Extracto
La inmunoterapia se aproxima mediante el bloqueo puesto de control, sola o en combinación con la vacuna de antígeno tumoral, o la transferencia adoptiva de células, están emergiendo como los enfoques prometedores para el tratamiento del cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). En preparación para las próximas estrategias de inmunoterapia combinada en CPNM, aquí, hemos evaluado las respuestas inmunes espontáneas a XAGE-1b, un antígeno específico de tumor del grupo de cáncer de testículo antígeno que se ha informado anteriormente a ser espontáneamente inmunogénica en la población japonesa, en una cohorte de los pacientes caucásicos con CPNM. Encontramos respuestas serológicas espontáneas a XAGE-1b en el 9% de los pacientes. Es importante destacar que estas respuestas se limitan a, y representaron el 13% de los pacientes con tumores de adenocarcinoma, el subtipo histológico más frecuente, para el que los enfoques de inmunoterapia están en desarrollo. El uso de un conjunto de péptidos que abarcan toda la proteína XAGE-1b se superponen, y en apoyo de los datos serológicos, hemos detectado
+ respuestas de células significativa XAGE-1b específicos CD4 T en todos los pacientes seropositivos XAGE-1b e identificamos varias CD4
+ epítopos de células T. En conjunto, nuestros resultados apoyan la relevancia del antígeno XAGE-1b en pacientes caucásicos con CPNM con adenocarcinoma, y la puesta en práctica de los futuros inmunoterapias que aprovechan la alta inmunogenicidad del antígeno en esta población de pacientes
Visto:. Saito K, Nakayama E, D Valmori (2016) la respuesta inmune a la del cáncer de testículo antígeno XAGE-1b en no microcítico de pulmón de raza blanca pacientes. PLoS ONE 11 (3): e0150623. doi: 10.1371 /journal.pone.0150623
Editor: Takuma Kato, Mie University Graduate School of Medicine, JAPÓN
Recibido: December 11, 2015; Aceptado: 17 Febrero de 2016; Publicado: 3 Marzo 2016
Derechos de Autor © 2016 Saito et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del papel
Financiación:. Este estudio fue apoyado por el Instituto Ludwig para la Investigación del cáncer (EE.UU.), el Instituto de Investigación del cáncer (EE.UU.), la Ligue contre le Cancer (Francia) y LABEX IGO (Francia) . Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo, con el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) que representa aproximadamente el 85% de todos los casos de cáncer de pulmón [1]. A pesar de las recientes mejoras en las estrategias terapéuticas, NSCLC constituye por lo tanto uno de los principales problemas de salud pública. En la mayoría de los casos, los síntomas aparecen generalmente en una fase avanzada de la enfermedad, en las etapas metastásico o localmente avanzado, con lo que el tratamiento sea difícil [2]. Después del diagnóstico inicial, una clasificación correcta es crucial para determinar la terapia adecuada. La resección quirúrgica del tumor sigue siendo el estándar de cuidado, pero, por desgracia, es aplicable y se puede considerar una opción coherente y eficaz para la cura, sólo en pacientes con tumores resecables y capaz de tolerar la resección. Sin embargo, aproximadamente 70% de los pacientes con cáncer de pulmón se presentan con localmente avanzado o enfermedad metastásica en el momento del diagnóstico [2]. Para estos pacientes, la primera línea de tratamiento es la quimioterapia basada en platino, que ha demostrado ser beneficioso para la paliación y representa el estándar de cuidado. La radioterapia también se utiliza con frecuencia como una primera línea de tratamiento para el NSCLC y la administración de la quimioterapia y la radiación concurrente está indicado para el cáncer de pulmón en estadio III [2]. Sin embargo, incluso con estos tratamientos, las tasas de supervivencia global en pacientes con CPNM son todavía dramáticamente baja, con una tasa promedio de 5 años de supervivencia del 17% en los pacientes con enfermedad temprana y un 4% en los pacientes con enfermedad metastásica [3]. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar nuevas estrategias terapéuticas para inducir respuestas clínicas más eficaces y prolongar la supervivencia global en esta población de pacientes. En la última década, los nuevos conocimientos en la biología del cáncer ha abierto nuevos enfoques terapéuticos potenciales, incluidas las terapias dirigidas e inmunoterapias. Las terapias dirigidas, tales como los que utilizan inhibidores de la angiogénesis, inhibidores del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFRI) o inhibidores de la tirosina quinasa (TKI) se pueden combinar para las principales modalidades de tratamiento en pacientes que presentan mutaciones específicas [4-6]. Sin embargo, la proporción de pacientes que expresan estas mutaciones es relativamente pequeño (por ejemplo, sólo el 10-15% de NSCLC albergan mutaciones de EGFR). Además, los efectos clínicos de estos tratamientos no son con frecuencia de larga duración, debido al desarrollo de la resistencia [7,8].
