Extracto
Antecedentes
La metástasis es la causa más frecuente de fracaso del tratamiento y la muerte en el cáncer colorrectal. La detección temprana de tumores y metástasis es crucial para mejorar las estrategias de tratamiento y los resultados del paciente. Desarrollo de biomarcadores fiables y simples pruebas de forma rutinaria aplicables en la clínica para la detección, pronóstico y monitoreo de la terapia es de especial interés. Recientemente hemos identificado el gen nuevo asociados a metástasis en el cáncer de colon 1 (MACC1), un regulador clave de la /Met-HGF vía. MACC1 una fuerte biomarcador pronóstico para la metástasis del cáncer de colon y permite la identificación de los sujetos de alto riesgo en las primeras etapas, cuando se determina en los tumores primarios de los pacientes. Para superar la limitación de un número restringido de los análisis moleculares en el tejido tumoral, el establecimiento de un análisis de sangre no invasiva para la detección precoz de los pacientes con cáncer de alto riesgo, para el curso de la enfermedad monitoreo y la respuesta al tratamiento es fuertemente necesario.
Metodología /Principales conclusiones
por primera vez, se describe un ensayo no invasivo para la cuantificación de las transcripciones que circula en la sangre MACC1 de más de 300 pacientes con cáncer colorrectal. los niveles de transcripción MACC1 se incrementan en todos los estadios de la enfermedad de los pacientes con cáncer en comparación con voluntarios libres de tumor. Los niveles más altos MACC1 se determinaron en los individuos con metástasis (todos p & lt; 0,05). Es importante destacar que los altos niveles de MACC1 correlacionan con supervivencia desfavorable (P & lt; 0,0001). Combinando MACC1 con que circulan las transcripciones del gen de la metástasis S100A4, un objetivo transcripcional del /β-catenina-vía Wnt, mejora la predicción de la supervivencia para los pacientes recién diagnosticados de cáncer.
Conclusión /Importancia
Esta sangre ensayo basado en las transcripciones MACC1 de circulación, que se puede cuantificar de forma rutinaria, es aplicable clínicamente para el diagnóstico, pronóstico y seguimiento terapéutico de los pacientes de cáncer. Aquí se demuestra el valor diagnóstico y pronóstico de hacer circular transcripciones MACC1 en el plasma del paciente para la metástasis y la supervivencia. Desde MACC1 representa una diana prometedora para las terapias anti-metastásicos, transcripciones MACC1 circulantes puede llegar a ser un ideal de lectura para la monitorización de la respuesta terapéutica de las futuras intervenciones dirigidas a la metástasis inducida por MACC1 en pacientes con cáncer
Visto:. T Stein , Burock S, Herrmann P, Wendler I, Niederstrasser M, Wernecke KD, et al. (2012) Las transcripciones de circulación MACC1 en Cáncer Colorrectal plasma del paciente Predecir Metástasis y pronóstico. PLoS ONE 7 (11): e49249. doi: 10.1371 /journal.pone.0049249
Editor: Hassan Brim, Howard University, Estados Unidos de América
Recibido: 2 de mayo de 2012; Aceptado: 4 de octubre de 2012; Publicado: 14 Noviembre 2012
Derechos de Autor © 2012 Stein et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Estos autores no tienen el apoyo o la financiación para reportar
Conflicto de intereses:. Estados Unidos y el síndrome premenstrual son titulares de las patentes relativas a la determinación MACC1 (anteriormente 7a5 /prognostin) en tumores primarios. Stein T, H Schwabe, Walther W, Schlag PM. Verwendung des-neu identifizierten Gens 7a5 /Prognostin (MACC1) für Tumordiagnostik und Tumortherapie. 7a5 /Prognostin y el uso del mismo para la de diagnóstico y terapia de tumores. JP2006-519895 Patente: 13.5.2011. AU 2004259281 Patente: 12.5.2011. Patente de Estados Unidos 7.851.168 B2: 14.12.2010. La solicitud de patente CA 2526240: 2004. La solicitud de patente EP 008 053: 2004. La solicitud de patente DE 10332854.8: 2003. Estados Unidos, PH, SB, y el síndrome premenstrual son titulares de una solicitud de patente para el uso de metástasis transcripciones progresores S100A4 en los fluidos corporales de colorrectal y gástrico pacientes con cáncer. Stein T, Herrmann P, S Burock, Schlag PM. El uso de metástasis transcripciones progressor S100A4 en los fluidos corporales de pacientes con cáncer colorrectal y gástrico. aplicación 19.3.2010 Patente de Estados Unidos 61 /261.017:: PCT /EP2010 /001891 solicitud de patente 13.11.2009. Los autores confirman que esto no altera su adhesión a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
La metástasis es la causa más frecuente de fracaso del tratamiento y la muerte en el cáncer colorrectal. La detección temprana de tumores y metástasis es crucial para mejorar las estrategias de tratamiento y los resultados del paciente. Desarrollo de biomarcadores fiables y pruebas simples que son rutinariamente aplicable en la clínica para la detección, pronóstico y monitoreo de la terapia es de especial interés.
