Extracto
Antecedentes
A pesar de que los andrógenos se agotan en el cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC), metástasis todavía expresan receptores de andrógenos nucleares castración (AR) y los genes regulados de andrógenos. Recientemente hemos informado de que C-terminal truncado variantes de empalme AR constitutivamente activos contribuyen al desarrollo CRPC. Dado que los anticuerpos específicos que detectan todas las variantes truncadas AR C-terminales no están disponibles, nuestro objetivo fue desarrollar un método para evaluar la prevalencia y la función de las variantes de AR en el cáncer de próstata (CaP).
Metodología /Principales conclusiones
Uso de 2 anticuerpos contra diferentes regiones de la proteína AR (N- o C-terminal), puso de manifiesto la existencia de éxito variante AR en el xenoinjerto LuCaP 86.2. Para evaluar la prevalencia de variantes AR en el tejido PCa humana, se utilizó este método en microarrays de tejidos incluyendo 50 CaP primaria y 162 CRPC tejidos metastásicos. RT-PCR se utilizó para confirmar variantes AR. Se observó una disminución significativa en la tinción AR C-terminal nuclear en CRPC pero no hubo diferencia entre N- y C-terminal de tinción nuclear AR en el CaP primario. La expresión de la AR proteínas reguladas PSA y PSMA fueron ligeramente afectado por la disminución de la tinción C-terminal en las muestras CRPC. Estos datos sugieren que hay un aumento en la prevalencia de variantes AR en CRPC en base a nuestra capacidad para diferenciar la expresión AR nuclear usando N- y anticuerpos AR C-terminales. Estos resultados fueron validados mediante RT-PCR. Es importante destacar que, la pérdida de inmunorreactividad C-terminal y la identificación de variantes de AR fueron diferentes dependiendo del sitio de la metástasis en el mismo paciente.
Conclusiones
Hemos desarrollado con éxito un enfoque novedoso que era inmunohistoquímica utilizado para determinar la prevalencia de AR variantes en un gran número de CaP primario y metastásico CRPC. Nuestros resultados mostraron una instantánea de alta frecuencia global de las variantes de corte y empalme AR C-terminal truncado y el sitio de la pérdida de AR específico en CRPC, lo que podría tener utilidad en la estratificación de los pacientes para terapias dirigidas AR
Visto:. Zhang X, C Morrissey , Sun S, M Ketchandji, Nelson PS, True LD, et al. (2011) Las variantes del receptor de andrógenos se producen con frecuencia en la castración cáncer de próstata resistente a la metástasis. PLoS ONE 6 (11): e27970. doi: 10.1371 /journal.pone.0027970
Editor: Irina Agoulnik, Universidad Internacional de la Florida, Estados Unidos de América
Recibido: 17 Junio, 2011; Aceptado: 29 de octubre de 2011; Publicado: 17 Noviembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Zhang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación se basa en el trabajo apoyado en parte por una PO1 Institutos nacionales de Salud de subvención (PO1CA085859), la concesión del noroeste del Pacífico del cáncer de próstata SPORE (P50CA097186), la Prostate Cancer Foundation y la Fundación Richard M. Lucas. CM recibió un premio de desarrollo de la carrera de la concesión del Noroeste del Pacífico del cáncer de próstata SPORE (P50CA097186). Esta investigación es el resultado del trabajo con el apoyo de los recursos del Sistema de Salud VA Puget Sound, Seattle, Washington. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
cáncer de próstata metastásico (CP) que se repite después de la terapia de castración o de privación de andrógenos (ADT), denomina cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC), augura un mal resultado con alta letalidad. Aunque los niveles circulantes de andrógenos se agotan en CRPC, la progresión del tumor es a menudo concomitante con niveles elevados de receptor de andrógenos (AR), la activación de la AR, y la expresión de genes regulados por la AR. Sin embargo, un aumento en la expresión de AR por sí mismo no es generalmente suficiente para enganchar el programa AR transcripcional [1]. Varios mecanismos han demostrado que conducen a la transactivación de AR y activar el programa de AR después de la castración. Estos incluyen la persistencia de los andrógenos intratumorales, la síntesis de andrógenos ectópico por el tumor o bien de los andrógenos suprarrenales o intratumoral
de novo
síntesis, y el aumento de transporte de andrógenos en el tumor por las proteínas de transportador de aniones orgánicos de portador de soluto [2] - [6] . Varias citoquinas y las vías del factor de crecimiento han demostrado ser capaces de activar la AR a través de mecanismos de unión directos o cross-talk [7] - [13]. Las alteraciones en la AR co-reguladores también pueden modular la actividad de AR, cuando se reducen los niveles de andrógenos [14] - [18]. Funcionalmente, cada uno de estos mecanismos de promoción de la activación AR en CRPC requiere la región carboxi-terminal de la proteína madura que contiene el dominio de unión a ligando (LBD)
.
