. Unos años más tarde, Sato y colegas no pudieron ver ninguna asociación directa de CD25
+ FOXP3
+ T células en el cáncer de ovario, pero se observó que CD8
+ recuentos bajos de células T totales y los CD8
+ /CD25
+ FOXP3
+ T se asocia con una peor supervivencia, de nuevo en una población con diferentes histologías [8]. Todavía en un estudio más reciente, Milne y colegas demostraron, en el cáncer de ovario seroso de alto grado, que el recuento de células intraepiteliales manchada por separado para FOXP3
+ se asoció con una mejor supervivencia en gran medida [20]. Sin embargo, su estudio no se define específicamente el tipo de células que expresan FOXP3. Teniendo en cuenta que otras células, además de las células T expresan FOXP3 (por ejemplo, células tumorales y las células B), la importancia de ese trabajo, si bien es interesante, sigue siendo poco clara [21,22]. Por otra parte, dado que tanto CD8
+ y CD4
+, regulador y
in vitro
activados se sabe que las células T para expresar FOXP3, la identidad específica del tipo de célula implicada en la modificación de la supervivencia es desconocido. Sin embargo, más recientemente, Kryczek y sus colegas mostraron que en los tumores primarios o lesiones autoinmunes, FOXP3 y CD25 es un marcador conjunto muy específico y fiable para primaria humanos CD4
+ células T reguladoras [23].
El objetivo principal de este estudio fue examinar la asociación de tumor infiltrante de CD4
+ CD25
+ FOXP3
+ otras células T con el resultado clínico en pacientes con cáncer epitelial de ovario, ya que las células T reguladoras y este método de tinción de triple no se ha hecho en los tumores de ovario a lo mejor de nuestro conocimiento. En concreto, se estudió una cohorte único, limitado a los pacientes con cáncer de ovario seroso etapa avanzada (la histología más común y el más letal), compuesto de dos subgrupos de pacientes con resultados clínicos muy divergentes, uno con muy escasa supervivencia (& lt; 18 meses) y el otro de los pacientes con mejor supervivencia (& gt; 60 meses).
Materiales y Métodos
los pacientes y las características clínicas
el estudio fue aprobado por la Clínica Mayo Junta de Revisión institucional y todos los pacientes dieron su consentimiento informado para su uso en investigación de las muestras escritas. Potencia cálculos se realizan a través de la simulación para estimar el número de muestras necesarias para detectar una diferencia significativa de supervivencia en pacientes con cáncer de ovario. Cincuenta y dos pacientes, elegidos de los grupos de efectos dispares con un mal resultado (& lt; 18 meses de supervivencia) y buen resultado (& gt; 60 meses de supervivencia), a condición de poder 82,5% a un alfa de 0,05 para detectar una razón de riesgo de supervivencia global de 1,65 entre dicotómica CD4
+ CD25
+ FOXP3
+ Treg agrupaciones en todos los pacientes con cáncer de ovario. Esto se traduce en el poder, al menos, el 80% para detectar un tamaño del efecto (cambio en el número o la proporción de CD4
+ CD25
+ FOXP3
+ Treg) de 0,8 en la evaluación de células T reguladoras entre los dos grupos de resultados dispares con pobres resultado (
n
= 21) y un buen resultado (
n
= 31) con una prueba de Kruskall Wallace, como se realizó en este estudio. Todas las muestras fueron seleccionadas de pacientes con citorreducción óptima, etapa alta, de ovario seroso, trompa de Falopio o carcinoma peritoneal primario.