Recientemente hemos identificado el gen nuevo asociados a metástasis en el cáncer de colon 1 (MACC1) [ ,,,0],1] - [3]. MACC1 es un nuevo biomarcador pronóstico para la metástasis del cáncer de colon y libre de metástasis la supervivencia cuando se determina en los tumores primarios de los pacientes. Se encontraron niveles MACC1 en los tumores primarios a ser significativamente mayor en los cánceres que metacrónicamente desarrollaron metástasis a distancia en comparación con aquellos que no hacen metástasis en un 12-años de seguimiento. El valor predictivo de los biomarcadores de si un tumor se metástasis o no era 74% y 80%, respectivamente. La tasa de 5 años de supervivencia fue del 80% para los pacientes con baja MACC1, comparado con el 15% de los pacientes con una expresión de alto MACC1 en sus tumores primarios. MACC1 es un predictor de la metástasis del cáncer colorrectal independiente de la etapa del tumor, la edad, el sexo, la infiltración del tumor, estado nodal y la linfa invasión de vasos, y por lo tanto permite la identificación de sujetos con alto riesgo de metástasis en las primeras etapas [1]. Esto hace MACC1 un importante gen pronóstico en la práctica clínica. Además, hemos encontrado que MACC1 actúa un regulador clave de la HGF (factor de crecimiento de hepatocitos) /Met-vía, que es crucial en el cáncer colorrectal para la progresión tumoral y la formación de metástasis [1], [2], [4].
Varios grupos confirmaron mientras tanto una correlación de la expresión de alto MACC1 en el tumor a la progresión, metástasis, la supervivencia y la respuesta al tratamiento en el cáncer colorrectal (CRC) [5] - [9]. El papel de MACC1 como un biomarcador para la progresión del cáncer y la supervivencia fue mientras tanto también informó de otros cánceres sólidos, tales como gástrico [10], pulmón [11], [12], hepatocelular [13], [14] y el cáncer de ovario [15 ].
analiza
molecular en el tejido tumoral, por ejemplo, necesaria para pronóstico de la enfermedad en el contexto de la formación de metástasis y la supervivencia, se limitan a un número restringido de muestras de tejidos disponibles. Para superar esta limitación, el establecimiento de una basada en MACC1 análisis de sangre no invasiva para la detección precoz de los pacientes con cáncer de alto riesgo y para el seguimiento de la evolución de la enfermedad, así como de la respuesta al tratamiento tanto, es muy necesario.
Aquí , por primera vez, hemos desarrollado un ensayo no invasivo para los niveles de transcripción en MACC1 plasma. Se analizó el valor diagnóstico de los niveles MACC1 para la detección de tumores y metástasis en el colon y pacientes con cáncer rectal, y su valor pronóstico para la supervivencia global (supervivencia) de estos pacientes. Además, se evaluó el beneficio de combinar MACC1 con un gen de la metástasis más allá, S100A4, para mejorar la predicción del pronóstico de la enfermedad [16] - [18].
Materiales y Métodos
Objetivo
El MACC1 gen inductor de la metástasis es un fuerte biomarcador pronóstico para la metástasis del cáncer de colon y permite la identificación de los sujetos de alto riesgo en las primeras etapas, cuando se determina en los tumores primarios de los pacientes. Para superar la limitación de un número restringido de los análisis moleculares en el tejido tumoral, por lo que tuvo como objetivo el establecimiento de una basada en MACC1 análisis de sangre no invasiva para la detección precoz de los pacientes con cáncer de alto riesgo y para el seguimiento de la evolución de la enfermedad.
los participantes
Para las características de colon y cáncer rectal de pacientes, véanse los cuadros 1, 2, 3. los pacientes consecutivos con cáncer de colon o rectal que fueron atendidos en el hospital del cáncer Robert Rössle, Universidad Charité de Medicina de Berlín, durante el año 2006 hasta el 2007 para pacientes hospitalizados o ambulatorios y que dieron su consentimiento informado por escrito para participar en nuestro banco biológico del tumor se inscribieron.