Por otro lado, las estrategias inmunoterapéuticas tienen el potencial para reforzar la respuesta inmune del paciente, para inducir respuestas clínicas estables y prolongar la supervivencia [1]. Emergentes estrategias inmunoterapéuticas son los que utilizan anticuerpos específicos del bloqueo puesto de control, que han demostrado eficacia clínica en el subgrupo de pacientes. Los datos recientes sugieren que estos pacientes respondedores son aquellos que albergan las respuestas inmunes espontáneas a la tumor autólogo. Otras estrategias basadas inmunes en NSCLC incluyen la vacunación del cáncer se aproxima usando antígenos de cáncer /testículo (CTA) [1,9], proteínas codificadas por los genes normalmente expresados en células germinales en el testículo y el ovario fetal y, en algunos casos, en los trofoblastos de la placenta, silenciados en tejidos adultos normales, pero aberrantemente re-expresan en diversos tipos de cáncer [10,11]. CTA se expresan en gran medida en los cánceres de diferentes subtipos histológicos, son a menudo altamente inmunogénica y por lo tanto son considerados uno de los objetivos más atractivos para el desarrollo de vacunas contra el cáncer [11]. vacunas contra el cáncer como monoterapia se encuentran en evaluación en el CPNM y podría ser eficaz en pacientes con enfermedad residual mínima [9]. A pesar de los primeros ensayos clínicos que aplican este tipo de estrategia no han cumplido con su objetivo clínico [12], la combinación de la vacunación con terapias de bloqueo de punto de control son muy prometedores [1]. Sin embargo, el uso de estas estrategias requiere la identificación de antígenos tumorales específicos expresados por una fracción significativa de NSCLC, así como de las características de los tumores que los expresan. Varios CTA han demostrado que se expresa en NSCLC. XAGE-1b se codifica por el gen XAGE-1, que se encuentra en la región Xp11.22 del cromosoma X [13,14]. Cuatro variantes de la transcripción, XAGE-1a a d, se han identificado [14-16]. Una transcripción expresado en tumores, XAGE-1b, codifica una proteína larga 81 aminoácidos [14,17]. XAGE-1b se informó de que la transcripción predominante expresado en el CPNM. Se observó expresión XAGE-1b en el 45% de los adenocarcinomas de pacientes japoneses [18]. XAGE-1b ha demostrado inducir respuestas de anticuerpos y células T en pacientes con CPNM japoneses. La frecuencia de respuesta de los anticuerpos se informó a ser mayor en pacientes con adenocarcinoma (14%) que en los pacientes de SCC (2%) [19]. El propósito de este estudio fue extender estos resultados a la población caucásica, para evaluar el potencial de la inmunoterapia basada en XAGE-1b en los caucásicos.
Materiales y Métodos
Pacientes y muestras de purificación celular
las células mononucleares de sangre periférica de muestras (PBMC) se obtuvieron de una cohorte de 141 pacientes con CPNM (Institut de Cancérologie del Oeste (ICO), Saint-Herblain, Francia), después de la aprobación por la Junta de Revisión Institucional de la ICO. CMSP de 60 fueron obtenidos de donantes sanos desde el Etablissement Français du Sang (EFS) Pays de la Loire, tras su aprobación por la Junta de Revisión Institucional de la Etablissement Français du Sang Pays de la Loire (Nantes, Francia). Un formulario de consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos los donantes que participan en el estudio. La cohorte incluyó 91 adenocarcinomas, 40 carcinomas de células escamosas (SCC) y 10 tumores de NSCLC de otros subtipos. PBMC se aislaron por centrifugación en gradiente de densidad. CD4
+ y CD8
+ células T fueron enriquecidas a partir de PBMC mediante clasificación celular magnética usando microperlas (Tecnología de separación de células MACS, Miltenyi Biotec).