La tinción de inmunofluorescencia y análisis de muestras de tejido
Todos los bloques de muestras congeladas, previamente incorporados en se cryosectioned Tissue-Tek OCT (Sakura Finetek, Torrance, CA), (5μm), se fijaron en acetona durante 10 minutos, se seca al aire durante 1 hora y se almacena a -80 ° C hasta su uso. Antes de la tinción, los portaobjetos se bloquearon durante 10 minutos a temperatura ambiente (25 ° C) con el bloque de proteína sin suero (Dako, Carpinteria, CA) y después se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS). La tinción se realizó por incubación de los portaobjetos a temperatura ambiente (25 ° C) en húmedas cámaras oscuridad durante 2 horas con anticuerpos primarios diluidos en diluyente reactivo anticuerpo (Dako, Carpinteria, CA). policlonal de conejo anti-humano FOXP3 (Abcam, Cambridge, MA) se utilizó a una dilución 1:75, monoclonal de ratón anti-humano CD4 (Abcam, Cambridge, MA) a 1: 100, monoclonal de rata anti-CD25 humano (Abd Serotec, Raleigh, NC) a 1: 100, monoclonal de ratón anti-humano CD8 (BD Pharmingen, San Diego, CA) a 1: 100, y monoclonal de ratón anti-CD3 humano (BD Pharmingen, San Diego, CA) a 01:50. Después de la tinción con anticuerpos primarios, los portaobjetos se lavaron a continuación durante 15 minutos con PBS y se incubaron durante 1 hora en una cámara oscura húmeda con anticuerpos secundarios (Alexa Fluor 405, 488 y 594 conjugados, Invitrogen, Life Technologies, Grand Island, NY) a una dilución de 1: 500. Los anticuerpos para FOXP3, CD4 y CD25 se usaron para el triple tinción de células T reguladoras mientras que los anticuerpos para CD3 y CD8 fueron utilizados como manchas individuales. Individualmente células teñidas también se contratiñeron con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 100 ng /ml) durante 30 minutos. tejido amigdalino humano se utilizó como control positivo y los controles negativos se realizaron omitiendo el anticuerpo primario y el uso de controles de isotipo para cada anticuerpo.
Microscopía confocal y cuantificación de células
Los portaobjetos teñidos se evaluaron en un LSM 510 microscopio confocal de barrido láser (Carl Zeiss MicroImaging, Inc., Oberkochen, Alemania). intraepitelial células teñidas fueron evaluadas en campos de alta potencia de magnificación escaneadas de las secciones aleatorias epiteliales evitando zonas del estroma. Los campos explorados fueron espaciadas para evitar la superposición y de blanqueo y para cubrir toda la sección del tumor. Veinte campos aleatorios (300 m
2) fueron fotografiados digitalmente para cada muestra. La cuantificación de células positivas se realizó manualmente por observadores ciegos a toda la información clínica. Un subconjunto de las muestras seleccionadas al azar fueron revisados por un observador secundario. el recuento total de células de cada campo se registraron en cualquiera de la triple manchado manchado muestras (CD8) o CD3 (CD4, CD25 y FOXP3) o individual.
Cuando las muestras tumorales fueron examinados groseramente bajo microscopía confocal, se observaron los linfocitos infiltrantes de tumor, tanto en el estroma y el epitelio. Por lo tanto, se presta la debida atención al establecimiento de los campos de recuento exclusivamente dentro de las zonas epiteliales. Las siguientes células se cuantificaron en las muestras teñidas triples y utilizados en el análisis: CD4
+ CD25
+ FOXP3
+, CD4
+ CD25
+ FOXP3
-, CD4
+ CD25
-FOXP3
-, CD4
+ CD25
-FOXP3
+, CD4
-CD25
+ FOXP3
+, CD8
+ DAPI
+ y CD3
+ DAPI
+. tumor intraepitelial infiltrar células T reguladoras se define como CD4
+ CD25
+ FOXP3
+ células, con CD4 (señal roja) y CD25 (señal verde) manchas detectadas en las áreas citosólicas y de membrana que da una naranja y /o patrón de color amarillo y FOXP3 (señal azul) detectado como un patrón de tinción nuclear-intra y típicamente de puntos. La evaluación primaria de CD4
+ CD25
+ FOXP3
+ Treg cuantificación fue el recuento de Treg total a través de los 20 cuadros de una muestra tumoral. Esto se hizo en contraste con estudios anteriores que generalmente cuantificó usando células T reguladoras áreas focales identificados por los usuarios de la infiltración [8,14]. Hemos probado la validez de estos enfoques anteriores utilizando también las mediciones secundarias para cada tumor, es decir, el más alto recuento de una sola imagen a partir de una muestra de tumor (MAX1) y la suma de los tres más altos recuentos de una muestra de tumor (MAX3).
tumor infiltrante con el aislamiento de linfocitos
En una investigación, se recogieron los linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) de seis tumores de ovario y aislados por gradiente de Ficoll discontinuo como se describe anteriormente [24]. Brevemente, los linfocitos fueron separados de las células tumorales por centrifugación de la suspensión celular en un gradiente de Ficoll de dos capas, la capa 100% en la capa inferior y 75% en la parte superior. Los TIL aisladas fueron teñidas para el análisis de citometría de flujo como se describe a continuación.
