Extracto
La activación inducida por la citidina deaminasa (AID) es una enzima necesaria para la diversificación de anticuerpos, y que causa mutaciones en el ADN y las roturas de la cadena. AID expresión constitutiva en ratones invariablemente causado lesiones pulmonares morfológicamente similares a la hiperplasia adenomatosa atípica humana (AAH), que puede ser un precursor del carcinoma bronquioloalveolar. Similar a la AAH, ratón AAH-como lesión (centro comercial) exhibió signos de diferenciación alveolar, a juzgar por la expresión de tipo alveolar II (AT2) tensioactivo marcador de células de la proteína C (SP-C). Sin embargo, la microscopía electrónica indicó que Mall, que poseía ciertas características de una célula mucosa, es distinta de un AAH o célula AT2. Aunque MALL desarrolló en todos los individuos dentro de las 30 semanas después del nacimiento, los tumores de pulmón se produjo en sólo el 10%; esto sugiere que la gran mayoría de los centros comerciales no crecen en los tumores visibles. MALL expresó varios marcadores descritos recientemente de pulmón regeneración alveolar tales como p63, queratina 5, queratina 14, repeticiones ricas en leucina que contiene la proteína G-receptor acoplado a 5 (LGR5), y Lgr6. se observó aumento de la muerte celular en los pulmones de ratones transgénicos AID en comparación con ratones de tipo salvaje. Basándose en estas observaciones, se especula que Mall es un tejido en regeneración compensar la pérdida celular causado por citotoxicidad AID. expresión de AID en la regeneración de tejidos debe predisponer a las células a la transformación maligna a través de su actividad mutagénica
Visto:. Kitamura J, M Uemura, Kurozumi M, sonobe M, T Manabe, Hiai H, et al. (2015) Lesión pulmonar crónica por la expresión constitutiva de activación inducida por la citidina deaminasa conduce a la mucosa focal celular metaplasia y cáncer. PLoS ONE 10 (2): e0117986. doi: 10.1371 /journal.pone.0117986
Editor Académico: Jean-Pierre Vartanian, Instituto Pasteur, Francia |
Recibido: 18 Junio, 2014; Aceptado: January 4, 2015; Publicado: 6 Febrero 2015
Derechos de Autor © 2015 Kitamura et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la subvención-en-Ayudas a la Investigación Científica del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón (KAKENHI 23390097) . Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo [1,2], y el hábito de fumar representa aproximadamente el 80% de los casos de cáncer de pulmón [3]. Por otra parte, las enfermedades pulmonares como la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, neumonía infecciosa, neumonía intersticial idiopática, y la tuberculosis, todos los cuales causan inflamación en el tejido pulmonar, aumento del riesgo de cáncer de pulmón independiente del consumo de tabaco [4]. Con la disminución del consumo de tabaco, la prevención del cáncer de pulmón tabaco independiente ha llegado a ser relativamente importante [2,3]. La mayor pregunta por responder es cómo ocurren las mutaciones oncogénicas en el cáncer de pulmón tabaco independiente.
Estudios recientes sugieren la participación de citidina deaminases en el desarrollo de cánceres del tracto gastrointestinal, glándula mamaria, y de próstata [5- 9]. deaminasa inducida por activación citidina (AID), un miembro de la familia de la citidina deaminasa, es una enzima esencial para la hipermutación somática y la clase-recombinación de cambio de genes de anticuerpos. Hemos informado anteriormente de que la AID se expresa en varios tipos de cánceres gastrointestinales y hepatobiliares que se producen en el contexto de la inflamación crónica [5-7]. La expresión transgénica de AID en ratones provoca diversos tipos de tumores, incluyendo los de los pulmones, el hígado, y el estómago y leucemia [10,11]. AID expresión también se detectó en el adenocarcinoma de pulmón humano [12]. Estas observaciones sugieren el papel mutagénico de AID en el cáncer asociado con la inflamación.