Las proteínas y péptidos
La serie 17 de péptidos 16-mer XAGE-1b superpuestas (OLP, Tabla 1) se sintetizaron en un sintetizador de péptidos múltiple, AMS422, ABINED en la Universidad de Okayama. La proteína NY-ESO-1 recombinante se produce en
Escherichia coli
como se describe anteriormente [20]. El XAGE-1b (GAGED2a) proteína (81 aminoácidos de longitud) se sintetizó utilizando un sintetizador de péptidos por GL Bioquímica.
estimulación in vitro de las células CD4
+ y CD8
+ células T
purificada CD4
+ y CD8
+ células T se estimularon con células irradiadas autólogas presentadoras de antígeno (APC) en presencia de una mezcla de 17 péptidos solapantes 16-mer (OLP, 2 M ) (Tabla 1) que abarca toda la secuencia de aminoácidos de la proteína XAGE-1b, rhIL-2 (50 UI /ml) y rhIL-7 (10 ng /ml). Las células se cultivaron en placas de cultivo de 96 pocillos a 37 ° C (CO
2 5%) en Iscove modificado de Dulbecco Medium (IMDM, Gibco) suplementado con 8% de calor suero humano inactivado (HS), GlutaMAX (Gibco), HEPES (Gibco), aminoácidos no esenciales (MEM NEAA, Gibco), ciprofloxacina y penicilina /estreptomicina.
intracelular de citoquinas tinción (ICS)
Tras
in vitro
estimulación , CD4
+ y CD8
+ T células fueron cultivadas durante 14 días y después se evaluó la respuesta de las células T específicas XAGE-1b. Los cultivos se recogieron y se estimularon en presencia o en ausencia de la piscina péptido XAGE-1b (2 M) y se ensayaron en una tinción intracelular de citoquinas 4 horas estándar (ICS), utilizando anticuerpos específicos de citoquinas fluorescente conjugados αCD4 (BD Biosciences), αCD8 (BD Biosciences), αIL-17A (eBioscience) y αIFN-γ (BD Biosciences). A continuación, el perfil de expresión de citoquinas se evaluó mediante citometría de flujo (FACSAria II, BD Biosciences).
ensayo de captura de IFN-γ y el establecimiento de CD4
+ y CD8
+ T clones de células
CD4
+ y CD8
+ T se recogieron y se estimularon en presencia o ausencia de péptido piscina XAGE-1b (2 M). muestras estimuladas se incubaron con un CD45-bi específico y el anticuerpo IFN-γ (reactivo de captura IFN-γ, Miltenyi Biotec) y se incubaron durante 5 minutos en hielo. Las células se colocan entonces en un dispositivo de rotación lenta (Miltenyi Biotec) durante 45 minutos a 37 ° C, para permitir la secreción de citoquinas. Después de este período, las células se lavaron en tampón frío y se incubaron con el reactivo de detección de IFN-γ APC-conjugado (Miltenyi Biotec), durante 15 minutos en hielo, en presencia de αCD4 anticuerpo-citoquina específica (conjugado con FITC). Las células se lavaron adicionalmente con tampón frío y se analizaron por FACS.
células CD4 + T que secretan IFN-γ específicamente en respuesta a la piscina péptido XAGE-1b se clasificaron por citometría de flujo de células, utilizando un FACSAria II. El aislado CD4 de células T productoras fueron clonados bajo condiciones de dilución limitantes, en placas de 96 pocillos, por estimulación con fitohemaglutinina (PHA-L, 1 mg /ml) en presencia de irradiado alogénico de células PBMC y EBV
+ IFN-γ líneas (EBV-HV, EBV-LAZ) y rhIL-2 (150 UI /ml). CD4
+ clones de células T se mantuvieron en IMDM suplementado con 8% hs por la re-estimulación cada 2-3 semanas.