Además de los mecanismos que conducen a la activación de AR en CRPC que requieren ligando, la evidencia reciente apunta a la existencia de formas de corte y empalme alternativo de ARNm que codifican receptores AR carentes de la LBD, pero conservando la capacidad de participar maquinaria transcripcional y promover la regulación de la conocida --- --- nueva y potencialmente conjuntos de objetivos transcripcional [19] - [26]. No sólo son estos AR C-terminal truncado variantes constitutivamente activo, pero su estructura predice una resistencia general a la terapéutica como AR-antagonistas que requieren una vinculación a la LBD para la actividad. Hasta la fecha, nosotros y otros han identificado tres variantes de corte y empalme AR en muestras de tejido humano [22], [25] - [27]. AR-V1 codifica una variante de empalme formado por los exones 1-3 y que terminan en un exón críptico (CE1), AR-V7 (también llamado AR3) codifica una proteína con los exones 1-3 y un terminal de exón críptico (CE3), y AR
v567es codifica una proteína compuesta de exones 1-4, y debido a un marco de cambio debido a la pérdida de los exones 5-7, el exón 8 tiene un codón de parada generada después de los primeros 10 aminoácidos resultantes en una exon8 acortado. [22], [25] - [27]. variantes de empalme AR adicional se han detectado en las líneas celulares de CaP humanos [21], [24], [26] - [28]
Varios estudios evaluando la expresión de formas AR empalme en un pequeño número de cánceres de próstata. sugieren que las variantes AR se detectan más fácilmente en comparación con CRPC cánceres hormono-ingenuo, y pueden surgir debido a la presión selectiva de AR terapia dirigida [22], [25], [26]. Un estudio reciente utilizó QRT-PCR para identificar la variante transcripciones AR en 40 metástasis en los huesos, de los cuales 30 eran de CRPC, y se encontró una asociación entre la expresión de variantes AR y la supervivencia [29]. La determinación de la prevalencia de AR variantes en diferentes estados clínicos de cáncer de próstata ha sido puesta en duda por los requisitos para muestras bien conservadas congeladas de tejido para análisis basados en la transcripción, y la falta de anticuerpos capaces de detectar específicamente la mayoría de las proteínas variantes AR. Para superar esta limitación, hemos tratado de tomar ventaja del hecho de que el nuevo AR carboxi-terminales codificada por las formas de ayuste alternativo del ARNm de AR no puede ser reconocido por anticuerpos dirigidos contra el C-terminal normal de la AR de longitud completa (AR
FL). La hipótesis de que esta característica de AR variantes proporcionó una oportunidad para identificar variantes de la proteína AR en tejidos fijados con formalina mediante la comparación de la tinción diferencial de anticuerpos que reconocen ya sea N- o C-terminal de la AR. Por lo tanto, en el presente estudio, hemos utilizado anticuerpos contra el extremo N- o C-terminal de la proteína AR para interrogar a un gran número de tejido benigno de la próstata, la hormona principal CaP naïve y una serie de CRPC metastásico para determinar la prevalencia de la C-terminal AR variantes truncadas.
Materiales y Métodos
Reactivos
los anticuerpos utilizados en este estudio y las condiciones de trabajo se enumeran en la Tabla 1.