Aproximadamente el 10% de los ratones transgénicos AID desarrollar tumor de pulmón macroscópica dentro de 90 semanas después del nacimiento [11]. Sin embargo, todas las personas (incluidos los que no tienen tumores de pulmón) poseen lesiones pulmonares microscópicas morfológicamente similares a humano atípica hiperplasia adenomatosa (AAH), un precursor del carcinoma bronquioloalveolar [10,13]. Inicialmente se especuló que esta AAH-como la lesión de ratón (centro comercial) es una lesión neoplásica que finalmente se convierte en el adenocarcinoma en ratones transgénicos AID. Empezamos a analizar MALL con la esperanza de obtener una información sobre el mecanismo de tumor de pulmón AID inducida en ratones y cáncer de pulmón asociado con la inflamación en seres humanos. Sin embargo, nuestros datos sugieren que centro comercial no es una lesión neoplásica, sino una estructura transitoria que expresan recientemente descrito marcadores de regeneración alveolar pulmonar. En este estudio, se exploran las causas y características de MALL, describir cómo la ayuda provoca centro comercial y de pulmón de tumores en ratones, y hacer frente a sus implicaciones en relación con la carcinogénesis pulmonar humano.
Materiales y Métodos
Ratones
El uso de 6 ratones C57BL transgénicos condicionales /poseer una sola copia del transgén que contiene CAG promotor impulsado-floxed proteína fluorescente verde (GFP) secuencia de codificación seguido por AID ratón secuencia de codificación (AID CTG) fue descrito anteriormente [14] . Al cruzar este ratón una vez con un ratón transgénico Cre impulsado por tejido no específica de la fosfatasa alcalina (TNAP) promotor (ratones TNAP-Cre con el fondo mixto de C57BL /6 y 129 /Sv después de tres retrocruzamientos con ratones C57BL /6 [15]), los ratones con la supresión de la línea germinal del segmento-GFP y, por lo tanto, -fueron obtiene la expresión constitutiva AID (Aidon). Aidon ratones de C57BL /6 antecedentes con una contribución menor de 129 /Sv, se diluye por retrocruzamiento más de seis veces, se utilizaron. ratones C57BL /6J se compraron a Japan SLC, Inc. (Shizuoka, Japón). Todos los ratones fueron alimentados ad libitum y se sacrificaron por dislocación cervical para censurar u observadas inmediatamente después de la muerte espontánea. Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Ético de Experimentación Animal y llevaron a cabo de acuerdo con las Directrices para la Experimentación Animal del Centro Médico de Shiga.
mutación génica análisis
fue diseccionado tejido pulmonar, incrustado en un compuesto OCT (Sakura Fineteck Japan Co., Ltd., Tokio, Japón), y se congelaron inmediatamente sobre nitrógeno líquido. A continuación, las secciones de 10 micras de grosor se tiñeron con hematoxilina y eosina (HE). MALL individual fue aislado por microdisección láser utilizando LMD 6000 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Alemania). El ADN genómico fue aislado de cada MALL utilizando el kit QIAamp DNA Micro (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania). El
Trp53
exón 5-8,
Kras
exón 2, y
Egfr
exón 19-21 fueron amplificados utilizando una reacción en cadena de la polimerasa anidada (PCR) con los siguientes cebadores :
Trp53
; hacia adelante 5 'GCG CCA TGG CCA TCT ACA A 3', revertir 5 'TCT TCT GTA CGG CGG TCT CT 3', anidado hacia adelante 5 'TGG CCA TCT ACA AGA AGT CAC 3', y anidado inverso 5 'CAG GGC AGG CAC AAA CA 3 '.
Kras
; hacia adelante 5 'CGG GTG TGT CCA CAG GGT ATA GCG T 3', revertir 5 'AGT AGT GTT CTA GGC CGG TCA 3', anidado hacia adelante 5 'GTG TGT CCA CAG GGT ATA GCG TAC TO 3', y anidado inverso 5 'GTT GAG TTC TAG CCG GGT CAG G, 3 '.
Egfr
exón 19; hacia adelante 5 'CCC TTT CTG CCT TAG CAT GTC 3', revertir 5 'GGC ACA TCC CTC AGT CAC TTA ACA C 3', anidado hacia adelante 5 'CTC TTG GAT TTG TAA TGT AGA GCC 3', y anidado inverso 5 'ATT GGG TGT AAT TTA TTA GTG CAT C 3 '.