Evaluación de la respuesta serológica
respuestas serológicas fueron evaluados por ELISA, usando placas de 96 pocillos revestidas con la proteína XAGE-1b (2 g /ml) o la proteína NY-ESO-1 (1 mg /ml) durante la noche a 4 ° C. Los sueros se evaluó en un intervalo de diluciones de 1/100 a 1 /100.000. Los títulos de anticuerpos se calcularon como la dilución de suero que corresponde a 50% de la respuesta máxima densidad óptica.
Evaluación de la producción de IFN-γ por ELISA
Para evaluar la producción de antígeno específico IFN-γ, XAGE- 1b clones específicos se estimularon en presencia o en ausencia de la piscina péptido (50 × 10
3 por pocillo, en placas de cultivo de fondo redondo de 96 pocillos). IFN-γ se midió por ELISA en sobrenadantes de 24 h de cultivo, usando placas de fondo plano de 96 pocillos Nunc Maxisorp. Para el ensayo de especificidad fina, las células (50 × 10
3 por pocillo) fueron estimuladas en presencia o en ausencia de XAGE-1b péptidos individuales (300 mM), y la concentración de IFN-γ se midió como anteriormente. Para los experimentos de bloqueo de anticuerpos, αDP (1 mg /ml), αDQ (1 mg /ml), αDR (1 mg /ml) y αDR52b (ascitis, dilución 1:10) anticuerpos se añadieron al cultivo de ensayo. Los alelos que restringen HLA-DR se evaluaron de manera similar por IFN-gamma ELISA, utilizando definidas molecularmente APC. LDR1, proporcionado amablemente por el Dr. M. Hassan Zarour (Universidad de Pittsburgh, EE.UU.), se mantuvieron en medio RPMI completo y se comprobó la expresión de HLA-DR. EBV149 y EBV156, (virus de Epstein-Barr transformado líneas de células linfoblásticas) se obtuvieron a partir de pacientes que expresan HLA-DRB1 * 13.
Resultados
respuestas serológicas a XAGE-1b y NY-ESO-1 en el CPNM pacientes
Hemos examinado una cohorte de 141 pacientes con CPNM para las respuestas serológicas a XAGE-1b y NY-ESO-1, como control interno, mediante ELISA. Los resultados de la evaluación se resumen en la Fig 1. Se evaluó primero los sueros de los pacientes junto con los de 60 donantes sanos a una dilución de 1: 100. Hemos detectado respuestas serológicas significativas a XAGE-1b en 12 pacientes (Fig 1A). Por el contrario, se detectaron respuestas de anticuerpos a NY-ESO-1 en 9 pacientes. a continuación, se evaluaron los sueros de los pacientes seropositivos 12 XAGE-1b en una curva de valoración y se calculó el título de anticuerpos, definido como la dilución de suero que da 50% de la respuesta máxima. Los títulos obtenidos fueron variables entre los pacientes seropositivos y un rango de 1: 250 a 1:. 40000 (figura 1B)
(A) Resumen de la prueba ELISA para los 141 pacientes con CPNM y 60 donantes sanos (HD). La densidad óptica (DO) de corte entre los respondedores y no respondedores se determinó como la media de la DO obtenidos con los sueros de los 60 + 5 desviaciones de alta definición estándar (SD) (línea punteada). (B) Los sueros de titulación de los pacientes seropositivos 12 XAGE-1b y desde 1 HD se realizó en un intervalo de diluciones, de 1/100 a 1 /100.000. Los títulos de anticuerpos se determinaron como la dilución de suero que corresponde al 50% de la respuesta máxima OD.
