Extracto
LC3s (MAPA 1-LC3A, B y C) son proteínas estructurales de las membranas autophagosomal, ampliamente utilizados como biomarcadores de la autofagia. Ya sea que estas tres proteínas LC3 tienen una función biológica similar en la autofagia permanece oscuro. Examinamos en paralelo los patrones de expresión subcelular de las tres proteínas LC3 en un panel de líneas celulares de cáncer humano, así como en fibroblastos normales MRC5 y HUVEC, utilizando microscopía confocal y análisis de transferencia Western de fracciones de células. En el citoplasma, había un mínimo de co-localización entre LC3A, B y C de la tinción, lo que sugiere que los autofagosomas pertinentes están formadas por sólo uno de los tres proteínas LC3. LC3A mostró una localización perinuclear y nuclear, mientras que LC3B se distribuye por igual en todo el citoplasma y localizado en las regiones nucleolares. LC3C se encuentra en el citoplasma y fuerza en los núcleos (excluyendo nucléolos), donde ampliamente co-localizada con la LC3A y la Beclin-1 autofagia iniciar la proteína. Beclin 1 se sabe que contiene una señal de tráfico nuclear. Bloqueo de la función de exportación nuclear por Leptomycin B dio como resultado la acumulación nuclear de todo LC3 y proteínas Beclin-1, mientras que la ivermectina que bloquea la importación nuclear mostró una reducción de la acumulación, pero no en todas las líneas celulares. Dado que las proteínas endógenas LC3 se utilizan como importantes marcadores de autofagia en estudios clínicos y líneas celulares, es esencial para comprobar la especificidad de los anticuerpos utilizados, como la cinética de estas moléculas no son idénticos y pueden tener papeles biológicos distintos. Los distintos patrones de expresión subcelulares de LC3s proporcionan una base para estudios posteriores
Visto:. Koukourakis MI, Kalamida D, Giatromanolaki A, Zois CE, Sivridis E, Pouliliou S, et al. (2015) Las proteínas autofagosoma LC3A, LC3B y LC3C Tienen distinta cinética distribución subcelular y la expresión en líneas celulares de cáncer. PLoS ONE 10 (9): e0137675. doi: 10.1371 /journal.pone.0137675
Editor: M. Srinivasa Srinivasula, IISER-TVM, INDIA
Recibido: 4 Julio, 2015; Aceptado: August 20, 2015; Publicado: 17 Septiembre 2015
Derechos de Autor © 2015 Koukourakis et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. el estudio ha sido financiado por la «formación y aprendizaje permanente - aristeia» del proyecto, número de código 520, ESPA 2007-2013, número de decisión GGET 12605 /26.09.2012 (URL: http://www.espa.gr/el/pages/proclamationsfs.aspx?item=1736). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
autofagia es una vía intracelular importante de la degradación y el reciclaje de las proteínas de larga vida y orgánulos enteras [1,2]. LC3s (MAPA 1-LC3s) son proteínas estructurales de las membranas autophagosomal. La familia de genes LC3 humano tiene tres miembros, LC3A, LC3B y LC3C, mientras que dos variantes de la proteína LC3A se han identificado [3,4]. La familia de genes LC3 humano tiene tres miembros del LC3A, LC3B y LC3C mientras que en un trabajo reciente ha informado de cinco miembros, LC3A (variante 1, variante 2), LC3B, LC3B2 y LC3C [4]. La forma LC3-II es uno de los principales componentes de la membrana autophagosome (LC3A-II y LC3B-II, también LC3C-II, pero no se ha estudiado aquí) que reside tanto en el sitio interior y exterior de la membrana. El LC3-II se deriva de una proteína de 30kDa proLC3 ~ después de la escisión por autophagin Atg4 para producir la forma citosólica activa LC3-I. Esto a su vez es activado por ATG7, y luego fue trasladado a Atg3, una segunda enzima E2-como, convirtiéndose en una forma unida a la membrana, LC3-II [5]. Después de la formación autophagosome, la LC3-II ubicado en el sitio exterior se libera al citosol y la LC3-II ubicado en el sitio interior se degrada por hidrolasas [6]. En esta última forma, LC3-II se localiza en las membranas autophagosomal y autolysosomal esféricas, formando un marcador adecuado de la actividad de autofagia [6,7].