Citometría de flujo
superficie de la célula y tinción marcador intracelular se llevó a cabo en los TIL aisladas (1 x 10
6) como se describe anteriormente [25]. Se realizaron dos series de experimentos; en el primer set células estimuladas ONU fueron teñidas con los siguientes anticuerpos conjugados: CD3-PE-Cy7, Azul CD4-Pacífico, CD8-Alexa Fluor 700, CD1c-APC, BDCA2-FITC y CD68-PerCP-Cy5.5. En el segundo, nos propusimos células ONU-estimuladas y estimuladas manchadas de CD4 y el Pacífico azul, CD25-PE, FOXP3-Alexa Fluor 647 y TGF-β-PE-Cy7. Antes de la tinción TIL fueron estimulados por incubación con 5μg /ml de concanavalina-A (Con-A, Sigma-Aldrich, St Louis, MO) y 0.7μl /ml BD GolgiStop ™ (BD Bioscience, San Jose, CA) durante 8 horas, después se lavaron, se contaron y se resuspendieron en tampón FACS (PBS con 1 mM /L EDTA y 3% de albúmina de suero bovino). FOXP3 y citoquinas tinción se llevó a cabo según el protocolo de tinción intracelular del fabricante (eBioscience, San Diego, CA). anticuerpos de isotipo apropiados se utilizaron como controles. Todos los anticuerpos se adquirieron de BD Bioscience (San Jose, CA) a excepción de los siguientes anticuerpos: TGF-β-PE-Cy7 y CD3-PE-Cy7 eran de eBioscience (San Diego, CA), BDCA2-FITC de Miltenyi Biotec (Auburn , CA) y CD68-PerCP-Cy5.5 fue adquirido de BioLegend (San Diego, CA). Las muestras se analizaron en un FACS Scan II y analizados mediante FlowJo 10.0.5.
Análisis de datos
Las distribuciones de CD4
+ CD25
+ FOXP3
+ recuentos de Treg entre los pacientes con buena y los pobres resultados fueron examinados de forma gráfica y se compararon mediante pruebas de suma de rangos de Wilcoxon (Mann-Whitney
T
prueba). Ratios se calculan como el número de células CD8
+ dividido por el número de CD4
+ CD25
+ FOXP3
+ células T reguladoras para un paciente dado. Los recuentos de células se resumen como mediana y rango intercuartil (IQR). Para comparaciones por pares de citometría de flujo de datos, se utilizó la prueba t de Student pareada. La significación estadística se estableció en un valor de p ≤ 0,05.
Resultados
características de los pacientes clínicos
Cincuenta y dos muestras de tumor que cumplían los criterios del estudio se seleccionaron a partir del banco de tejidos. Características de los pacientes se resumen en la Tabla 1. La edad media de los pacientes en el estudio fue de 65 años (rango, 37-86 años). Todos los pacientes fueron diagnosticados con estadio avanzado (estadio III 71%, 29% en estadio IV) la enfermedad, fueron citorreducción óptima, y tenían tumores con morfología serosa. La mediana de supervivencia en el grupo de mal pronóstico fue de 12,4 meses (rango 3,0 a 16,7) y la supervivencia media en el grupo de buen resultado aún no se ha alcanzado con 73,8 meses de seguimiento medio (rango de 60,1 a 116,8).