En la cohorte, 91 tumores fueron adenocarcinomas, 40 eran carcinomas de células escamosas (SCC) y 10 pertenecían a otros subtipos . XAGE-1b pacientes seropositivos se encontraron exclusivamente en el subgrupo adenocarcinoma, y representaron 13% del subgrupo (Tabla 2). Por el contrario, NY-ESO-1 en pacientes seropositivos pertenecían en su mayoría al subgrupo SCC, y representó el 13% del subgrupo mientras que sólo el 3% de los pacientes con adenocarcinoma tenía respuestas serológicas significativas a NY-ESO-1 (Tabla 2). Por lo tanto, se confirmó que XAGE-1b es espontáneamente inmunogénica en NSCLC, principalmente en adenocarcinomas, y demostramos que este es el caso no sólo en la población japonesa, como se describe anteriormente, sino también en los caucásicos. La correlación entre las respuestas serológicas a XAGE-1b y el subtipo histológico de adenocarcinoma alcanzó significación estadística (prueba exacta de Fisher, p = 0,0176). Por el contrario, nuestros resultados indican que las respuestas de anticuerpos a NY-ESO-1 son más frecuentes en pacientes con SCC, con los datos de cerca, pero aún no alcanza significación estadística (prueba exacta de Fisher, p = 0,0563). Estos resultados están en línea con los datos publicados previamente que se observó seropositividad de NY-ESO-1 en el 29% y el 15% de los pacientes con SCC y el adenocarcinoma, respectivamente [21].
Evaluación de XAGE-1b específico de CD4
+ y CD8
+ respuestas de células T
sobre la base de los resultados de la investigación serológica, se evaluaron los pacientes respondedores 12 anticuerpo para CD4
+ y CD8
+ respuestas de células T a XAGE-1b. Con este fin, hemos enriquecido CD4 células T
+ y CD8
+ a partir de PBMC de los pacientes por clasificación celular magnética y estimulados en presencia de un conjunto de 17 péptidos solapantes de 16 mer, que abarca la completa 81 amino secuencia de aminoácidos de la proteína XAGE-1b (Tabla 1) y los cultivaron durante 14 días en presencia de APC irradiado autólogo, rhIL-2 y rhIL-7. Al final del periodo de cultivo, estimulamos alícuotas de los cultivos derivados de cada paciente en ausencia o en presencia de la piscina péptido XAGE-1b y capacidad de respuesta evaluados a XAGE-1b en un ensayo de tinción intracelular de citoquinas estándar 4 horas, usando anticuerpos específico para IFN-γ e IL-17. Se analizaron las muestras por citometría de flujo (Fig 2A y 2C) y se comparó la proporción de IFN-γ la producción de células obtenidas para cada cultivo en relación con su propia respuesta de línea de base (en ausencia de péptidos) para confirmar la respuesta específica de antígeno. CD4
+ T cell respuestas se consideraron significativas cuando la proporción de CD4
+ células T productoras de IFN-γ en presencia de la piscina péptido fue de al menos 3 veces mayor que la observada en la línea base. Sobre la base de estos criterios, se han detectado importantes CD4
+ respuestas de células T a XAGE-1b en todos los pacientes seropositivos (Figura 2B), Por el contrario, sólo en el caso de 1 paciente, hemos detectado una XAGE-1b CD8 específica
+ respuesta de células T (Fig 2D). Sin embargo, no se logró detectar la producción específica de IL-17 en respuesta a XAGE-1b para cualquiera de las culturas.
(A, C) La presencia de XAGE-1b específica de CD4
+ (A) y CD8
+ (C) respuestas de células T se evaluó en la piscina péptido cultivos estimulados por tinción intracelular de citoquinas, con citoquinas anticuerpos específicos αIFN-γ y αIL-17, después de la estimulación en la ausencia o la presencia del péptido XAGE-1b piscina. Los porcentajes de células productoras de IFN-gamma se muestran en los cuadrantes superior izquierdo de cada gráfico de puntos, que muestra una mayor producción de IFN-γ en muestras de péptidos estimulado. Los datos mostrados son un ejemplo de CD4
+ y CD8
+ T cell respuesta del paciente. (B, D) Resumen de la CD4
+ y CD8
+ T cell respuestas se muestran para todos los 12 pacientes seropositivos. Como se muestra en (B), CD4
+ respuestas se detectan en todos los pacientes seropositivos, mientras que una significativa CD8
+ respuesta fue identificado sólo en 1 paciente, NA703 (D). Valores de al menos 3 veces mayor que la línea de base (sin péptido) se consideraron significativos.