Ya sea que estas tres proteínas LC3 tienen una función biológica similar en la autofagia u otro vías sigue sin estar clara. En la literatura, la mayoría de los estudios se centran en una expresión general LC3, sin informar sobre la especificidad de los anticuerpos utilizados, basado en la suposición arbitraria que las formas A y B son equivalentes. En el presente estudio examinamos, después ampliamente validar la especificidad del anticuerpo, la expresión en paralelo de los tres LC3A, B y C proteínas en líneas celulares de cáncer humano, mostrando distintos patrones de localización subcelular, lo que sugiere un papel biológico distinto de estas proteínas hermanas .
resultados
identificación de LC3A y los anticuerpos específicos B
La especificidad de los anticuerpos ensayados contra de las proteínas recombinantes humanos disponibles y comerciales LC3A LC3B se muestra en la figura 1A. Los anticuerpos anti-LC3A (ap1805a y ab62720) son específicos de la LC3A proteínas y los anticuerpos anti-LC3B (5F10) y NB100-2220 son específicos de la proteína LC3B. La L8918, L7543 y NB600-1384 puede unirse o bien a la LC3A o LC3B, pero con diferente sensibilidad, mientras que el ab52628 no pudo detectar ninguna de las dos isoformas en las mismas condiciones.
(A) Especificidad de diversos anticuerpos anti-LC3 probados contra proteínas LC3A y LC3B recombinantes. (B) El procesamiento LC3A y LC3B después de 24 horas de bafilomicina (100 nM) de tratamiento en las líneas de glioma y celulares de cáncer de mama, utilizando el ab62720 específica LC3A y del LC3B anticuerpos específicos 5F10 (C) immunofluorecence doble en la línea celular A549 usando el ab62720 reconociendo exclusivamente la proteína LC3A y el anticuerpo 5F10 que reacciona exclusivamente con LC3B. Observado una expresión claramente distinta de LC3A en las vacuolas verdes con perinuclear /localización nuclear y de vacuolas rojos LC3B que tienen una difusa por todo el citoplasma, localización. No hay autofagosomas compuestas de dos proteínas LC3A y LC3B (c1, c2), mientras LC3A y mostrar LAMP2a amplia colocalización (C3, C4). La identidad distinta de LC3A y LC3B autofagosomas también fue confirmada en condiciones ácidas (C5) y después de la exposición a bafilomycin (c6). (D) immunofluorecence doble en la línea celular A549 usando el ab62720 reconocer exclusivamente la proteína LC3A y la NB600-1384 que reacciona con las proteínas de LC3A y LC3B. Señaló que la mayoría de la perinuclear /LC3A nuclear (verde) vacuolas muestran inmunofluorescencia doble (amarillo), resultado de la doble reactividad LC3A /LC3B que produce el anticuerpo NB600-1384. (E) y LC3A LC3B siRNAs bloquean específicamente la expresión de las proteínas LC3A y LC3B, respectivamente, en la línea celular A549 (E1,2,3). En E4 la reactividad de LC3A (ab62720 Ab) y de la LC3B (5F10 anticuerpo) se muestra, a raíz de silenciamiento de la LC3A o de los genes LC3B, en la línea celular A549.
Nos centramos en tanto LC3A y proteínas LC3B para analizar la respuesta de la autofagia para bafilomicina en líneas celulares utilizando los dos anticuerpos que reconocen selectivamente estas isoformas. Las dos isoformas mostraron diferente línea de base y la expresión perfil de respuesta (Fig 1B) Bajo estrés bafilomicina no había acumulación de la LC3A-II y LC3B-II en todas las líneas celulares, lo que sugiere que ambas proteínas se podrían utilizar para evaluar flujo autophagic (Fig 1B) . Las líneas celulares T98G y BT474 tienen mayor flujo de autofagia (según la evaluación, ya sea por LC3A o inmunotransferencia LC3B) en comparación con el U87MG y MDA-MB-231, respectivamente (Figura 1B).
LC3A y autofagosomas LC3B expresar
la microscopía confocal con inmunofluorescencia doble LC3A /B, utilizando anticuerpos específicos de tipo LC3, reveló que LC3A y LC3B autofagosomas son distintos y que no hay autofagosomas que expresan ambas proteínas (Fig 1C1 y 1C2). Este hallazgo fue universal en todas las líneas celulares examinadas. análisis de colocalización reveló un porcentaje & lt; 1%, mientras que LC3A /LAMP2A colocalización en células de control fue mayor que 20% (Fig 1C3 y 1C4)
La identidad distinta de LC3A frente autofagosomas LC3B también se confirmó después de la intensificación de la autofagia. en condiciones ácidas (Fig 1C5) y después de bloqueo de flujo la autofagia tras la exposición a bafilomicina (Fig 1C6). En contraste, los anticuerpos no específicos mostraron una expresión amplia superposición, un resultado de la doble reconocimiento de LC3A y LC3B por el anticuerpo (Fig 1D1 y 1D2).