tejido
primaria y tejidos Humanos CaP metastásico se obtuvieron como parte del programa de PCA investigación y Donantes Universidad de Washington Medical Center cáncer de próstata programa autopsia rápida, que es aprobado por la Universidad de Washington Junta de Revisión Institucional. La Junta Institucional de la Universidad de Washington Medical Center Revisión aprobó todos los procedimientos en seres humanos, y todos los sujetos firmaron el consentimiento informado por escrito. microarrays de tejidos humanos (TMA) se compone de 42 pacientes de Donantes de cáncer de próstata Programa autopsia rápida (incluyendo 65 metástasis de tejidos blandos y 120 metástasis óseas) [30], 55 pacientes sometidos a prostatectomía radical (incluyendo 28 de la próstata normal, 24 de próstata hiperplásica, y 50 primario de próstata se utilizaron tejidos de cáncer). El LuCaP de xenoinjerto de cáncer de próstata 86.2 es un adenocarcinoma que no responde a la castración y se deriva de una metástasis de vejiga PCa humana. El xenotrasplante de cáncer de próstata LuCaP 35 es un adenocarcinoma que responde a la castración y se deriva de una metástasis de los ganglios linfáticos CaP. Estos xenoinjertos no crecen como líneas celulares, por lo que se mantienen por el paso en serie en ratones SCID. El LuCaP 86,2 xenoinjerto expresa una variante conocida AR C-terminal truncado AR
v567es que es constitutivamente activa. El xenotrasplante LuCaP 35 sólo expresa el tipo de ancho AR [25]. LuCaP fresca 35 y 86,2 tejidos de xenoinjerto se utilizaron para el análisis occidental. Veintidós tejidos metastásicos CRPC de pacientes autopsia rápidos correspondientes a los tejidos en el TMA humana habían sido instantánea congelada en nitrógeno líquido después de la resección y se almacenan a -80 ° C hasta su uso. Los datos clínicos relacionados con los 42 pacientes de la autopsia se muestran en la Tabla 2.
PCR con transcripción inversa (RT-PCR) y RT-PCR cuantitativa (QRT-PCR)
tejido total se aisló ARN a partir de tejido fresco picado utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Dos microgramos de RNA total se digirieron con ADNasa I, y a transcripción inversa utilizando Superíndice primer capítulo de síntesis del sistema (Invitrogen). PCR se realizó usando AmpliTaq Gold® PCR Master Mix (Applied Biosystems). Los productos de PCR se corrieron en gel de agarosa al 2% y cuadros de imagen fueron tomadas usando el sistema de formación de imágenes Pro AlphaDigiDoc a Alpha Innotech (San Leandro, CA). QRT-PCR reacciones se realizaron utilizando un detector de secuencia de Applied Biosystems 7900 con 5 ng de cDNA, 200 nM de cada primer par y potencia SYBR Green PCR Master Mix o TaqMan PCR Universal Master Mix de Applied Biosystems.
La expresión génica se midieron los niveles de cuantificación relativa entre las muestras de ARN, y se pliegan los cambios de expresión se determinaron por el método 2-ΔΔCT [31]. Todos los QRT-PCR experimentos se realizaron por triplicado, y la RPL13A limpieza de genes se utilizó como control endógeno
.
El primer secuencias se enumeran en la Tabla 3.
Cultivo celular y la estimulación
VCAP células que expresaban tanto AR
FL y AR
v567es variante se hicieron crecer hasta 80% de confluencia en placas de 30 mm en medio RPMI 1640 con suero al 5%, y luego se cambiaron a medio RPMI-1640 con 5% de carbón despojado de suero durante 24 h. Dihidrotestosterona (DHT) 10
-9 M, MDV-3100 50 nM, o MDV-3100, más DHT se añadieron a los cultivos. Después de 24 h, el ARN total fue recogido de pocillos duplicados para QRT-PCR para la detección de AR
FL, AR
v567es y transcripciones AR-V7. El experimento se repitió 6 veces con triplicados cada vez, y los resultados QRT-PCR se normalizaron a grupo de tratamiento DHT.
Western Blotting
tejido fresco se homogeneizó y se lisaron con tampón de lisis frío (50 HEPES, 150 mM NaCl, 1,5 mM de MgCl
2, EGTA 1 mM, 1% de Triton X-100) que contiene Halt ™ inhibidores de la proteasa Cocktail y fosfatasa inhibidor (Thermoscientific). lisados completos se separaron en SDS-PAGE, se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa, bloqueada en 5% de leche-PBS-Tween y se sondaron con noche respectivo a 4 ° C. Las membranas se incubaron con una peroxidasa de rábano picante conjugada con anticuerpo secundario (Cell Signaling), y se revelaron con ECL (Pharmacia Biotech). Las membranas fueron despojadas por 30 min en Stripping Buffer (Thermoscientific) y volvieron a sondar con el anticuerpo anti-β-actina como control de carga (Sigma-Aldrich). experimentos independientes validaron que este procedimiento de extracción no condujo a una pérdida de la señal.