Generación de CD4
+ T clones de células, la evaluación de los péptidos activos y restricción HLA
se aislaron XAGE-1b reactivo CD4
+ T células de uno de los pacientes seropositivos XAGE-1b, NA555, por el enriquecimiento de la fracción de células que secreta IFN-γ específicamente en respuesta a la piscina péptido XAGE-1b, por Miltenyi ensayo de captura de IFN-γ (Fig 3A). Para obtener clones específicos, cultivamos las células aisladas bajo condiciones de dilución limitantes, las extendió y luego les evaluó en ausencia o en presencia del péptido piscina XAGE-1b (figura 3B). Obtuvimos específica de CD4
+ clones de células T 14 XAGE-1b, que se caracterizó por su especificidad fina mediante la evaluación de reactividad frente a los 17 péptidos individuales superpuestas que forman el conjunto de péptidos XAGE-1b. Inicialmente hemos probado los péptidos individuales en sub áreas de cada 3 péptidos y determinamos que los péptidos reactivos fueron localizados en las 2 primeras sub áreas que incluyen péptidos C1-C3 y C4-C6 (Tabla 1). Luego se evaluó la respuesta a los péptidos individuales incluidos en esas regiones. Fig 3C (panel izquierdo) muestra un ejemplo de este análisis para un XAGE-1b
+ clon de células T CD4 reactiva (clon A8C7) que reconoce el péptido C3. Un resumen de la evaluación de la especificidad fina del 14 de CD4
+ clones de células T se muestra en la figura 3C (panel derecho). 10/14 clones eran reactivos con el péptido C3, 1 clon reconocido péptidos C3 y C4, 1 clon reconocido C4 péptido, y 2 clones reconocidos C5 péptido. En total, hemos encontrado 4 especificidades finas diferentes. Sobre la base de esta reactividad, se determinó la moléculas MHC de clase II que restringen el reconocimiento del antígeno de los clones individuales representante de los 4 especificidades finas. Con este fin, se evaluó el reconocimiento de antígenos en presencia de αDP, αDQ, αDR y αDR52b anticuerpos específicos, en el contexto de un ensayo de secreción de IFN-γ, donde cada clon se ensayó en presencia o en ausencia del péptido reactiva. La figura 4A muestra un ejemplo de una clase II ensayo de restricción MHC realizado con el CD4 B2F8 clon de células T, que reconoce el péptido C3. Como se muestra, se determinó que el reconocimiento del antígeno por el clon fue inhibida específicamente por el anticuerpo αDR, mientras que no se detectó inhibición con anticuerpos αDP y αDQ de bloqueo, lo que indica que este clon fue restringido por HLA-DR. Se obtuvieron resultados similares para los otros clones. A continuación, el objetivo de identificar los alelos HLA-DR restringen. HLA-DR tipificación molecular reveló que NA555 expresó el DRB1 * 01 y DRB1 * 13 alelos. Para determinar cuál de estas moléculas fue el alelo restringir, que estimuló la clones CD4
+ de células T en presencia de células LDR1 (fibroblastos de ratón transfectadas con HLA-DR1) o líneas de células B transformadas con EBV (EBV 149, EBV 156) que expresan el alelo DR13. Nos pre-incubaron APC con los péptidos reactivos y se evaluó su capacidad para presentar el péptido XAGE-1b correspondiente a los clones de células T CD4. Las respuestas se determinaron midiendo la cantidad de IFN-γ en sobrenadantes de cultivo de 24 horas, por ELISA. Para todos los clones, se detectó el reconocimiento de péptidos en presencia de las líneas celulares EBV-B (EBV 149, EBV 156) que expresan DRB1 * 13, pero no en la presencia de células LDR1 (Fig 4B).