Uso de siRNA para LC3A y LC3B, éstos bloquean específicamente la acumulación de LC3A o de autofagosomas LC3B, respectivamente (Fig 1E1, 1E2 y 1E3). El silenciamiento de LC3A o de LC3B confirmó la pérdida de la identificación de las proteínas respectivas en transferencias Western (Figura 1E4).
citoplasmática LC3A y patrones de localización LC3B
La distribución de LC3A y LC3B en el citoplasma era bastante distinta. LC3A se acumuló principalmente en el área perinuclear, mientras LC3B se distribuyó uniformemente por todo el citoplasma. Este fenómeno fue evidente en todas las líneas celulares examinadas y, como se muestra por análisis de la intensidad de la expresión citoplásmica, LC3A perinuclear alcanzó hasta el 90% (rango 60 a 90%) de la proteína total contenido citoplásmica (Fig 2A1-2A7). De vez en cuando, pequeños + autofagosomas LC3A incluyen en LC3B + autofagosomas eran evidentes en el citoplasma (Figura 2A1 y 2A2).
(A) de doble inmunofluorescencia confocal para LC3A (verde) y LC3B (rojo) en diversas líneas celulares. Tomó nota de la acumulación LC3A en la zona perinuclear, mientras LC3B se distribuye por todo el citoplasma (A1-7). agregados LC3, sugerentes de pequeños + autofagosomas LC3A incluyen en autofagosomas LC3B +, están presentes ocasionalmente (en cajas A1,2). Western blots confirman la presencia nuclear de LC3A en los núcleos, principalmente con la forma LC3A-II (A8). (B) Los nucléolos se tiñen con el MIB1 /verde (B1), el LC3B /rojo (B2), pero no el anticuerpo LC3A /violeta (B3); LC3A ap1805a específico y de la LC3B se utilizaron anticuerpos específicos 5F10. Esto se confirma en doble inmunotinción de LC3A /MIB1 (B4), LC3B /MIB1 (B5) y LC3A /LC3B (B6). Señaló que LC3B tiñe las áreas internas del nucléolo, mientras MIB1 el periférico. (C) La actinomicina D daña los nucleolos y se altera el LC3B nucleaolar y localización MIB1 (C1). Las condiciones ácidas (pH = 6,5; C2) o hipertermia (40 ° C; C3) no anulan la distribución de LC3B en los nucleolos ni de LC3A en los núcleos. Lamin también se utiliza como un control para confirmar la presencia de núcleos sólo en la fracción nuclear.
LC3A Nuclear y localización LC3B patrones
LC3A fue claramente localiza en los núcleos de todos los cáncer líneas celulares examinadas, incluyendo el de la línea de fibroblastos humanos MRC5 (Fig 2A1-2A7) HUVEC y s. El análisis de transferencia Western después de triple fraccionamiento (poseedores de pellets sobrenadante) mostró claramente la presencia de las proteínas LC3A en los núcleos, como la forma más evidente LC3A-II, que era más prominente en las células de glioblastoma (Figura 2A8).
LC3B se expresó mal en los núcleos pero fuertemente expresada en las regiones nucleolares, un área que fue negativo para LC3A. tinción fuerte nucleolar es evidente en 60-95% de las células dependiendo de la línea celular. Por ejemplo, la línea celular de cáncer de pulmón A549 exhibe este patrón de tinción en el 60% de las células cultivadas, mientras que esto es tan alta como 95% en la línea celular H1299 cáncer de pulmón. Fig 2B1-2B6 muestran un patrón típico de expresión en 4 colores microscopía confocal. manchas Ki67 nucleolos y colocaliza con LC3B, pero no LC3A. El tratamiento de células con actinomicina D (Fig 2C1) que daña nucleolos resultó en la falta de LC3B y localización Ki67 en los núcleos. En contraste, la exposición de las células a condiciones ácidas (pH = 6,5) o hipertermia (40 ° C) durante 24 horas no se abroga la distribución de LC3B en el nucleolos o de LC3A en los núcleos (Fig 2C2 y 2C3). El análisis de transferencia Western en la fracción nuclear confirmó la presencia de la proteína LC3B (Fig 3).