La inmunohistoquímica
secciones de tejido incluidas en parafina fijadas con formalina (5μm) se deparaffinized y rehidratada. La recuperación del antígeno se llevó a cabo con tampón citrato 10 mM (pH 6,0) en una olla a presión (20 psi durante 10 min). peróxido endógeno y biotina /avidina se bloqueó durante 15 min con los agentes respectivos (Vector Laboratories). Después de incubar con suero normal de cabra-caballo-pollo 5% a temperatura ambiente durante 1 h, las secciones se incubaron con anticuerpos primarios (Tabla 1) a 4 ° C durante la noche seguido por anticuerpos secundarios biotinilados y reactivo Sabc (Vector Laboratories). DAB (Invitrogen) se utilizó como cromógeno y hematoxilina como contratinción. Ratón o IgG de conejo, en su caso, a la misma concentración que el anticuerpo primario se utilizó como control negativo y no mostró tinción inespecífica [32].
inmunohistoquímica evaluación
A los pocos núcleos inutilizables se encontraron en el TMA debido a núcleo de tejido que falta, necrosis cáncer, o células cancerosas insuficientes. Estos núcleos fueron excluidos de los resultados.
La inmunotinción se evaluó mediante una puntuación casi continua AR nuclear, creado por la multiplicación de cada nivel de intensidad (0 para ninguna mancha, la mancha de 1 débil, y 2 para tinción intensa) por el correspondiente porcentaje de células positivas, y a continuación, sumando los resultados.
Ki-67 tinción se midió mediante la elección al azar hasta 4 campos de 250 m
2 en cada sitio de tejido. Se contaron el número de células total y el número de células positivas Ki67, y la final índice Ki-67 se calculó usando el número de células positivas, dividido por el número de células total.
AR anticuerpos utilizados en este estudio dirigidos tres regiones distintas de la AR humana proteína. Los inmunógenos de F39.4.1 AR (contra aa301-320) y AR441 (contra aa299-315) se localizaron en el N-terminal de AR mientras AR C-19 (contra aa900-919) en el C-terminal. Por lo tanto, describimos AR F39.4.1 y AR441 como anticuerpos AR N-terminal y C-AR 19 como un anticuerpo AR C-terminal. patrones específicos de inmunotinción nuclear AR se evaluaron como: N + C + (tinción similar positivo N-terminal y C-terminal AR en el núcleo); N + C ↓ (puntuación AR C-terminal se redujo más del 50% en comparación con el N-terminal en el núcleo) y N-C- (N- negativa similar y C-terminal de la tinción de AR en el núcleo). Los tejidos en grupo N + C ↓ no se incluyeron porque eran raros, y no en relación con las variantes AR C-terminal truncado.
El análisis estadístico
Los análisis estadísticos de los resultados se realizaron utilizando el software Prism (GraphPad Prism), donde se utilizó la prueba de Mann-Whitney, y
p
valora ≤0.05 fueron escogidos como estadísticamente significativa.
Resultados
Por otra parte longitudinalmente formas de AR podría identificarse utilizando anticuerpos N- y C-terminales
Varias variantes de transcripción AR se han descrito que codifican polipéptidos AR desprovistos de la LBD C-terminal por corte y empalme alternativo del exón [21], [24] - [28] . Sin embargo, los anticuerpos específicos no están disponibles para detectar todas estas variantes en el tejido. Como anticuerpos se han desarrollado hacia los dominios N-terminales y C-terminales específicas de proteína de AR, hemos tratado de determinar si estos reactivos podrían utilizarse para distinguir CaP que expresan diferentes formas de AR. Para validar este método, primero evaluamos dos líneas CaP xenoinjertos derivados en el laboratorio de uno de los autores (RLV) y se sabe que expresan diferentes ARNm que codifica AR. El LuCaP 86,2 xenoinjerto, derivado de una metástasis de vejiga PCa humana y mantenido por pases en serie en ratones SCID castrados, se ha demostrado que poseen una variante de corte y empalme AR truncada C-terminal que omiten exones 5-7 y codifica un marco de lectura alternativo del exón 8 , designado AR
v567es. El xenotrasplante LuCaP 35 se derivó de una metástasis de los ganglios linfáticos CaP y expresa de larga duración AR (AR
FL) ARNm que codifica compuesto por 8 exones y una proteína del tamaño apropiado para esta transcripción [25].