buen resultado
Resultado Pobre gratis (
n
= 31) (
n
= 21) P-valueAge en DiagnosisMedian62.069.00.0059Range (37,0 a 80,0) (50,0 a 86,0) StageIII23 (74,2%) 14 (66,7%) 0.56IV8 (25,8%) 7 (33,3%) GradeLow3 (9.7%) 0 (0,0%) 0.20High28 (90,3%) 21 (100 %) StatusAlive24 Vital (77,4%) 0 (0,0%) NADead7 (22,6%) 21 (100,0%) Primera Línea ChemotherapyPlatinum2 (6,5%) 1 (4,8%) y 0.20Platinum Taxane27 (87,1%) 15 (71,4%) Otros2 (6,5%) 5 (23,8%) Tabla 1. Características de los pacientes
buen resultado & gt.; 60 meses de supervivencia, un mal resultado & lt; supervivencia a los 18 al mes; todos los casos fueron cánceres serosos y citorreducción óptima. Descargar CSV CSV
La enumeración de las células T infiltrantes de tumor intraepitelial
intraepiteliales infiltrarse en las células (CD4
+ CD25
+ FOXP3
+ células T reguladoras CD4
+, CD8
+, CD3
+, CD4
+ CD25
+ FOXP3
- y CD4
+ CD25
-FOXP3
+) fueron cuantificados y analizados en todos los campos. campos representativos escaneadas de tumores infiltrantes putativo CD4
+ CD25
+ FOXP3
+ células T reguladoras, así como CD4
+ CD25
+ FOXP3
- se muestra en la Figura 1A. La Figura 1B muestra representativa CD8
infiltración de células T +
+ y CD3. El análisis reveló una modesta pero estadísticamente significativa correlación lineal entre los recuentos de células CD3
+ células T y las células CD4
+ o CD8
+ T (Figura 1C).
(A) Foto de CD4
+ CD25
+ FOXP3
+ células T reguladoras en muestras de tumores de ovario. El panel superior izquierdo muestra la expresión de CD4 (señal roja), panel superior derecho muestra la expresión de CD25 (señal verde), panel inferior izquierdo muestra la expresión de FOXP3 (señal azul) y el panel inferior derecho muestra las señales combinadas con flechas apuntando a triplicar manchadas de CD4
+ CD25
+ FOXP3
+ células T reguladoras. En esta imagen se observan células T reguladoras en estrecho contacto con CD4
+ CD25
+ FOXP3
- células. (B) Foto de la infiltración de células CD8 intraepitelial
+ células T citotóxicas (panel izquierdo) y CD3
+ linfocitos (panel derecho) en el cáncer de ovario. Esta exploración representativa muestra la expresión de CD8 y CD3 (señal roja = CD8 o CD3, señal azul = DAPI) en la masa del tumor de ovario. (C) gráfica de correlación comparando CD3 cuenta a cualquiera de CD8 (símbolos rellenos) y los recuentos de CD4 (símbolos abiertos). Los símbolos representan la suma de los 20 campos contados para un paciente único. Todos los pacientes se representan. Las líneas de inserción son el producto de un análisis de regresión lineal. (D) muestra la media general (± SEM,
n
= 52) CD3
+, CD4
+, y CD8
+ T recuentos de células (suma de 20 campos) para todos pacientes. (E) Correlación parcela comparando el total de Treg (es decir, CD4
+ CD25
+ Foxp3
+) cuenta con la suma de los 3 campos máximos (MAX3) o el recuento de campo máxima (MAX1). Los símbolos representan la suma de los 20 campos contados para un paciente único. Todos los pacientes se representan. Las líneas de inserción son mínimos cuadrados líneas de regresión.
Dado que estudios previos examinaron y se enumeran los campos no aleatoria T de células enriquecida, se analizó la validez de este enfoque mediante la evaluación de la correlación entre el total de CD4
+ CD25
+ FOXP3
+ Treg recuento en todos los campos y los 20 MAX1 y MAX3 recuentos. Como se muestra en la Figura 1D, había muy fuertes correlaciones estadísticamente significativas, lo que sugiere que los enfoques anteriores a la enumeración de las células T infiltrantes son en gran parte válida.
recuentos de células T no se correlacionaron directamente con el resultado clínico en cáncer de ovario seroso humano
inicial Los análisis se centró en la correlación de los recuentos de células con grupos de resultados. En contraste con el trabajo previo, intraepitelial CD3
+ células T no fueron observadas a niveles significativamente diferentes en pacientes con buen pronóstico (mediana de 154 células (suma de 20 campos), IQR 89-297) en comparación con los pacientes con mal pronóstico (mediana 179, IQR 73-333, Tabla 2). Del mismo modo, las cantidades de la infiltración de células CD4
+ (370, 249-461 RIC en el bien contra el grupo 377, IQR 264-524 en el grupo pobre) y CD8
+ células T (115, IQR 53-180 en el bien contra el grupo de 48 años, IQR 17-180 en el grupo pobre) no fueron significativamente diferentes entre los grupos de resultados buenos y malos.