(A, B, C) de incubación 24 horas con Leptomycin B a 10 ng /ml, los resultados en la acumulación nuclear de LC3A, LC3C y Beclin-1 en pulmón A549, H1299 y U87 glioblastom, líneas de células T98. (D) incubación 24 h con ivermectina en 100μg /ml, redujo la expresión nuclear de LC3A /Beclin-1 en A549 y las líneas celulares H1299 y el aumento de la acumulación perinuclear de LC3A en la línea celular H1299. (E) transferencias de Western de la fracción de células acumulación nuclear de confirmar LC3s y Beclin-1 en líneas celulares de glioblastoma pulmón y después de la incubación con Leptomycin B. La reducción de las proteínas después de la incubación con Ivermectina no fue constante en todas las líneas celulares.
Expresión de LC3C
LC3C se expresó claramente en el citoplasma y más intensamente en los núcleos de las células (Fig 4A). Western blot mostró una clara presencia de LC3C en la fracción nuclear (Figura 4E). No hubo localización evidente en las áreas nucleolar y en inmunofluorescencia doble con LC3B no carecen claramente de collocalizaton en los nucleolos y en el citoplasma (Fig 4B). En inmunofluorescencia doble, LC3C fue ampliamente co-localizada con la LC3A en el área nuclear (Figura 4C y 4D), mientras que su colocalización fue mínima en el citoplasma. La expresión prominente de LC3C en los núcleos también se confirmó en análisis de transferencia Western (Fig 4E). Estos resultados fueron confirmados en todas las líneas celulares examinadas. La Tabla 1 resume los distintos patrones de expresión de LC3A, LC3B y LC3C.
(A) citoplasmática y la tinción nuclear de LC3C (rojo) en la línea celular U87. (B) LC3C doble (rojo) y LC3B (verde) inmunotinción en las células U87 que muestran la falta de co-localización entre las dos proteínas, tanto en el citoplasma y las regiones nucleares /nucleolar. (C, D) LC3C doble (rojo) y LC3A (verde) que muestra la inmunotinción co-localización entre las dos proteínas, principalmente en el área nuclear (U87 y células T98 líneas). (E) Western blot para LC3C en el nuclear (N), Pellet (P) y la fracción soluble (S) de las células U87 y T98. 'M' es el marcador y Lamin se utilizó como control para confirmar la presencia de núcleos sólo en la fracción nuclear.
LC3 núcleo-citosólica tráfico
Las células se se incubaron durante 24 horas con Leptomycin B, un inhibidor específico y potente de la vía CRM1 /exportin 1 de exportación nuclear. A los 10 ng /ml para incubación 24 horas, se aumentó la acumulación de LC3A en los núcleos, lo que sugiere un bloqueo de la cinética de LC3A de extrusión de los núcleos (Fig 3A). De interés, LC3A acumulación nuclear mostró una intensa co-localización con la proteína de señalización de la autofagia Beclin-1, y la cinética similares bajo Leptomycin B exposición (Fig 3B). la cinética y los patrones de colocalización similares con Beclin-1 se confirmó para la proteína LC3C (figura 3C).
ivermectina, por otra parte, es un potente inhibidor de la importin
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1) de transporte dependiente de la importación nuclear. Las células se incubaron durante 24 h con ivermectina a diversas concentraciones. Tras una incubación de 24 horas a 100 g /ml, la acumulación de LC3s y de Beclin-1 en los núcleos se redujo, mientras que la tinción citoplásmica se incrementó (Fig 3D y 3E). Los resultados, sin embargo, entre las variadas líneas celulares, como la expresión de disminución no fue confirmada por todas las proteínas en todas las líneas celulares.