los datos de los pacientes para la caracterización histopatológica del tumor (incluyendo la infiltración tumoral , el estado de los ganglios linfáticos, metástasis, la clasificación, la infiltración de los vasos linfáticos, vasos infiltración de sangre, tumor residual), para el tratamiento y la supervivencia estaban disponibles en el banco de tumores del Centro Integral del cáncer de la Charité. estadificación del tumor histológico se realizó por la patología de rutina. Los criterios de exclusión fueron otros tumores malignos durante la historia o el seguimiento. Se analizaron 312 muestras de sangre de dos puntos (n = 151) y rectal (n = 161) de los pacientes con cáncer (tablas 1, 2, 3).
Las muestras de sangre fueron tomadas en el día del diagnóstico de los pacientes con diagnóstico reciente un tumor primario sin o con metástasis sincrónicas o de pacientes que desarrollaron metástasis metacrónicamente después R0-resección del tumor primario. Excepción: Los pacientes con cáncer de recto localmente avanzado recién diagnosticado, que recibieron radiación de corta duración o de radio-quimioterapia neoadyuvante a largo plazo (n = 16). Aquí, se tomaron muestras de sangre después del tratamiento neoadyuvante del tumor primario. Para los pacientes que reciben la radiación de corta duración, el intervalo entre el final del tratamiento y la sangre toma fue de 3 a 6 días. No se encontró significativamente diferentes niveles de transcripción MACC1 entre el tratado (n = 16) y los pacientes con cáncer rectal no tratados (n = 23).
Las muestras de sangre de la cohorte de pacientes de seguimiento fueron tomadas exclusivamente durante el período de seguimiento (mediana de 975 y 1280 días después del diagnóstico primario; la mediana de 807 y 853 días de seguimiento después de tomar la sangre para el cáncer de colon y de recto, respectivamente)
los controles de plasma derivados de dos cohortes independientes. de voluntarios (n = 54). El reclutamiento de los voluntarios fue apoyada por Klaus Sperber, Practioner Médico, Berlín, y de Ursula Plöckinger, Charité Campus Virchow Klinikum, de Berlín. Todos los voluntarios deben ser, y sin antecedentes de enfermedades oncológicas libres de tumor. No se encontró significativamente diferentes niveles MACC1 en cuanto a género, edad, o entre las dos cohortes.
Los pacientes recientemente diagnosticados con cáncer colorrectal con un tumor primario con o sin metástasis sincrónicas se agruparon debido a su examen cronológico en una test-set (n = 36) y una validación-set (n = 35) para la determinación del valor diagnóstico de las transcripciones que circulan MACC1 (Tabla 4).
Preparación de plasma
en primer lugar, se examinaron las condiciones óptimas para la toma de sangre, el almacenamiento y separación de plasma. Después de la toma de sangre de voluntarios sanos (n = 12), EDTA-sangre se mantuvo a temperatura ambiente o a 4 ° C. La separación del plasma se realiza ya sea inmediatamente o 7, 24, 48, y 72 horas después de la toma de sangre (10 análisis por voluntario). Se aisló el ARN y MACC1 específica cuantitativa en tiempo real RT-PCR se realizó por duplicado (Fig. 1A). los niveles de transcripción MACC1 sirvieron de lectura. No se encontraron alteraciones de los niveles de MACC1 cuando la separación de plasma se llevó a cabo durante las primeras 24 horas (ya sea refrigerados o mantenidos a temperatura ambiente). Basándose en estos hallazgos, se separó el plasma de EDTA-sangre enfriada a la misma dentro de los 7 días horas después de la toma de sangre. Procedimiento para la separación de plasma se describió anteriormente [18]. muestras ciegas, ni tampoco de colon cáncer de recto, ni enfermedad en estadio se dio a conocer durante el análisis, se almacenaron a -80 ° C.
A. condiciones de separación de plasma para la determinación de las transcripciones MACC1 circulantes. La separación del plasma de las muestras de los voluntarios libres de tumor (n = 12) se realiza inmediatamente, 7, 24, 48, y 72 horas después de tomar la sangre, ya sea a partir de muestras de sangre se mantuvo a 4 ° C o a temperatura ambiente. Posteriormente, el plasma se genera dentro de los primeros 7 horas de la sangre 4 ° C-enfriado. B. MACC1 transcripciones en plasma de voluntarios libres de tumor (n = 54). No hay diferencia en los niveles de transcripción MACC1 se encontraron en dos cohortes analizadas independientemente de voluntarios libres de tumor (n = 34 y n = 20, respectivamente). transcripciones C. MACC1 en plasma de todos los pacientes con cáncer colorrectal (n = 312). Todas las cohortes de pacientes que llevan colorrectal, de colon (n = 151) o rectal (n = 161), el cáncer expresaron niveles de transcripción MACC1 significativamente más altos que los voluntarios libres de tumor (
P Hotel & lt; 0,001 para todas las comparaciones).