buen resultado (n = 31)
Resultado Pobre (n = 21)
La mediana
IQR
La mediana
IQR
P-
valor de la célula Counts
1CD3
+15489-29717973-3330.881CD4
+370249-461377264-5240.514CD8
+11553-1804817-1800.271CD4
+CD25
+FOXP3
+10155-16110992-1460.444CD4
+CD25
+FOXP3
-14890-187147105-2310.251Ratios
2CD8
+/CD3
+0.580.34-0.910.430.20-0.700.198CD4
+/CD3
+2.061.33-3.431.731.32-3.670.985CD8
+/CD4
+0.270.20-0.440.130.07-0.370.050CD3
+/CD4
+ CD25
+ FOXP3
+ 1.720.95-2.681.380.79-2.490.695CD3
+ /CD4
+ CD25
+ FOXP3
-1.310.71- 2.061.240.72-1.640.490CD8
+ /CD4
+ CD25
+ FOXP3
+ 0.980.49-1.790.320.25-1.020.027CD8
+ /CD4
+ CD25
+ FOXP3
-0.650.43-1.190.460.13-0.770.048CD4
+ /CD4
+ CD25
+ FOXP3
+ 2.912.59-4.313.042.39-3.460.332CD4
+ /CD4
+ CD25
+ FOXP3
-2.501.94-3.192.161.80-2.640.351Table 2. Las comparaciones de los niveles o proporciones de células T.
1Sum de la célula cargos de los 20 campos,
2Ratio de la suma de los 20 campos; RIC, rango intercuartil; cambios estadísticamente significativos se muestran en negrita. Descargar CSV CSV
Uso de los marcadores CD25 y FOXP3, CD4
+ células T se puede dividir en cuatro grupos. Los dos grupos principales eran CD4
+ CD25
+ FOXP3
+ células T reguladoras (~ 33,2% entre todos los pacientes) y CD4
+ CD25
+ FOXP3
- células T (~ 43.1 %). Los otros dos grupos de menor importancia fueron los CD4
+ CD25
-FOXP3
+ células T (~ 14,4%) y CD4
+ CD25
-FOXP3
- células T (9,3 ~ %). No vimos ninguna diferencia en los niveles de CD4
+ CD25
+ FOXP3
- células T entre los grupos de resultados de los pacientes. Los niveles promedio fueron de 148 células (IQR 90-187) en el grupo de buen resultado y 147 (IQR 105-231) en el grupo de mal pronóstico (Tabla 2). Del mismo modo, los mediana del recuento de CD4
+ CD25
+ FOXP3
+ células T reguladoras en los pacientes con buen pronóstico no fueron diferentes en comparación con los pacientes con mal pronóstico. Todas las muestras tumorales mostraron CD4
+ CD25
+ FOXP3
+ Treg infiltración con una gama combinada de 14-350 células. El porcentaje de CD4
+ CD25
+ FOXP3
+ células T reguladoras, del total intraepitelial CD4
+ infiltrarse en las células fue de 31 ± 10% en el grupo de buen resultado en comparación con el 34 ± 11% en el resultado deficiente grupo de pacientes (p = 0,319).
Una observación notable de estas comparaciones es que el CD4
recuentos de células T + fueron más altos que el CD3
+ cuenta cuando se espera que la equivalencia. (Figuras 2A). Una posible razón para la falta de correlación podría ser que los anticuerpos CD4 y CD8 están manchando una mezcla de ambos linfoides y células mieloides, ya que se ha informado anteriormente de que ambos marcadores pueden expresarse en varios subconjuntos de leucocitos incluyendo linfoide y mieloide. Alternativamente, se podría CD3 el regulado en las células T debido a la estimulación crónica en el microambiente tumoral [26,27]. Teniendo en cuenta estas cuestiones, nos purifica tumor infiltrante de células mononucleares de tres pacientes con cáncer de ovario, ellas teñidas con diferentes linfoides y mieloides marcadores y análisis de citometría de flujo realizada. Tinción reveló que el 26 ± 3% (n = 3, SEM) y 34 ± 4% de las células CD4
+ células
+ y CD8, CD3, respectivamente, son negativos (Figuras 2B-C). El análisis de CD11c
+, BDCA2
+ y CD68
+ células sugiere que mieloide DC, plasmocitoide DC y macrófagos en conjunto constituyen menos de un total de 5% de cada uno de los CD4
+ y CD8
+ células en los tumores de ovario (Figuras 2D-G).