Discusión
En los seres humanos la familia de genes LC3 tiene cinco miembros, el LC3Av1 ( variante 1; NM_032514), LC3Av2 (variante 2; NM_81509), LC3B (NM_022818), LC3B2 (NM_001085481) y la LC3C (NM_001004343). El geneloc para LC3A es 20.q11.22 mientras que para el MAP1LC3B es 16q24.2 y MAP1LC3C se 1q43. Tanto LC3A y LC3B se expresan diferencialmente en los tejidos normales [3,4,7,8]. Además, la LC3C (la tercera isoforma de la familia LC3) se cree que es deficiente o no se expresa en la mayoría de los tejidos normales [3,4,7]. Sin embargo, sólo el LC3A (variante 1), y LC3B LC3C ha sido mostrar a tener modificación posterior a la traducción y generar la forma-II [4]. Por otra parte, volviendo a la literatura [3,7,8] el sitio posterior a la traducción de la MAP1LC3B solamente no se conserva. Por ejemplo He et al. 2003 [3] informó de que el sitio esencial para la modificación post-traducción distinta de MAP1LC3B es Lys-122 en lugar de la conservadas Gly-120, que informó de la MAP1LC3A y MAP1LC3C. Por otro lado Tanida et al. 2005 [8] informó de que el extremo carboxilo terminal de MAP1LC3B se escinde para exponer Gly (120) para otras reacciones ubiquitylation-similares. En estas dos publicaciones que las costuras que el MAP1LC3B producir el LC3B-II, mientras que el sitio de modificación posterior a la traducción no se conserva.
En la literatura el marcador de autofagia endógena mejor estudiado es LC3B. Se hace hincapié, sin embargo, que la mayoría de los estudios realizó anticuerpos anti-LC3 uso que se presumen anti-LC3B y no anti-LC3A, sin haber validado su especificidad [9,10,11]. Hay una alta identidad entre la LC3A y isoforma LC3B, lo que indica que los epítopos usados para desarrollar anticuerpos específicos son cruciales. De acuerdo con nuestros resultados algunos anticuerpos no son específicos, reconociendo ambas isoformas con una sensibilidad variable, mientras que otros son capaces de detectar las isoformas específicas de LC3A y LC3B. En cualquier caso, especificando el tipo LC3 estudiado sería innecesario si es que las diferentes proteínas LC3 tenían el mismo patrón de expresión y la biología en tejidos normales y cancerosas. Sin embargo, este no es el caso, como se muestra en el presente estudio.
En un estudio previo de los nuestros [12], examinando el flujo de autofagia en tejidos de ratón después de varios tipos de estrés, el trabajo inmunotransferencia mostró que la proteína LC3A sigue patrones discretos de los cambios LC3A-I y II-LC3A en hígado, pulmón, riñón y tejidos del corazón de los ratones. Esto hizo hincapié en que LC3A también es inducible por estrés y tiene patrones específicos de expresión de su forma unida soluble y autofagosoma. En este documento, en microscopía confocal utilizando validado anticuerpos anti-LC3 específicos que confirmó que LC3A y LC3B autofagosomas son distintos, nunca integrado por ambas proteínas y tiene la distribución subcelular distinta. El LC3A frecuente expresión perinuclear contrasta con la distribución más homogénea de LC3B por todo el citoplasma, lo que sugiere un papel biológico distinto entre los dos tipos autofagosoma. De interés, en un artículo de Bai et al. 2012 [4]. LC3A y LC3B con frecuencia co-localizados en el mismo punto lagrimal en condiciones de hambre (67%), mientras que en condiciones basales la co-localización se encontraba en 13% en SAOS-2 células. También hemos tomado nota, en la microscopía confocal, una colocalización esporádica de LC3A y LC3B, dando la impresión de un gran LC3B + autofagosoma digerir una LC3A + uno.
La biología citoplasmática de LC3 mediada por la autofagia está bien estudiado. El papel de LC3s en los núcleos sigue siendo oscuro. Karim et al detectó primero la forma de proteína LC3-II en los núcleos de hepatocitos de rata [13], que está de acuerdo con nuestra experiencia no publicado con hepatocitos BALB /c de ratón. Drake et al informaron de que aunque LC3A y B comparten conocido no señal de localización nuclear, puede existir una señal de exportación nuclear, que se encuentra en los residuos 63 a 73 de LC3 humana [14]. proteína EGFP-LC3 fue claramente localizada en los núcleos de células COS-7. En el estudio actual, el uso de una amplia gama de líneas celulares de cáncer, así como fibroblastos humanos normales y células endoteliales, que confirmó la presencia nuclear de las tres proteínas LC3. Hubo, sin embargo, una localización diferencial sorprendente de la proteína LC3B que preferencialmente localizada en las regiones nucleolares, mientras que las formas A y C fueron localizados en el área nuclear extra-nucleolar. El papel de este LC3B expresión nucleolar sigue siendo un misterio, al igual que el papel de LC3A y LC3C en el resto del núcleo. He et al propone que LC3 nuclear puede estar implicado en el control de la proliferación celular en la leucemia promielocítica [15].