ARN y cuantitativa en tiempo real RT-PCR
El aislamiento de RNA total se realizaron como se describe anteriormente [18]. Cuantitativa en tiempo real RT-PCR se realizó a 30 seg 95 ° C, 45 × (10 seg 95 ° C, 10 seg 62 ° C, 10 s 72 ° C), la fusión de la curva de 40 ° C a 95 ° C, por utilizando el LightCycler (kit de ADN Maestro sondas de hibridación, Roche Diagnostics) como se describe anteriormente [1]. Los siguientes cebadores y sondas se utilizan la amplificación de un producto de 136 pb MACC1-PCR específica: cebador directo 5'-TTCTTTTGATTCCTCCGGTGA-3 ', el cebador inverso 5'-ACTCTGATGGGCATGTGCTG-3', FITC-sonda 5'-GCAGACTTCCTCAAGAAATTCTGGAAGATCTA-3 ', LCRed640- sonda 5'-AGTGTTTCAGAACTTCTGGACATTTTAGACGA-3 '(síntesis de cebadores y sondas: BioTeZ y TIB MOLBIOL, Berlín, Alemania). El cDNA calibrador se empleó en diluciones en serie de forma simultánea en cada ejecución, derivado de las líneas celulares SW620. Autentificación de la línea celular se realizó mediante la determinación del genotipo repeticiones cortas en tándem (STR) (DSMZ Braunschweig, Alemania). STR genotipo fue consistente con el genotipo publicado para esta línea celular (ATCC, CCL-227). -S100A4 específica cuantitativa en tiempo real RT-PCR se realizó como se describe anteriormente [18]. la expresión del ARNm de una muestra de sangre se da como porcentaje de la expresión del ARNm de un calibrador de muestra definido, que se estableció el 100%. Cada muestra se realizó por duplicado, los medios se representan.
Ética
Todas las muestras de sangre de pacientes y voluntarios libres de tumor se obtuvieron con consentimiento informado por escrito de conformidad con la Conferencia Internacional sobre Armonización y con la aprobación del IRB local.
Métodos estadísticos
las diferencias entre los grupos en cuanto a los niveles de transcripción MACC1 en el plasma se ensayaron mediante el uso de pruebas no paramétricas de Wilcoxon-Mann-Whitney (depende de la distribución de la normalidad): voluntarios libres de tumor en comparación con los pacientes con tumores primarios sin y con metástasis sincrónicas, a los pacientes con metástasis metacrónicas, y los pacientes durante el seguimiento; los pacientes con tumores en comparación con aquellos con tumores y metástasis. En el caso de muestras pequeñas, mayores diferencias en los tamaños de las muestras, grupos grandes, pero no balanceadas, conjuntos de datos que contienen los lazos, o la escasez de datos, las pruebas se llevaron a cabo en una versión exacta. Se consideraron los
P Hotel & lt; 0,05 para ser significativa. Todos los cálculos numéricos se realizaron con SPSS, versión 18.
Para definir el valor diagnóstico de las transcripciones MACC1 en el plasma, la sensibilidad y especificidad de circulación se calcularon con una tabla de doble entrada para el cáncer colorrectal (de prueba y de validación del conjunto), de colon, cáncer de recto y pacientes, que fueron recientemente diagnosticados con un tumor primario sin o con metástasis sincrónicas en comparación con las muestras de sangre de 54 voluntarios libres de tumor. De acuerdo con el examen cronológico y los pacientes que toman sangre iniciales fueron agrupados en un test-set y validación en conjunto. Comenzamos con una prueba de conjunto de pacientes con CRC recién diagnosticados (n = 36), determinamos el valor de corte óptimo de MACC1 (sensibilidad 75%, especificidad 76%), y aplicamos este valor de corte para la validación del conjunto de CRC pacientes (n = 35). La sensibilidad y especificidad fueron del 77% y 76%, respectivamente. Cuando se combinan todos los pacientes recién diagnosticados de CRC, la sensibilidad y la especificidad fueron del 76%. Al analizar colon y pacientes con cáncer rectal por separado, la sensibilidad fue del 77% para el cáncer de colon y el 76% para el cáncer rectal. La especificidad fue del 89% para el cáncer de colon y el 76% para el cáncer de recto, respectivamente.