Se analizaron las proteínas derivadas de LuCaP 86.2 y LuCaP 35 xenoinjertos por Western blot utilizando anticuerpos que reconocen N-terminal (AR 441) o C-terminal (AR C-19) de AR
FL proteína. En el tumor LuCaP 35, ambos anticuerpos AR detectaron un polipéptido 110 KDa similares AR que correspondía al tamaño de AR
FL. En el tumor LuCaP 86,2, junto a una débil banda de 110 KDa, anticuerpo AR N-terminal también identificó una isoforma 80 KDa AR que correspondía al tamaño predicho de los C-terminal AR truncada de empalme variante-AR
v567es mientras que C-terminal anticuerpo AR no lo hicieron (Figura 1A).
(a) análisis de transferencia Western de la expresión de AR en LuCaP 86,2 y 35 LuCaP xenoinjertos de tumores. (B) tinción IHC para la AR N- y C-terminal en LuCaP 86,2 (A y B) (C y D) y LuCaP 35 xenoinjertos de tumores. tinción (C) IHC para PSA (e), PSMA (f), cromogranina A (g), sinaptofisina (h), Ki67 (i) y control negativo (j) en LuCaP 86,2 xenoinjerto. (D) la tinción IHC para PSA (k), PSMA (l), cromogranina-A (m), sinaptofisina (n), Ki67 (o) y control negativo (p) en LuCaP 35 xenoinjerto. (X200 magnificación original, insertar x400).
Al igual que en el resultado de Western blot, análisis inmunohistoquímico (IHC) de 86,2 LuCaP mostró muy débil tinción nuclear con el AR C-terminal (AR-19 c) anticuerpo, pero la tinción nuclear intensa en la sección de serie con el anticuerpo contra AR N-terminal (F39.4.1 AR). El tumor LuCaP 35, se muestra solamente para expresar AR
FL mediante análisis Western, no mostró ninguna diferencia entre N y tinción AR C-terminal por IHC (Figura 1B). Estos datos confirmaron que la comparación de la AR N-terminal con la expresión AR C-terminal podría identificar C-terminales variantes AR /mutaciones truncadas en el tejido CaP.
AR
v567es se ha demostrado que es constitutivamente activa [25 ], esto es consistente con el hecho de que se observó inmunoreactividad diferente AR con N- y C-terminales de los anticuerpos en el núcleo. Para confirmar aún más la actividad de AR nuclear, teñidas para el PSA AR-regulado y proteínas PSMA. LuCaP 86,2 inmunorreactiva tanto para PSA y PSMA. Para confirmar que el 86,2 LuCaP no era una línea neuroendocrino xenoinjerto, teñidas con biomarcadores neuroendocrinos cromogranina A (CHG-A) y sinaptofisina (SYN). LuCaP 86,2 mostró CHG-A negativo inmunorreactividad, y débil a moderada SYN inmunoreactividad como producto de reacción bien, granular que fue predominantemente localizada en el citoplasma periférico de células. Además, aproximadamente el 20% de las células tumorales se Ki67 positivo que indica LuCaP 86,2 tenía una tasa de proliferación moderada (Figura 1C). Correspondientes resultados de IHC para LuCaP 35 también se muestran en la Figura 1D.
Las variaciones en la expresión del RA N-terminal y C-terminal se produjeron pocas veces en el epitelio benigno y primaria sin tratamiento CaP
Para determinar la frecuencia de C-terminal de variantes AR truncada en el epitelio benigno y sin tratamiento CaP localizado, que se calificó como IHC tinción de piezas de prostatectomía radical. Todas las 28 muestras normales de la próstata tenían expresión concordante N-terminal y C-terminal AR nuclear (N + C +) (Figura 2A a y b). Entre las 24 muestras prostáticas hiperplásicas, 21 casos (87,5%) mostraron consistentes N + C + expresión (Figura 2 C y D), sólo 1 (4,2%) habían disminuido C-terminal de tinción AR (N + C ↓) y 2 (8.3 %) no tenía ningún inmunorreactividad AR (NC-). En 50 muestras primarias CaP, 46 casos (92%) expresado N + C + AR (Figura 2A e-h), 2 casos (4%) había disminuido nuclear C-terminal vs. tinción AR N-terminal (N + C ↓) , mientras que 2 casos (4%) fueron negativos AR (NC-). En general, no hubo diferencias significativas en la proporción de N- vs. intensidad de la tinción nuclear C-terminal entre la próstata normal y muestras de próstata hiperplásicas (
p
= 0,5756), próstata normal y muestras PCA (
p
= 0.7428) y la próstata hiperplásica y muestras PCA (
p = 0,7508
) (Figura 2B).