Hemos investigado si las vías de transporte conocidos nucleares están involucrados en el tráfico de núcleo-citosólica de LC3s. Se estudió la importación y exportación vía de la proteína nuclear mediada por complejos de poro nuclear (NPC), utilizando el agente Leptomycin B, un antibiótico antifúngico, que específicamente y potentemente inhibe la CRM1 /exportin 1 vía de exportación nuclear por directamente la unión de la proteína CRM1 [16 , 17]. Después de la incubación de 24 horas de pulmón y líneas celulares de glioblastoma, una acumulación sustancial de LC3A, LC3C y de Beclin-1 proteínas fue evidente por microscopía confocal, que también fue confirmado el análisis de Western blot. Esto contrasta con el hallazgo por Drake et al [14], donde un corto de incubación de 3 horas las células COS-7 y HeLa con Leptomycin no dio lugar a la acumulación nuclear de EGFP-LC3. Beclin-1 contiene una señal de exportación nuclear rica en leucina y alteración de la función CRM1 resultado la acumulación nuclear de Beclin-1 [18]. De interés, Beclin-1 co-localiza en los núcleos con LC3A y LC3C, mientras que no prominente co-localización se observó en el citoplasma. Si la unión a LC3 se requiere Beclin-1 para la entrada nuclear de un complejas demandas más investigación.
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1) de transporte dependiente de la importación nuclear, sin efecto sobre las proteínas que contienen la señal de localización nuclear (NLS) reconocido por vías alternativas de importación nuclear [19] la incubación de líneas celulares de cáncer con ivermectina generado una disminución en la expresión de LC3s y Beclin-1 en los núcleos, un resultado sin embargo, que varió entre líneas celulares y las proteínas examinadas.
Dado que las proteínas endógenas LC3 son importantes marcadores de autofagia, es esencial para comprobar la especificidad de los anticuerpos utilizados al realizar experimentos para LC3A o procesamiento LC3B en respuesta a diferentes tipos de factores estresantes. Estas moléculas no son idénticos y pueden tener funciones biológicas distintas, no están bien aclaradas aún. La localización nucleolar LC3B y la LC3A nuclear, LC3C y Beclin-1 acumulación encontrado en el presente estudio proporcionan una base para futuros estudios sobre la función biológica distinta estas proteínas pueden tener en tejidos normales y cancerosas.
Materiales y Métodos
cultivos de líneas celulares
pulmón líneas celulares de cáncer A549 (adenocarcinoma de pulmón humano, CLS GmbH, Alemania), y H1299 (no microcítico de pulmón de células de carcinoma humano, ATCC), líneas celulares de glioblastoma U87MG ( humana glioblastoma-astrocitoma, CLS GmbH, Alemania) y T98G (glioblastoma multiforme humano, ATCC), líneas celulares de cáncer de mama (HER2 + BT474, HER negativo MDA-MB-231, DA3; ATCC), así como MRC5 de fibroblastos embrionarios de líneas celulares ( CLS Cell Line Service, Alemania) se cultivaron utilizando medio basal DMEM (31885-023, Gibco). También se estudiaron; células HUVEC (CLS de la célula Servicios En Línea, Alemania) cultivadas en medio específico (Lonza EBM ™ -2 medio basal con EGM ™ -2 SingleQuots ™ de factores de crecimiento). El medio de cultivo basal se suplementó con 10% de FBS (FB-1000/500, Biosera), 100 unidades /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina (15140-122, Gibco) y 2 mM L-glutamina (25030, Gibco). Las células se mantuvieron en condiciones estándar, 37 ° C, 5% de CO2 en atmósfera humidificada y se utilizaron al llegar a 70-90% de confluencia.
Químicos
Los cultivos celulares se tratan por separado, tal como se especifica para el tiempo de 24 horas de incubación con Leptomycin B (L2913, Sigma-Aldrich) a una concentración final de 20 ng /ml y la ivermectina (I8898, Sigma-Aldrich) a una concentración final de 100 mg /ml.