gráficos (AB) de barras que muestra la media (± SEM,
n
= 3) niveles de CD3-CD4
+ o CD8
+, respectivamente, como un porcentaje del total de CD4
+ o CD8
+, respectivamente. (C) muestra son 4 parcelas de doble punto de color representativos de tinción ya sea CD4 o células CD8-cerrada. Las especificidades de anticuerpos se observan con el eje. (D) Se muestran la media (± SEM,
n
= 3) niveles de CD11c
+, BDCA2
+ células
+ y CD68 como un total de CD4
+ o CD8
+ células (eje X).
proporciones de células T se correlaciona con el resultado clínico en cáncer de ovario seroso humana
Al ver ninguna asociación entre los recuentos absolutos de CD4
+ CD25
+ FOXP3
+ células T reguladoras y el resultado clínico, que se centraron en las proporciones que habían sido descritas previamente [8,28]. La mediana CD8
+ /CD4
+ CD25
+ FOXP3
+ Treg relación se encontró significativamente mayor en los pacientes con buen resultado en comparación con los pacientes con mal pronóstico (0,98 frente a 0,32; p = 0,027 , Tabla 2, Figura 3A). Por el contrario, la mediana CD3
+ /CD4
+ CD25
+ FOXP3
+ Treg y CD4
+ /CD4
+ CD25
+ FOXP3
+ Treg relaciones no fueron significativamente diferentes entre los grupos. Un examen más detallado, de forma inesperada, también detectado que los pacientes con buen resultado tuvieron una mediana CD8
+ /CD4
+ CD25
+ FOXP3
- ratio que fue significativamente mayor en el grupo bueno (0,65) como en comparación con el grupo de pobres (0,46, p = 0,048) (Tabla 2, Figura 3B). Cuando el CD8
+ /CD4
+ CD25
+ FOXP3
+ Treg y CD4
+ CD25
+ FOXP3
- ratios se consideran en conjunto (es decir, todos CD4
+ CD25
+) y como se muestra en la Figura 3C, las proporciones entre los dos grupos se mantuvo significativamente diferentes. Como se apreció que la edad sea ligeramente diferente entre los dos grupos, se verificó que la asociación entre el estado y el recuento de células grupo se mantuvo constante después de ajustar por la edad en un modelo de regresión logística (datos no mostrados).
(A) del gráfico de sectores que muestra la distribución de las células CD4
+ células T con respecto a CD25 y tinción de FOXP3 en todos los pacientes. (BD) Dispersión gráficos de puntos de las proporciones de CD8
+ T recuentos de células a células T reguladoras (CD4
+ CD25
+ FOXP3
+) (B), CD4
+ CD25
+ FOXP3
- células T (C), o combinado CD4
+ CD25
+ FOXP3
+ y CD4
+ CD25
+ FOXP3
- células T (D) tanto para el buen resultado y grupos de resultados pobres.
al comparar las proporciones calculadas a partir de los tres grandes manchas (CD3, CD4, y CD8), sólo la mediana CD8
+ /CD4
+ proporciones de células T, que eran 0,27 y 0,13, respectivamente, para los grupos de resultados buenos y malos, eran estadística significativamente diferentes (p = 0,050), lo que es consistente con las proporciones significativas de la CD8
+ células T a o bien el CD4
+ CD25
+ FOXP3
+ células T reguladoras CD4 o la
+ CD25
+ FOXP3
- se ha descrito anteriormente. No hay otras relaciones (por ejemplo CD8
+ /CD3
+ células T y CD4
+ /CD3
proporciones de células T +) difirió significativamente entre los grupos de resultados buenos y malos (Tabla 2).