Para el análisis de supervivencia de los recién diagnosticados y de todos los pacientes con CRC, se utilizaron las curvas de Kaplan-Meier en combinación con la prueba de log-rank. Aquellos pacientes con CRC se incluyeron en este análisis, donde ambos marcadores, MACC1 y S100A4, se pudo determinar (n = 294). El valor de corte de MACC1 y el valor de corte de S100A4 eran la mediana de los grupos investigados (diagnóstico primario o todos los pacientes), respectivamente. Los cálculos se realizaron con el programa SPSS, versión 18.
Resultados
La cuantificación de circulación Transcripciones MACC1 en el plasma humano
condiciones óptimas identificadas inicialmente para el procesamiento de plasma y MACC1 cuantificación transcripción después de la sangre tomando. La separación del plasma y los análisis MACC1 posteriores se realizaron inmediatamente o 7, 24, 48, y 72 horas después de la sangre tomando de voluntarios libres de tumor (n = 12; 10 alícuotas por voluntario), una extensión de 4 ° C-enfría o se deja a temperatura ambiente ( Fig. 1A). Aumento de los niveles MACC1 se midieron debido a la hemólisis después de 48 y 72 horas después de la extracción de sangre. Para determinar los niveles basales de hacer circular transcripciones MACC1 en voluntarios libres de tumor y los pacientes con cáncer colorrectal, que posteriormente separados de plasma a partir de 4 ° muestras de sangre enfriados-C dentro de los primeros 7 horas después de la toma de sangre.
Las transcripciones de circulación en MACC1 plasma de voluntarios libres de tumores
Se analizaron los niveles basales de MACC1 voluntarios libres de tumor en dos cohortes independientes (n = 34 yn = 20, respectivamente; Fig. 1B). transcripciones MACC1 se detectaron en todas las muestras, sin diferencias significativas entre las dos cohortes. Todos los voluntarios libres de tumor se combinaron para su posterior análisis (mediana de 0.224 MACC1 la expresión del ARNm /calibrador%).
Transcripciones circulante en plasma MACC1 Discriminar voluntarios libres de tumores y el cáncer colorrectal Los pacientes
A continuación, analizaron los niveles en el plasma de MACC1 de colon (n = 151) y rectal (n = 161) de los pacientes con cáncer (características de los pacientes: Cuadros 1, 2, 3). Para evaluar el valor diagnóstico de circular transcripciones MACC1 en el plasma, se compararon los nuevos diagnósticos de los pacientes con CCR con un tumor primario con o sin metástasis sincrónicas (n = 71) con voluntarios libres de tumor (n = 54) y se calculó la sensibilidad y especificidad con un cuádruple mesa. Comenzamos con una prueba de conjunto de los pacientes recién diagnosticados de CRC (n = 36; sensibilidad 75%, especificidad 76%), y aplicamos el valor de corte óptimo calculado para la validación del conjunto de pacientes con CRC recién diagnosticados (n = 35; sensibilidad 77%, especificidad 76%). Cuando se combinan todos los pacientes recién diagnosticados de CRC, la sensibilidad y la especificidad fueron del 76% (Tabla 4). Al analizar los pacientes de cáncer rectal de colon y por separado, las sensibilidades fueron 77% y 76%, y las especificidades fueron 89% y 76%, respectivamente. Por lo tanto, los niveles de transcripción en el plasma MACC1 apoya la identificación de las personas que llevan cáncer de colon y de recto.
Hemos detectado transcripciones MACC1 en el plasma de todos los pacientes con cáncer. Se encontraron niveles significativamente más altos en MACC1 de colon, rectal, colorrectal y pacientes con cáncer (combinado) en comparación con los individuos libres de tumor (todos los
P Hotel & lt; 0,001; Fig. 1C). No se observaron variaciones significativas de los niveles MACC1 debido a la edad, el sexo, o entre los estadios tumorales I, II y III.