(A ) las células XAGE-1b específica CD4
+ T se aislaron mediante ensayo de captura de IFN-γ. Números indicados en la región superior derecha de gráficos de puntos muestran los porcentajes de IFN-γ células productoras de entre los CD4
+ células T, después de la estimulación, en ausencia o en presencia de la piscina de péptidos. las células productoras de IFN-gamma fueron ordenados y se clonaron bajo condiciones de dilución limitantes. clones (B) de CD4
+ de células T se obtuvieron y se seleccionaron para evaluar la reactividad a XAGE-1b. Los clones fueron estimulados en presencia o ausencia de la piscina péptido y especificidad para XAGE-1b se determinó por ELISA. Las respuestas se consideraron significativas cuando la cantidad de IFN-γ detectado en presencia de péptido fue de al menos 3 veces mayor que la detectada en ausencia de péptido. (C) Las alícuotas de XAGE-1b
+ clones específicos de células T CD4 fueron estimuladas en ausencia o presencia de la piscina péptido o de los péptidos individuales individuales y la cantidad de IFN-γ se midió en sobrenadantes de cultivo 24 horas por ELISA. (D) La reactividad a XAGE-1b péptidos individuales se evaluó en 14 clones y se identificaron 4 finas especificidades.
(A) Identificación de moléculas que restringen MHC II. El panel de la izquierda muestra un ejemplo de un clon de ensayo de restricción HLA-II, B2F8. reconocimiento de péptidos se evaluó mediante ELISA, incubando XAGE-1b específico CD4
clones + T de células que presentan cada uno de los 4 finas especificidades ya sea en ausencia o en presencia de αDP, αDQ, αDR y αDR52b anticuerpos específicos. reconocimiento de péptidos fue restringido por HLA-DR en todos los casos, como se resume en B. El alelo HLA-DR restricción se identificó mediante la incubación de XAGE-1b clones específicos
+ de células T CD4 con diferente APC incluyendo no transfectadas (3T3) o DR1 fibroblastos de ratón transfectadas (LDR1) y líneas celulares EBV-DR13-expresión (EBV149, VEB 156). Cada APC se pre-incubaron con los péptidos reactivos y el alelo restricción se determinó mediante la evaluación de su capacidad para presentar los péptidos a la correspondiente CD4
clones + T en células. reconocimiento de péptidos se evaluó mediante la medición de la secreción de IFN-γ en sobrenadantes de cultivo, en presencia de cada APC. Como se resume, se encontró que el reconocimiento del péptido fue restringido por HLA-DR13 en todos los casos.
Discusión
En este estudio, se investigó anticuerpos espontánea y respuestas de células T a la CTA XAGE 1b en una cohorte de 141 pacientes caucásicos con CPNM. Nuestros resultados demuestran que las respuestas serológicas a XAGE-1b se limitan en gran parte a adenocarcinomas ya que se encuentran en aproximadamente el 13% de ellos, pero no se detectan en SCC. Teniendo en cuenta que XAGE-1b se ha informado que se expresa en aproximadamente el 45% de los adenocarcinomas [18] (pero sólo 7% de SCC), las respuestas serológicas parecen bastante frecuente en este grupo de pacientes, que se encuentra en aproximadamente un tercio de ellas . Estos resultados están en línea con los datos publicados anteriormente en la población japonesa, la presentación de informes respuestas serológicas a XAGE-1b en el 14% de los adenocarcinomas, pero sólo en el 2% de los pacientes con SCC [19]. Nuestros datos también indican que las respuestas serológicas de NY-ESO-1 son en cambio más frecuente en SCC que en adenocarcinoma, ya que se encuentran en el 13% de SCC pero sólo en 3% de los adenocarcinomas de los caucásicos. Una vez más esto está en consonancia con los resultados de estudios previos que han reportado más frecuentes respuestas serológicas espontáneas a NY-ESO-1 en SCC que en el adenocarcinoma [21]. Similar a NY-ESO-1, hemos informado recientemente de que los antígenos MAGE-A, que también pertenecen al grupo de CTA, se expresaron con mayor frecuencia en SCC, en comparación con adenocarcinoma [22]. En conjunto, nuestros resultados confirman la inmunogenicidad XAGE-1b en el adenocarcinoma de pulmón, poniendo de relieve la importancia de este CTA como una prometedora diana para la inmunoterapia contra este subtipo tumoral.