Por último, después de haber visto que tanto FOXP3
+ y FOXP3
- CD4
+ células T se relacionan con el desenlace cuando se examina como la relación con las células CD8
+ T, se especuló que estas células eran células T reguladoras capaces de producir la citoquina reguladora inmune, TGF-β. Para probar esto, purificamos leucocitos infiltrantes de tumor (TIL) y se estimularon luego directamente
ex vivo
con ConA, seguido de tinción intracelular de citoquinas. + células T como se muestra en la Figura 4A, los TIL deriva de CD4
+ CD25
eran una mezcla de FOXP3
+ y FOXP3
- células T. En ausencia de estimulación, una fracción (12 ± 4%, n = 3, ± SEM) de las células T purificadas mantiene expresión de FOXP3. Tras la estimulación, el porcentaje de CD4
células CD25 +
+ T que expresan FOXP3 aumentó a 42 ± 9% del total de CD4
+ CD25
+ células T. En ausencia de estimulación, 5 ± 3% de CD4
+ células T CD25 +
producidos TGF-β y después de la estimulación, esto aumentó a 34 ± 9% (p = 0,04, Figura 4B).
(A) Se muestran dos puntos parcelas de células T CD4 + que infiltran el tumor
purificadas estimuladas con ConA o medio solo. Las células son una verja de CD4 y CD25. (B) Los gráficos de barras que muestran la media (± SEM,
n = 3
muestras de pacientes únicas) porcentaje de FoxP3
+ y células TGF-β T CD4 total entre el
+ CD25
+ células T estimuladas con ConA, ya sea o medio solo. valor de p obtenido mediante una prueba t de Student para datos apareados.
Discusión
La comprensión del papel patológico de células T reguladoras que tienen la capacidad de suprimir las células T activadas en el microambiente del cáncer de ovario es importante para el desarrollo nuevas terapias inmunológicas y determinar el pronóstico del paciente. En el presente estudio, encontramos por primera vez que las células CD4
+ CD25
+ FOXP3
+ células T reguladoras están asociadas con el resultado específicamente en el cáncer de ovario seroso pero sólo en el contexto de las células CD8
+ T . El hecho de que la influencia de Tregs sólo es detectable cuando se evaluó como una relación con citotóxicos CD8
+ células T es consistente con el modelo de que las respuestas inmunes específicas de tumor potencialmente destructivos se compensan en el microentorno del tumor por la supresión inmune fuerte [29] . Esto sugeriría que las estrategias dirigidas a agotamiento de las células T reguladoras y la estimulación vacuna concomitante de las células T efectoras serían eficaces en la eliminación de los cánceres de ovario y la mejora de la supervivencia [30]. Varios fármacos que se sabe que son útiles como agentes como la ciclofosfamida, el anticuerpo anti-CD25, o diftitox diftitox Treg de ozono están disponibles para la terapia de combinación con nueva vacuna o adoptivos T enfoques de terapia celular [31,32]. Alternativamente, Quezada y colegas muestran que puesto de control anti-CTLA-4 bloqueo en combinación con la terapia de vacuna también puede ser eficaz en la alteración de la balanza sin eliminar Tregs, lo que sugiere un uso potencial para el CTLA-4 de anticuerpos anti-humano aprobado recientemente en el cáncer de ovario [ ,,,0],33,34].
Nuestro
ex vivo
experimentos mostraron que un bajo porcentaje de no estimulado CD4
+ CD25
+ T células mantenido la expresión de FOXP3, que luego aumentó a activación. Esta frecuencia inferior de FOXP3
+ células T, con respecto a los resultados de la tinción de inmunofluorescencia, pueden reflejar en la regulación de FOXP3, consistente con las observaciones de que la expresión de Foxp3 humano está regulada por la activación de células T y no se programa de desarrollo, ya que es en murino Tregs [ ,,,0],35]. En consecuencia, la expresión de FOXP3 en las células T después de la activación se ha llevado a cierta controversia sobre si FOXP3 es un marcador de Treg específicas en seres humanos. De hecho, algunos estudios han demostrado que FOXP3 expresión se induce en las células T activadas, sin actividades de regulación, lo que podría llevar a uno a especular que algunas de las células CD4
+ CD25
+ FOXP3
+ T células en el cáncer de ovario puede no ser regulador. Por el contrario, otros estudios han demostrado que células T activadas que hasta de regular FOXP3 de hecho transmitir actividad supresora en una celda de contacto o de manera dependiente de citoquinas (es decir, IL-10 y TGF-β) [36,37].