identificación de LC3A, B y C anticuerpos específicos
para probar la especificidad de los anticuerpos disponibles en el mercado en cuanto a su especificidad para LC3A o LC3B se utilizaron los siguientes anticuerpos contra las proteínas recombinantes LC3A (H00084557-P01, Abnova) comercial disponible humana y LC3B ( H00081631-P01, Abnova):
El policlonal de conejo a LC3A (1: 30.000, ab62720, Abcam, un PSDRPFKQRRSFADR péptido sintético conjugado con KLH por un enlazador residuo de cisteína, correspondiente a los aminoácidos 2-15 de MAP1LC3A humano)
el policlonal de conejo a LC3A (1: 2500, 1805a, Abgent, un sintético entre 97 ~ 120 aminoácidos del sitio de escisión C-terminal de uso humano-LC3A escindido como un epítopo)
la conejo monoclonal a LC3A (1: 1000, ab52628, Abcam)
el policlonal de conejo a LC3B (1: 5.000, NB600-1384, Novus, un péptido sintético hecho a la región N-terminal de la LC3 humano, isoforma proteína B), Francia
El policlonal de conejo a LC3B (1: 5.000, L7543 Sigma-Aldrich, un péptido sintético correspondiente a los aminoácidos 2-15 de LC3B humana, conjugado con KLH)
el policlonal de conejo a LC3B (1: 5000, NB100-2220, Novus, un péptido sintético hecho a una porción N-terminal de la secuencia de la proteína LC3B humana entre los residuos 1 a 100)
el policlonal de conejo a LC3 ( 1: 5.000, L8918, Sigma-Aldrich, un péptido sintético correspondiente a los aminoácidos 36-49 de la isoforma humana LC3A a, conjugado con KLH a través de residuo de cisteína C-terminal)
el anticuerpo monoclonal de ratón contra al. LC3B. (1: 5000, 5F10, Nanotools, un péptido sintético hecho a una porción N-terminal de la proteína humana LC3B)
en cuanto a la anibody anti-LC3C, hemos utilizado el conejo policlonal (18726-1-AP, Proteintech Europa) anticuerpo. La especificidad del anticuerpo anti-LC3C utilizado se ha informado anteriormente (http://www.ptglab.com/Products/Search.aspx?key=LC3C).
La exposición a bafilomicina
LC3A y LC3B se analizaron en líneas celulares bajo la exposición al agente autofagia interrumpir bafilomicina a [8]. Bafilomicina A es un inhibidor específico del tipo vacuolar H (+) - ATPasa (V-ATPasa) en las células, inhibe la acidificación de orgánulos que contienen esta enzima (por ejemplo, los lisosomas y endosomes) y, por otra parte, inhibe la fusión de autophagososomes con el lisosomas [8]. La evaluación se realiza 24 horas después de la incubación de las células con 100 nM bafilomicina.
SDS-PAGE e inmunotransferencia
Las células se lavaron con PBS dos veces y se lisaron en un tampón de lisis a base de sacarosa (0,25 M de sacarosa , 25 mM Tris-HCl, pH 7,4) que contiene inhibidores de la proteasa (complete Mini cóctel inhibidor de la proteasa, Roche Diagnostics GmbH) y inhibidores de la fosfatasa (fosfatasa cóctel inhibidor, Cell Signaling Technology). Una centrifugación diferencial de los lisados de células enteras llevó a nuclear, sobrenadante (proteínas solubles citoplasmática de agua) y pellet (proteínas de membrana) fracciones. la cuantificación de proteínas se realizó de acuerdo con el Kit de ensayo de proteínas BCA Pierce ™ (# 23225, Thermo Scientific).
Las muestras de proteína se separaron en geles de SDS discontinuos utilizando 10% de gel de separación para Beclin-1 mientras que para LC3A, LC3B y se utilizó LC3C 12,5% de gel de separación. Por otra parte, se utilizó 5% gel de apilamiento. Cuarenta nanogramos de muestras analizadas en el gel. La inmunotransferencia se llevó a cabo utilizando membranas de PVDF-PSQ (Millipore Corp.). A continuación, las membranas se bloquearon con leche en polvo 5% sin grasa en NaCl 150 mM, Tris 10 mM, pH 7,5 (TBS) y 0,1% (v /v) de Tween-20 a temperatura ambiente durante 2 horas, seguido de la hibridación durante la noche a 4 ° C con anticuerpos primarios. Las membranas se hibridaron durante 2 horas a temperatura ambiente con el anticuerpo secundario, anticuerpo policlonal de cabra a IgG de conejo-HRP (1: 3.000, Biorad, 1.706.515, EE.UU.) o policlonal de cabra a IgG de ratón-HRP (1: 3.000, Biorad, 1.706.516, ESTADOS UNIDOS). Las bandas se desarrollaron usando ChemiDoc MP Imaging System (BioRad, EE.UU.)