Egfr
exón 20; hacia adelante 5 'GAA GAT AGT GGC TCA TCC TAA ACT C 3', revertir 5 'GCA TGA ACA CCA GGC TCG ATG 3', anidado hacia adelante 5 'ACA TCC CAC AGT GTA TTA GCA TTT A 3', y el inverso anidado 5 'CTG CTT TTC TTA GTG CTC TTA CCA 3 '.
Egfr
exón 21; hacia adelante 5 'GCC CAA GGA ACG TGA CGA AAG 3', 5 'AGG GTG CTA CTG AAT CCG TGG TCA T 3', anidado hacia adelante 5 'TTG TCA TTC ATG CCA GAT AAT TCC A 3', y anidado inverso 5 'TTA CTA CTC CCA CCG AAA TCC A 3 '. Los productos de PCR fueron purificados con una mezcla de exonucleasa /fosfatasa (ExoSap-IT, corporación USB /Affymetrix, Inc., Cleveland, OH, EE.UU.) y se secuenciaron usando los cebadores de PCR anidada y el Kit v1.1 Ciclo de Secuenciación Big Dye Terminator (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, EE.UU.). Secuenciación productos fueron tratados con el kit de purificación Xterminator Big Dye (Applied Biosystems) y se analizaron con el ABI 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
Las muestras de tejido Histología e inmunohistoquímica
de los ratones fueron fijadas en 10% (w /v) de formaldehído, se incluyeron en parafina, y se tiñeron con HE para el examen histológico. Por inmunohistoquímica, las muestras de tejido fueron fijadas a través de HOPE fijador (Polysciences, Inc., Warrington, PA, EE.UU.). Las muestras se incluyeron en parafina. La inmunohistoquímica se realizó utilizando complejo avidina-biotina-peroxidasa (ABC). fue descrito anticuerpo anti-AID monoclonal (Maid-2) [16]. Otros anticuerpos se compraron: keratina 5 (sc-17090; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, EE.UU.), p63 Delta N (sc-8609; Santa Cruz Biotechnology), Clara proteína de 10 kD de células (CC-10, SC- 9772; Santa Cruz de Biotecnología), la cadherina epitelial (E-cadherina, 24E10; Señalización celular, Danvers, MA, EE.UU.), repeticiones ricas en leucina que contiene la proteína G-receptor acoplado a 5 (LGR5, ab75732; Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.) , la proteína C del surfactante (SP-C, sc-13976; Santa Cruz Biotechnology), Lgr6 (sc-99123; Santa Cruz Biotechnology), queratina 14 (PRB-155P; Covance, Berkeley, CA, EE.UU.), y podoplanin (53- 5381; eBioscience, San Diego, CA, EE.UU.). Cada sección se contraste con hematoxilina
Estimación del número de centros comerciales en el conjunto de pulmón
Número total de centros comerciales se calcula de la siguiente manera:. Densidad del centro comercial en la sección (N, por cm
2) se calculó como un valor medio para 11 secciones de espesor 4 mm (T = 0,0004 cm) recogidos a intervalos de 100 m. El número y el área de centro comercial y el área de la región alveolar en cada sección se midieron en las imágenes de sección enteros usando el escáner y el software ScanScope ImageScope (Aperio Technologies, Inc., Vista, CA, USA). diámetro del centro comercial (D, cm) Media se estimó en 0,005 cm. Una masa de tejidos cúbica hipotética con un lado de 1 cm puede ser cortado en secciones de 1 /T. Por lo tanto, el número total de MALL cuenta en todas las secciones 1 /T será N /T. Un único centro comercial es cortado en pedazos D /T y contó D /T veces. La división de recuento total Mall (N /T) con este factor de redundancia (D /T), la densidad tridimensional de centro comercial puede ser expresado como N /D por cm
3. Utilizando los siguientes valores (N = 4,3, D = 0,005, volumen pulmonar bilateral de 1,0 cm
3) para un ratón de 37 semanas de edad, el número total de centro comercial en los pulmones se calcula como N /D × volumen pulmonar = 4,3 /1,0 = 0,005 × 860.