High niveles circulantes MACC1 Transcripción en el plasma de los pacientes de cáncer colorrectal metastático
cáncer
Para evaluar la pertinencia de circulación transcripciones MACC1 en plasma con respecto a la formación de metástasis, los pacientes se clasificaron de acuerdo a la etapa de la enfermedad: los pacientes con un tumor primario sin metástasis sincrónica (etapas I-III; n = 51 para colorrectal, n = 12 para colon, y n = 39 para pacientes con cáncer rectal); pacientes con un tumor primario y la metástasis síncrono (etapa IV; n = 20 para colorrectal, n = 10 para colon, y n = 10 para pacientes con cáncer rectal); y las personas con metástasis metacrónico después de la resección R0-del tumor primario (n = 11 para colorrectal, n = 4 para el colon, y n = 7 para los pacientes con cáncer rectal) (Tablas 1, 2, 3). La sangre fue tomada en el día del diagnóstico. Además, también se incluyeron seguimiento de los pacientes (n = 230 para colorrectal, n = 125 para los de colon, y n = 105 para los pacientes con cáncer rectal; los cuadros 1, 2, 3). niveles MACC1 fueron significativamente mayores en cada etapa de la enfermedad de cáncer de colon y rectal en comparación con los voluntarios libres de tumor (Fig. 2A-C). Notablemente, se detectaron claramente aumento de los niveles MACC1 en pacientes recién diagnosticados de cáncer con metástasis sincrónica (estadio IV), en comparación con los pacientes de cáncer sin metástasis distantes (etapas I-III): para colorrectal (Fig. 2A), colon (Fig. 2B), y el cáncer de recto (Fig. 2C), las medianas 0.937, 2.249 y 0.829 expresión MACC1 ARNm /% calibrador en pacientes metástasis, en comparación con 0,61, 0,78 y 0,559 MACC1 la expresión del ARNm /% calibrador en pacientes sin metástasis a distancia (
P
= 0,006,
P = .176
, y
P = 0,041
colorrectal, de colon y pacientes con cáncer rectal, respectivamente). Por lo tanto, la determinación cuantitativa de transcritos de MACC1 en la sangre del paciente es de valor diagnóstico con respecto a la metástasis.
A, B, C. Todos colorrectal (A, n = 312), colon (B, n = 151), y rectal (C, n = 161) con cáncer de pacientes sub-cohortes mostraron significativamente mayor circulación de los niveles de transcripción MACC1 de voluntarios libres de tumor (n = 54). MACC1 niveles más altos también se encontraron resultados para colorrectal (
P = .006
; A) y rectal (
P = 0,041
; C) pacientes con cáncer con metástasis sincrónicas (n = 20 yn = 10, respectivamente) en comparación con los pacientes sin metástasis a distancia (n = 51 y n = 39, respectivamente). El análisis gráfico de caja, en base a cuantitativa en tiempo real RT-PCR.
High niveles circulantes MACC1 Transcripción en el plasma de pacientes con cáncer colorrectal se asocia con la supervivencia más corta
A continuación, se evaluó la impacto pronóstico de hacer circular transcripciones MACC1 en el plasma. Comenzamos el análisis de los niveles circulantes de MACC1 con respecto a la supervivencia de pacientes con CRC recién diagnosticados con un tumor primario con o sin metástasis sincrónicas (muestras de sangre fueron tomadas en el día del diagnóstico) (Fig. 3A). El valor de corte utilizado fue la mediana de los niveles medidos MACC1 en esta cohorte de pacientes (0.670 expresión de ARNm MACC1 /calibrador%). De acuerdo a este punto de corte, los pacientes fueron clasificados como expressors bajas o altas MACC1. Curiosamente, los pacientes recién diagnosticados con niveles bajos MACC1 (& lt; de corte) demostraron un tiempo significativamente mayor supervivencia que los pacientes con altos niveles de MACC1 (& gt; de corte) (
P = .003
; fig. 3A). Por lo tanto, los niveles circulantes de transcripción MACC1 en el plasma cuando se determina en el día del diagnóstico, son de valor pronóstico para la supervivencia de los pacientes recién diagnosticados.
A, B. Kaplan-Meier análisis de diagnóstico reciente (A, n = 49) y los (B, n = 294) pacientes con CRC, con base en MACC1 sola (a, bajo MACC1 n n = 24, alta MACC1 = 25; B, bajo MACC1 n = 147, alta MACC1 n = 147). los pacientes recién diagnosticados de CRC (A), así como todos los pacientes con CRC (B) con los niveles de transcripción MACC1 circulantes elevados presentaron una supervivencia más corta en comparación con los pacientes que demuestra bajos niveles MACC1 (
P = .003
y
P
& lt; 0,0001, respectivamente). C, D. Análisis de Kaplan-Meier para los recién diagnosticada (C, n = 49) y los (D, n = 294) pacientes con CRC, a partir de una combinación de MACC1 y S100A4. los pacientes recién diagnosticados de CRC (C) y todos los pacientes con CRC (D) se clasificaron en grupos de bajos expresores de ambos genes (n = 13 y n = 85, respectivamente), de los pacientes con altos niveles de S100A4 (n = 25 y n = 147 , respectivamente), de pacientes con niveles MACC1 altas (n = 25 y n = 147, respectivamente), o con alta expresión de ambos biomarcadores (n = 14 y n = 85, respectivamente). Para los pacientes recién diagnosticados (C), la supervivencia se reduce con el aumento de los niveles circulantes de las transcripciones de S100A4, de MACC1, o de ambos. inducción de la expresión de cualquiera MACC1 o S100A4 o de ambos biomarcadores correlacionada con la supervivencia de los pacientes reducida.