En nuestro estudio, hemos detectado significativa XAGE-1b-específica de CD4
+ respuestas de células T en los pacientes seropositivos, de nuevo en línea con los datos anteriores en la población japonesa [19]. Establecimos poblaciones clonales de un máximo de respuesta, determinamos que la reactividad de los clones era hacia secuencias localizadas en péptidos C3-C5, que corresponden a la región de ácido 9-32 aminoácidos de la proteína, y se identificaron 4 especificidades finas de reconocimiento de antígenos. Hemos demostrado que, para todas las especificidades finas, el reconocimiento del péptido fue restringido por HLA-DR. Mediante la evaluación de la presentación del antígeno usando APC que comparten alelos individuales HLA-DR con las del paciente, se determinó que el reconocimiento de antígenos por los clones fue restringido por el alelo DRB1 * 13. Es de destacar que, mientras que otra XAGE-1b MHC de clase II epítopos restringidos por otros alelos se han reportado [19,23,24], DRB1 * 13 epítopo restringido descrito aquí no se ha informado anteriormente.
Algunos de nuestros resultados están en desacuerdo con los reportados en la literatura [19,25]. Por un lado, tanto en nuestro estudio y en estudios previos en la literatura [19] XAGE-1b específica de CD4
+ células T respuestas fueron detectados en prácticamente todos los pacientes seropositivos NSCLC XAGE-1b. Sin embargo, en desacuerdo con los resultados de un estudio informado recientemente [25] En nuestro estudio, XAGE-1b específica de CD4
+ células T producen IFN-γ, pero no de IL-17, y por lo tanto exhiben un claro perfil Th1. Además, se detectó un CD8
+ respuesta de células T significativa en sólo uno de los 12 pacientes seropositivos, que es mucho menos frecuente que la frecuencia de 6/9 pacientes seropositivos reportados previamente en la cohorte japonesa [19]. Esta discrepancia podría explicarse al menos parcialmente por las diferentes metodologías utilizadas que pueden diferir significativamente en términos de sensibilidad y especificidad de la detección. En efecto, mientras que se evaluó CD8
+ T respuestas de las células en un ensayo de 4 horas estándar tinción intracelular de citoquinas (ICS), en el estudio japonés, CD8
+ T respuestas de las células a XAGE-1b se evaluaron mediante la captura de la secreción de IFN-γ ensayo [19]. Por lo tanto, ya sea la frecuencia de XAGE-1b específica CD8
+ respuestas de células T en los pacientes seropositivos se ha subestimado en nuestro estudio, debido a la menor sensibilidad del método utilizado, o sobreestimado en el estudio de Ohue Y et al. debido a la menor especificidad del ensayo de captura de IFN-γ, dos hipótesis que no son mutuamente excluyentes. Sin embargo, a favor de una sobreestimación del número de verdaderos XAGE-1b CD8
+ T respuestas de las células en el estudio japonés, es el hecho de que los niveles de secreción de IFN-γ obtenidos en ese estudio en la mayor parte de la CD8
+ cultivos de células T tras la estimulación con péptidos XAGE-1b fue muy baja, cerca de los niveles de fondo [19].
en conclusión, en conjunto, nuestros resultados apoyan la relevancia del antígeno XAGE-1b en pacientes caucásicos con adenocarcinoma de pulmón y fomentar la aplicación de futuras inmunoterapias que aprovechan la alta inmunogénica de este antígeno en la población de los pacientes de este.
Además, hay que destacar que, debido a la expresión XAGE1b se sabe que está regulada por la metilación del ADN, inhibidores de la ADN metiltransferasa podría aumentar el potencial elegibles población de pacientes para inmunoterapias XAGE-1b dirigidos, como se informó anteriormente en el caso de NY-ESO-1 [26]. Explorar esta posibilidad podría ser objeto de futuros estudios.