microscopía electrónica
para los análisis de microscopía electrónica, los ratones se perfundieron Aidon desde el ventrículo derecho con solución salina tamponada con fosfato (PBS) para eliminar la sangre. Sus pulmones fueron perfusión fija con una mezcla de 1,4% de paraformaldehído y glutaraldehído al 1% en PBS y, a continuación, cortado en cubos de 2 mm para microscopía electrónica de transmisión y la inmersión fijados en el mismo agente utilizado para la fijación de perfusión a 4 ° C durante la noche . Las secciones fueron post-fijaron en 1% de tetróxido de osmio en tampón fosfato 0,1 M durante 1,5 h. Las muestras fueron deshidratadas en una serie de etanol, se aclaró con óxido de propileno, y se incluyeron en Epon. Los bloques estaban en primer corte como semithin (1 m) secciones y se tiñeron con azul de toluidina para identificar MALL. Ultrafinas (60-90 nm) secciones se tiñeron con acetato de uranilo y citrato de plomo y examinarlos en el microscopio electrónico de transmisión, H7650 (Hitachi, Ltd., Tokio, Japón).
Apoptosis ensayo
Terminal desoxinucleotidiltransferasa (TDT) mediada por dUTP nick endlabeling (TUNEL) se llevó a cabo para detectar roturas en el ADN de apoptosis en los tejidos del pulmón y del hígado mediante el TACS 2 TdT-DAB Kit para la detección de apoptosis in situ (Trevigen Inc., Gaithersburg, MD, EE.UU. ). Las diapositivas se counterstained con 1% de verde de metilo. Para medir la muerte celular en el pulmón y el hígado, células de la pared alveolar TUNEL-positivos y negativos y los hepatocitos se contaron hasta alcanzar un total de 1.000 células de 9-24 no se solapan, elegido al azar × 400 campos. Las células se contaron usando el software de análisis de imágenes de VH Analyzer (Keyence, Osaka, Japón). Los datos fueron recolectados a partir de tres ratones individuales.
Ensayo de proliferación
Aidon ratones recibieron una inyección intraperitoneal diaria de 1 mg-5-etinil-2'- desoxiuridina (EDU) en 0,4 ml de PBS durante 7 días. Los ratones fueron estudiados a los 1 y 20 días después de la última inyección. La proliferación celular en secciones congeladas de 10 micras de espesor de los pulmones se detectó usando el kit de imagen Click-iT EdU Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, Invitrogen, Eugene, OR, USA). Las secciones se fijaron en 3,7% (v /v) de formaldehído durante 10 min. A continuación, los tejidos se permeabilizaron con 0,5% Triton X-100 en PBS a temperatura ambiente durante 20 min. El cóctel de reacción de Click-iT EdU incluyendo Alexa Fluor 488 azida se preparó de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se añadió para cubrir el portaobjetos y se incubó a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 min. Los núcleos se visualiza con la mancha Hoechst 33342. Los portaobjetos se examina bajo un microscopio de fluorescencia DM 5000B (Leica Microsystems). Se detectaron células positivas EdU en el pulmón. Los datos fueron recolectados a partir de dos ratones en cada punto de tiempo.
Cultivo de células y pro-inflamatoria estimulación de citoquinas
Las células humanas epiteliales alveolares (línea celular A549) fueron adquiridos de RIKEN Cell Bank (Tsukuba, Japón ) y se mantuvieron en Dulbecco Modificado Medio Eagle (DMEM) suplementado con 10% (v) de suero v /bovino fetal (FBS) a 37 ° C en 5% de CO
2. Una suspensión celular de 2 ml (1 × 10
5 células /ml) se sembraron en placas de cultivo de 6 pocillos y se incubaron durante 24 h para permitir la unión celular. Las células fueron tratadas con α del factor de necrosis tumoral humano (TNF Peprotech, Rocky Hill, NJ, EE.UU.), la interleucina-1β (IL1β PeproTech), y linfotoxina-α2 /β1 (LTα2 /β1, R & amp; D Systems, Inc., Minneapolis , MN, EE.UU.), cada uno a una concentración de 50 mg /ml, o PBS para el control negativo. ARN total fue extraído a partir de estas células 24 h después de la estimulación de citoquinas.