(a) tinción IHC para N- y C-terminal de AR en condiciones normales próstata (NP) (a y b), de la próstata hiperplásica (HP) (c y d) y PCA (eh) (x200 aumentos) primaria. (B) Comparación de los perfiles de tinción AR entre la próstata normal, próstata hiperplásica y CaP primario. (C) Comparación de los perfiles de tinción AR entre CaP primario y metastásico CRPC.
Las variaciones en la expresión del RA N-terminal y C-terminal se produjo con frecuencia en CRPC
Para determinar la frecuencia de AR expresión variante en el CaP metastásico, que anotó la tinción IHC de sitios metastásicos de 42 pacientes que murieron de avanzada CRPC.
Entre los 162 sitios metastásicos, 103 (63,6%) mostraron expresión AR sitios nuclear consistente con ambos anticuerpos (N + C +). Sin embargo, 39 (24,1%) sitios tenían una puntuación nuclear C-terminal AR (N + C ↓) que era por lo menos 50% menor que la correspondiente puntuación AR N-terminal, y 20 (12,3%) los sitios de metástasis no tenía nuclear AR expresión (NC-) (Figura 2C). Estos resultados IHC estaban de acuerdo con la frecuencia de las variantes de empalme AR en el CaP metastásico determina utilizando métodos de PCR para detectar AR-V7 /AR3 y AR
v567es transcripciones [25]. No hubo diferencias en la tinción AR N-terminal entre CaP primario y metastásico (
p
= 0,38, datos no muestran), pero la frecuencia de disminución de la expresión AR C-terminal nuclear en metastásico CRPC fue significativamente mayor que en CaP primario (
p = 0,0027
). La comparación de la expresión AR nuclear entre CaP primario y metastásico CRPC se muestra en la Figura 2C.
expresión génica regulada por el AR fue alterada en CRPC metastásico con disminución nuclear C-terminal AR
Para determinar si la disminución de la expresión AR C-terminal nuclear se asoció con una alteración en la expresión de proteínas reguladas AR, lo que representa una pérdida de actividad AR, examinamos AR proteínas reguladas PSA, la expresión de PSMA y TMPRSS2 en las muestras CRPC metastásicos (Figura 3A) . Mientras que apenas faltan importancia, la expresión de PSA en los sitios metastásicos N + C ↓ fue menor que N + C + sitios metastásicos (
p = 0,0505
). la expresión de PSA en sitios metastásicos N-C- fue significativamente menor que los dos sitios de metástasis N + C + y N + C ↓ (
p
& lt; 0,001) (Figura 3B). Además, la expresión de PSMA en N + C + sitios de metástasis fue mayor que en N + C ↓ sitios metastásicos (
p = 0,0097
), pero PSMA en NC- sitios de metástasis fue significativamente menor que los dos N + C + y sitios de metástasis N + C ↓ (
p Hotel & lt; 0,0001) (Figura 3B). Por último, la expresión de TMPRSS2 en N + C + sitios metastásicos fue significativamente mayor que los sitios de metástasis N + C ↓ (
p
= 0,045). TMPRSS2 en sitios metastásicos N-C- fue significativamente menor que los dos sitios metastásicos N + C + y C + N ↓ (
p Hotel & lt; 0,01) (Figura 3B). La pérdida de expresión de TMPRSS2 en N + C ↓ y NC- sitios metastásicos no era tan pronunciada como la pérdida de PSA y PSMA expresión, lo que sugiere que TMPRSS2 no puede ser regulada por el AR en el mismo nivel que el PSA y PSMA en CRPC.
(a) tinción IHC para AR N-terminal (a), AR C-terminal (b), PSA (c), PSMA (d), TMPRSS2 (e), AKT-1 (f), Ki -67 (g), Control negativo (h) en un tejido metastásico CRPC (x200 magnificación, inserte x400). (B) PSA, perfiles de tinción PSMA, TMPRSS2 y AKT-1 de CRPC.