Los anticuerpos primarios utilizados fueron: i.) Policlonal de conejo a LC3A (1: 1.000, ab62720, Abcam, un PSDRPFKQRRSFADR péptido sintético conjugado con KLH por una La cisteína enlazador residuo, correspondiente a los aminoácidos 2-15 de MAP1LC3A humano), ii) anticuerpo monoclonal de ratón a LC3B (1: 1.000; LC3B 5F10 Nanotools), iii) anticuerpos policlonales de conejo a MAP1LC3C (1: 1.000, ProteinTechLab) y iv) anticuerpo policlonal de conejo para Beclin-1 (1: 2.000, A303-673A, Bethyl Laboratories, Inc., EE.UU.)
Cada una de estas manchas se separa entonces, se seca durante la noche, re-hibridado con el anticuerpo monoclonal de ratón a la actina beta. (1: 5000, NB600-501, Novus Productos Biológicos)
siRNA
siRNAs LC3A se agruparon como (5'-GCGAGUUGGUCAAGAUCAUTT-3 '), (5' GCUUCCUCUAUAUGGUCUATT-3 ' ), (5 'CCUGCUGUGUGGUUCAUCUTT- 3'), (5 'GCUGUAAGGAGGUACAGCATT-3'), y LC3B siRNA se agruparon respectivamente (5'-GCCCUCUACUGAUUGUUAATT-3 '), (5' CUCCCUAAGAGGAU CUUUATT-3 '), (5'-GCCUGUGUUGUUACGGAAATT- 3 '). Estos fueron sintetizados encargo de Shanghai GenePharma Co., Ltd (China). Estos se utilizaron en 20 a 50 nM para transfectar las células utilizando HiPerfect (QIAGEN) durante 24 h, mientras que la eficiencia silenciamiento de siRNAs se confirmó tanto por microscopía confocal y de transferencia Western después de 24 h.
inmunofluorescencia confocal y análisis de imágenes
para la tinción de inmunofluorescencia, las células se hicieron crecer sobre cubreobjetos de vidrio No. 1.5, se fijaron en 3,7% de paraformaldehído /PBS pH 7,4 durante 20 min a 37 ° C y luego se permeabilizaron en PBS /0,1% v /v Triton X- 100 pH 7,4 durante 5 min a temperatura ambiente. Además, las células se bloquearon en PBS /5% w /v BSA pH 7,4 durante 20 min y se tiñeron con diversos anticuerpos primarios: anti-Ki67 (MIB1) monoclonal de ratón (1: 150; DAKO), anti-LC3A policlonal de conejo (1 : 500; Abcam), anti-LC3C policlonal de conejo (1: 200; Proteintech Europa), anti-LC3B monoclonal de ratón (1: 200; Nanotools) y anti Beclin-1-policlonal de conejo (1: 100, ab62557, Abcam) para . 1 h a temperatura ambiente
Las células se lavaron en PBS pH 7,4, se incubaron con CF apropiado 488 y 564 anticuerpos secundarios a TA y el ADN se contratiñeron con Hoechst 33342 (1 mg /ml; Sigma-Aldrich). Después de lavados finales cubreobjetos se montaron en medio de montaje Mowiol casera. Imágenes se realizó en una revolución Andor personalizado disco giratorio confocal sistema construido en torno a un soporte (IX81, Olympus) con una lente de 60x y una cámara digital (Andor Ixon + 885) (Fondo para CIBIT, MBG-Duth). La adquisición de imágenes se realizó en el software IQ 2 Andor. secciones ópticas se registran cada 0,3 m. Todas las imágenes de microscopía confocal se presentan en este trabajo son proyecciones 2D de máxima intensidad de imágenes z-stack, y análisis de imágenes para los conjuntos de datos obtenidos se ha realizado utilizando ImageJ 1.47v (Instituto Nacional de Salud, EE.UU.). Co-localización imágenes de análisis y cálculo del coeficiente de Pearson para las imágenes analizadas se realizaron utilizando una combinación del Buscador de colocalización y los Coloc 2 plugins en ImageJ.
Ética
El estudio ha sido aprobado por la Universidad Demócrito de Tracia Comité de Ética de Investigación.
Reconocimientos
el estudio ha sido financiado por el «FORMACIÓN Y APRENDIZAJE PERMANENTE-aristeia» del proyecto, número de código 520, ESPA 2007-2013, GGET número de decisión 12605 /26.09.2012