cuantitativa en tiempo real PCR de transcripción inversa
El ARN total se extrajo utilizando RNA Sepasol-I super (Nacalai Tesque, Kyoto, Japón) . A continuación, el ADN complementario (ADNc) se sintetizó utilizando el Kit de Síntesis de ADNc iScript (Bio-Rad, Nazareth, Bélgica). Entonces, cuantitativa en tiempo real PCR de trascripción inversa (RT-PCR) para la amplificación ayuda humana se llevó a cabo como se describe [5].
El análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó utilizando Stata 8.2 (StataCorp , College Station, TX, EE.UU.), excepto los valores de p de Student
t
prueba para análisis de tamaño de centro comercial, que se calcula utilizando el software Prism 4.0 (GraphPad software, Inc., San Diego, CA, EE.UU.).
Resultados
características histológicas de los pulmones de los ratones Aidon
en este estudio, se utilizaron ratones con una sola copia del transgén AID-expresión (ratones Aidon). ratones Aidon, en contraste con los ratones transgénicos de ayudas previamente reportados impulsados por el mismo promotor, pero con la integración de múltiples copias [10], no sufrieron la muerte temprana de linfoma de células T letal antes de la edad de 1 año, y sobrevivieron más de 90 semanas después del nacimiento. Este rasgo, posiblemente debido a una menor expresión del transgen AID, facilita en gran medida la observación del desarrollo del tumor fuera del compartimento linfoide.
Todos los ratones Aidon mayores de 6 meses desarrollado varios centros comerciales en la región alveolar del pulmón, como se describe anteriormente [ ,,,0],10] (Fig. 1). Cada centro comercial, que constaba de 4-20 células cúbicas o cilíndricas en las secciones, era un trozo de epitelio simple que muestra una continuidad directa con el epitelio alveolar. altura de centro comercial fue de 6-60 micras y la anchura era de 12 a 160 micras. núcleos alargados sin atipia se encuentran cerca de la membrana basal (fig. 1B). Cuando MALL fue seccionado por un plano paralelo a la membrana basal, que apareció como células cúbicas con núcleos redonda (Fig. 1C).
A, un resumen de los pulmones de una ayuda Tg ratón. Las puntas de flecha y los círculos abiertos indican las ubicaciones de los centros comerciales. B, C, vistas de mayor potencia de un centro comercial representativa en el pulmón de una ayuda Tg ratón. MALL se indica mediante una punta de flecha. HE, hematoxilina y eosina; AID, la activación inducida por la citidina deaminasa; Tg, transgénico; MALL, lesión de la AAH-como ratón.
recuento centro comercial fue examinado por un promedio de la densidad en 11 secciones del pulmón derecho, a intervalos de 100 micras para los ratones de entre 12 y 75 semanas de edad (Fig. 2A ). Centro comercial era apenas detectable en 12 y 17 semanas de edad, los ratones, pero no se detectó a las 26 semanas. El número de centros comerciales aumentó con la edad. A las 37 semanas, la densidad centro comercial en el corte fue de 4,3 ± 0,8 /cm
2 (media ± error estándar, n = 3), que corresponde a una estimación de 860 centros comerciales en los pulmones bilaterales (ver Métodos para el cálculo). Entre los 64 ratones Aidon examinados, sólo 7 (11%) desarrollaron tumores pulmonares visibles macroscópicamente (3 adenomas y adenocarcinomas) 4, que es comparable con la incidencia de tumores de pulmón en la línea original de los ratones transgénicos AID [11]. Teniendo en cuenta el gran número de centros comerciales en los pulmones del ratón de edad, se especula que la mayoría de los centros comerciales no crecen como tumores macroscópicos.