A continuación examinó los genes que han sido identificados con su expresión aumenta en respuesta a AR C-terminal truncado variantes [ ,,,0],26], [29], incluyendo AKT1, CDC20, CDK1, C-MYC, ciclina A2, UGT2B17 y UBE2C. Cuantitativos RT-PCR mostraron que AKT1, CDC20, CDK1 y expresión UGT2B17 fueron significativamente mayores en las ↓ N + C (n = 11) en comparación con + N muestras C + (n = 7), (p & lt; 0,05) (Figura 4A) . UBE2C también mostró una tendencia más alta, pero no alcanzó significación (p & lt; 0,10). Detectamos más AKT-1 y la expresión de proteínas por IHC. Sin embargo, el número de ciclo relativamente baja indica niveles relativamente altos de expresión génica en todos los casos. Por lo tanto, cuando también manchadas TMA para AKT1, señal relativamente fuerte estaba presente en la mayoría de las muestras de tumor en el TMA y dadas las mediciones semi cuantitativos, no se detectaron diferencias entre los grupos por IHC (Figura 3B). Por lo tanto, los cánceres con N + C ↓ AR expresaron niveles más altos AKT1, pero esta diferencia no se pudieron detectar en IHC debido a la abundante proteína en todos los grupos.
(A) Perfil de siete genes AR variante asociada expresión en humanos tejidos metastásicos. (B) Los mismos genes se midieron en LuCaP 86,2 y 35 LuCaP xenoinjertos. El RPL13A limpieza de genes se utilizó como control endógeno.
La pérdida de inmunorreactividad AR C-terminal nuclear se asocia con la expresión de variantes AR en metastásico CRPC
Se determinó que la pérdida de de inmunorreactividad AR C-terminal ocurrido con frecuencia en CRPC metastático. Esta pérdida de inmunorreactividad C-terminal puede ser debido a la expresión de una serie de conocidos (por ejemplo AR-V7 /AR3, o AR
v567es) y variantes de corte y empalme AR desconocidos. Para determinar si la inmunorreactividad N- y C-terminal se asoció con AR variantes de transcripción, se realizó RT-PCR en un subconjunto de los tejidos CRPC metastásicos y se compararon los resultados de RT-PCR a los resultados de IHC (Tabla 4). De 4 N + C muestras + metastásicos examinados por RT-PCR, todos expresaron AR
FL (uno también tenía expresión limitada de AR-V7). De 8 metastásico muestras clasificadas como N + C ↓ mediante análisis IHC, todos expresaron la AR
FL y 6 (75%) también se expresa al menos una variante AR conocido (AR-V7 /AR3 y /o AR
v567es ) por RT-PCR. Estas muestras metastásicas N + C ↓ también mostraron menores niveles de PSA y PSMA inmunorreactividad. Ninguna de las cuatro muestras metastásicas NC- expresó la AR
FL examinado por RT-PCR, aunque uno de ellos mostró muy bajo nivel de AR
v567es expresión.
Estos datos demostraron que el análisis IHC el uso de diferentes anticuerpos que reconocen AR regiones de la proteína distinta AR era muy concordantes con las transcripciones que codifican AR
FL y variantes de empalme que carecen de AR exones C-terminales.
AR mRNA variante era sensible a la concentración de andrógenos in vitro
células VCAP se cultivaron en suero de carbón de rayas (CSS), y luego tratados con dihidrotestosterona (DHT), MDV-3100 o MDV-3100 con DHT, por separado. QRT-PCR mostró que AR
FL mRNA fue suprimida por la adición de DHT, MDV-3100 y DHT + MDV (Figura 5A). La variante AR
v567es mRNA también fue suprimida por la DHT; sin embargo, se podría aumentar mediante la adición de antagonista del receptor de andrógenos MDV-3100 solo, y suprimida al nivel de CSS cuando se añadió DHT con MDV-3100 (Figura 5B). AR-V7 mRNA respondió de una manera similar a la AR
FL (Figura 5C).
(A) AR
FL mRNA fue suprimida por DHT, MDV-3100 y MDV-3100 + DHT pero no al nivel visto por la DHT solo. (B) AR
v567es mRNA fue suprimida en presencia de DHT, aumentado aún más mediante la adición de MDV-3100 y suprimida al nivel de CSS cuando se añadió DHT junto con MDV-3100. (C) AR-V7 ARNm respondió de una manera similar a la AR
FL.