A continuación, hemos querido analizar si un impacto pronóstico de transcripciones MACC1 es válido para la cohorte de todos los pacientes con CRC, incluyendo los pacientes de seguimiento. El valor de corte utilizado fue la mediana de los niveles MACC1 medidos de todos los pacientes con CRC (0,518 expresión de ARNm MACC1 /calibrador%). Sobre la base de esta línea de corte, todos los pacientes con CRC se agruparon como expressors bajas o altas MACC1. Sorprendentemente, hemos podido confirmar nuestro hallazgo del grupo de pacientes recién diagnosticados también para todos los pacientes con CRC analizado: los pacientes con niveles bajos MACC1 (& lt; cut-off) mostró un tiempo de supervivencia significativamente más que los pacientes con altos niveles de MACC1 (& gt; de corte apagado) (
P Hotel & lt; 0,0001; Fig. 3B). Por lo tanto, los niveles circulantes de transcripciones MACC1 en el plasma de pacientes de CRC son de valor pronóstico con respecto a la supervivencia de los pacientes.
Combinación de circulación MACC1 y S100A4 Transcripción niveles en plasma mejora la supervivencia Predicción para Pacientes con Cáncer Colorrectal
para mejorar aún más la predicción de la supervivencia, hemos añadido el gen S100A4 metástasis, un objetivo de la /β-catenina-vía Wnt, a este análisis MACC1. Habíamos elegido estos biomarcadores metástasis de combinación, ya que se dirigen a las vías de señalización más relevantes en la progresión del cáncer colorrectal y metástasis: MACC1 - un regulador clave de la HGF /Met vía de señalización, y S100A4- un gen diana transcripcional de la /β-catenina Wnt vía de señalización. Hasta el momento, ninguna regulación transversal de estos dos genes asociados a metástasis - es conocido
Por otra parte, se informó anteriormente el valor diagnóstico y pronóstico de las transcripciones de S100A4 en el plasma [18] - MACC1 y S100A4.. Aquí, los individuos con niveles plasmáticos bajos S100A4 también mostraron una mayor supervivencia (Fig. S1 A, B).
En primer lugar, abordó la cuestión de si la combinación de ambos biomarcadores, transcripciones de MACC1 y de S100A4 circulante, podría mejorar el valor pronóstico de MACC1 solo en la cohorte de pacientes con CRC recién diagnosticados. Los valores de corte utilizados fueron la mediana de los niveles MACC1 medidos en este cohorte de pacientes (0,670 expresión MACC1 mRNA /% calibrador), así como la mediana de los niveles de S100A4 medidos en este cohorte de pacientes (0,435 expresión S100A4 ARNm /% calibrador) . De acuerdo a estos valores de corte, los pacientes fueron clasificados como bajos expressors de ambos genes, como los altos expressors de S100A4, como los altos expressors de MACC1, o tan alto expressors de ambos genes. Los pacientes que mostraron bajos niveles circulantes de MACC1 y de S100A4, tenían los tiempos de supervivencia más largos. a continuación, se observó reducción de la supervivencia para los pacientes con altos niveles de S100A4, seguidos por los pacientes con altos niveles de MACC1. Se encontraron más cortos tiempos de supervivencia para los pacientes con ambos marcadores biológicos altamente expresados (Fig. 3C). Por lo tanto, para los pacientes recién diagnosticados, la combinación de alta MACC1 y los altos niveles S100A4 mejora en la predicción de supervivencia, en comparación con los niveles altos MACC1 solos.