No se observó expresión heterogénea de AR en pacientes individuales
Se identificaron C-terminal de AR truncada proteínas en varios sitios metastásicos de cada uno de los 42 pacientes CRPC (Figura 6). De los 42 pacientes, 16 (38%) no tenían pérdida de expresión de AR C-terminal, 23 (55%) tuvieron al menos un sitio metastásico con disminución de la inmunorreactividad AR C-terminal nuclear, y 6 (14,3%) tenían por lo menos una sitio con ninguna expresión de AR. Estos datos ponen de relieve la heterogeneidad de la expresión del RA entre los diferentes sitios de metástasis dentro del mismo paciente
.
sitios de metástasis múltiples de 42 pacientes CRPC habían sido analizados por IHC usando 2 AR anticuerpos. Los resultados de la tinción se resumieron como N + C + (azul), N + C ↓ (naranja) y N-C- (rojo). LN = nodo linfático; L = vértebra lumbar; R. = derecha; L. = izquierda; T = vértebra torácica
Además, para determinar si el estado de AR promovió la tasa de crecimiento del tumor, hemos dividido las muestras de metástasis ósea CRPC en tres grupos:. N + C + (n = 93), N + C ↓ (n = 39), y NC- (n = 18). El índice Ki67 para los sitios de N + C + fue del 18%. Esto no fue significativamente diferente de los sitios de N + C ↓ (20,8%) (p = 0,4225) o los sitios NC- (17,8%) (p = 0,95).
Discusión
Tradicional conceptos de AR translocación al núcleo que implican ligando de unión, disociación de chaperones y translocación nuclear implican que sin ligando de andrógenos, AR se encuentra principalmente en el citoplasma y la progresión del tumor CRPC sería impulsado por mecanismos distintos de los relacionados con AR. Sin embargo, este no es el caso con excepción de la mayoría de los tumores neuroendocrinos. CRPC generalmente poseen un AR transcripcionalmente activo que modula la expresión de ARN mensajeros regulados AR [1], [33]. Además, en la mayoría de los estudios sobre los tejidos CRPC, el AR se ha encontrado en el núcleo.
Se han propuesto múltiples mecanismos para explicar la localización nuclear de AR y algunos o todos pueden ser responsables de la observada en CRPC [34], [35]. La mayoría de los mecanismos propuestos sería capaz de trasladar la AR al núcleo ya que requieren la unión del ligando al LBD. Si este fuera el caso, en el supuesto de que no hay diferencias en las estructuras de AR, esperaríamos ver ninguna diferencia en la inmunotinción AR con N- o anticuerpos dirigidos C-terminales en CRPC metastático. Sin embargo, como se muestra en este estudio, hay una diferencia significativa entre N- nuclear y los anticuerpos terminal de AR C- en los tejidos metastásicos. Esto sugiere que el mecanismo (s) que no sean los mencionados anteriormente también podrían estar involucrados durante la translocación AR en el núcleo sin ligando en CRPC.
A pesar de que se han desarrollado anticuerpos para la AR-V7 /AR3 y AR
variantes v567es de empalme, por lo menos 20 variantes de corte y empalme AR se han reportado hasta la fecha. Con anticuerpos específicos para sólo 2 de las variantes, el uso de la tinción de anticuerpos específicos en el tejido para detectar variantes AR truncada inducida por la castración C-terminal no es factible [20] - [25]. A continuación, se desarrolla un enfoque novedoso e inmunohistoquímica rápida que compara N- y C-terminal de la inmunorreactividad de AR, que puede mostrar con éxito la frecuencia global de las variantes de corte y empalme AR C-terminal truncado en los pacientes.
Los datos aquí presentados se correlacionan la expresión de la proteína AR por IHC con 2 anticuerpos y la validación de la expresión de variantes de corte y empalme AR por RT-PCR, sugieren fuertemente que la variación entre AR N- y C-terminal resultados de inmunorreactividad de la expresión de ARNm de AR alternativos. Sin embargo, las explicaciones alternativas deben ser entretenidos. Los tumores primarios y metástasis de tejido blando se fijaron con formalina y embebidos en parafina, mientras que las lesiones metastásicas de hueso se fijaron con formalina y descalcificadas con ácido fórmico 10% antes de la incrustación en parafina. Se observó ninguna diferencia significativa en la tinción de AR en el tejido blando frente a metástasis ósea (p & gt; 0,05, datos no mostrados). Por otra parte, no hemos visto diferencias con otros anticuerpos entre los huesos y los métodos de preparación de tejidos blandos utilizando los mismos tejidos y métodos [36], [37]. Por lo tanto no hemos podido identificar una razón técnica para las diferencias en la coloración.