A continuación, evaluamos esta MACC1 combinatoria y S100A4 enfoque con respecto a la supervivencia de todos los pacientes con CRC , incluyendo los pacientes de seguimiento. Los valores de corte utilizados fueron la mediana de los niveles MACC1 medidos para todos los pacientes con CRC (0,518 expresión MACC1 ARNm /% calibrador), así como la mediana de los niveles S100A4 medidos para todos los pacientes con CRC (0,421 expresión S100A4 ARNm /% calibrador) . De acuerdo a estos valores de corte, todos los pacientes con CCR fueron clasificados como bajos expressors de ambos genes, como los altos expressors de S100A4, como los altos expressors de MACC1, o tan alto expressors de ambos genes. Como se observa para los pacientes recién diagnosticados, también todos los pacientes con CRC que mostraron bajos niveles circulantes de MACC1 y de S100A4, tenía los tiempos de supervivencia más largos. inducción de la expresión de cualquiera MACC1 o S100A4 o de ambos biomarcadores correlacionados a los pacientes reducción de la supervivencia (Fig. 3D).
Además, también comparó la supervivencia de los pacientes con bajos niveles de MACC1 y de S100A4 o con sólo una marcador (ya sea MACC1 o S100A4) aumentaron con la supervivencia de los pacientes que mostraron tanto MACC1 y S100A4 elevada. Hemos encontrado una supervivencia significativamente más corta para los pacientes con altos niveles plasmáticos de ambos biomarcadores. Esto se observó para la cohorte de pacientes con diagnóstico reciente (
P Hotel & lt; 0,0001; Fig. S2A), así como para todos los pacientes con CRC analizados (
P = 0,001
; Fig. S2B ).
Discusión
Aquí mostramos el desarrollo de la primera base de ensayo para la sangre MACC1 gen metástasis inductor, que es un biomarcador de pronóstico para la metástasis del cáncer de colon, así como para la progresión del tumor y la supervivencia en una variedad de cánceres sólidos. Este ensayo para transcripciones MACC1 de circulación, que se puede cuantificar de forma rutinaria, es aplicable clínicamente para el diagnóstico, pronóstico y seguimiento terapéutico de los pacientes de cáncer. Los niveles de transcripciones MACC1 circulantes son significativamente más altos en pacientes con cáncer en comparación con voluntarios libres de tumor. Sorprendentemente, más altos niveles de transcripciones que circulan MACC1 se determinaron en los individuos con metástasis, lo que demuestra el valor diagnóstico de circulación transcripciones MACC1 en el plasma del paciente con respecto a la formación de metástasis. Más importante aún, los altos niveles de MACC1 - determinaron prospectivamente -. Correlaciona con la supervivencia desfavorable de los pacientes que subrayan el valor pronóstico de las transcripciones MACC1 circula
La detección de ARNm libre de células en la sangre como "biopsia líquida" permite la monitorización en tiempo real del progreso de la enfermedad, el pronóstico y respuesta terapéutica [19]. Numerosos estudios describen detección de la transcripción de ARN circulante libre de células en el plasma y el suero de pacientes que sufren de una variedad de cánceres sólidos, incluyendo la tiroides, pulmón, gástrico, de mama y el cáncer de cuello uterino, y su uso para el pronóstico del curso de la enfermedad [20] - [29]. La estabilidad de ARN circulante libre de células está garantizada por exosomas (micropartículas, microvesículas, multivesicles) que lo protegen de la degradación [30], [31]. Particularmente para la circulación de ARN de plasma de pacientes con cáncer de colon se informa de que este ARN libre de células se limita en las estructuras de vesículas como enriquecidos en ARNm [32]. Varias transcripciones que circulan ya se han notificado a ser útil para el diagnóstico y el pronóstico para el cáncer colorrectal; p.ej. hTERT [33], β-catenina [34], la timidilato sintasa [35], y LISCH7 [36]. Particularmente CEA [37], [38], también en combinación con marcadores tales como CK19, CK20, hTERT, TIMP-1, miR141 [39] - [41], es reconocido como una ayuda potencial en la detección temprana del CRC, como marcador pronóstico de recurrencia, y también como biomarcador predictivo con respecto a la respuesta al tratamiento. Prueba de la combinación de ambos, CEA y MACC1, podría superar estas características.
Nuestros nuevos hallazgos de las transcripciones que circula en el plasma MACC1 de los pacientes con cáncer colorrectal para el diagnóstico y la predicción de la supervivencia están en línea con los que nos informa de acuerdo con anterioridad en la cuantificación de la expresión de ARNm en tejidos de cáncer colorrectal con respecto al pronóstico de la enfermedad [1]. Posteriormente, varios grupos validaron el enlace de la expresión de alto MACC1 en tejido de cáncer colorrectal para la enfermedad avanzada (por ejemplo, [5], [7], [8]).