A, En el panel de la izquierda, significa densidad de centros comerciales en secciones por 1 cm
2 es representada frente a los ratones de edad en semanas. Una línea continua con el símbolo de cerrado y una línea gris con símbolos en blanco representan los ratones Aidon y de tipo salvaje, respectivamente. Las barras de error representan los errores estándar de los datos de tres ratones, a excepción de un ratón de tipo salvaje y un 75-semanas de edad Aidon ratón cada uno de los cuales se analizaron individualmente. El área de un rectángulo de puntos se amplió en el panel derecho. B, Sección de conexión con los centros comerciales individuales trazada. Los valores medios se indican con líneas rojas. Los valores de p calculados mediante la prueba t entre los grupos se indican mediante corchetes.
Diferentes tamaños (basados en el área de la sección transversal) de los centros comerciales individuales de los ratones de diferentes edades se representan en la Fig. 2B. El tamaño medio de un centro comercial que parecía ser relativamente constante en el tiempo. Aunque se detectaron diferencias estadísticamente significativas entre las 26 y 37 semanas (p = 0,002), y entre 37 semanas y 75 semanas (p & lt; 0,0001), la diferencia de valor medio era pequeña y no parecen tener importancia biológica. La aparición ocasional de grandes centros comerciales en ratones de 75 semanas de edad puede indicar que un número limitado de centros comerciales continúan creciendo, llegando a ser tumores visibles en la inspección macroscópica.
pulmón análisis de mutaciones de genes relacionados con el cáncer en los centros comerciales
Según los informes, la AAH humana alberga frecuencias significativamente elevados de mutaciones en los genes relacionados con el cáncer de pulmón de tres:
Trp53
,
Kras
, y
Egfr
[17-23] . Para examinar si Mall tiene mutaciones comparables a la AAH, se analizaron las mutaciones en regiones críticas de los tres genes:
Trp53
exones 5-8,
Kras
exón 2, y
Egfr
exones 19-21. Nos microdisecado 110 centros comerciales, de los cuales el ADN se purificó de forma individual y se somete a genes específicos de PCR y secuenciación directa. Mientras que cuatro (10,5%) de 38 centros comerciales mostró cinco mutaciones sin sentido en el
Trp53
gen, sin mutación sin sentido de la
Kras
o
fue encontrado Egfr
gen. La frecuencia de mutación de la
Trp53
gen fue comparable con los datos previamente publicados sobre la AAH humana en el pulmón [17,18], pero
Kras
y
EGFR
mutaciones eran mucho menos que en AAH humana [19 a 23] (Tabla 1). Cuatro de los cinco sentido erróneo
Trp53
mutaciones se prevé que comprometer la función de la proteína, aunque no está claro si estas mutaciones deletéreas jugaron algunos papeles en el desarrollo de centros comerciales (S1 A y B Fig.).
los números entre paréntesis indican el número de centros comerciales con la mutación del gen en comparación con el número de centros comerciales examinados.
la inclusión de mutaciones intrónicas, 14, 3 y 0 sustituciones de una sola base fueron encontrados en
Trp53
,
Kras
y
Egfr
gen, respectivamente. Los patrones de sustitución de citosina (C) -to-timina (T) y guanina (G) -to-adenina (A) Los cambios típicos de citidina desaminación no fueron predominantes en
Trp53
gen (14% [2 /14], S1C Fig.). En ambos casos, mutado Cs fueron 5'-precedida por G, que era coherente con la ayuda de la firma [24]. Como se muestra en la figura S1D., 2 de cada 3 sustituciones visto en
Kras
gen eran cambie C a T en un contexto dinucleótido de C-5 'precedido por T, que es un objetivo preferente de APOBEC3 desaminación [25]. Sin embargo, un pequeño número de mutaciones observadas en los centros comerciales se opone a la inferencia del proceso mutacional.
La inmunohistoquímica para marcadores de células epiteliales de las vías respiratorias
inmunohistoquímica Para caracterizar el estado de diferenciación de la alameda, se realizó durante tres marcadores específicos para tres tipos de vías respiratorias distales células epiteliales: podoplanin en las células alveolares de tipo 1 (AT1), SP-C en las células alveolares de tipo 2 (AT2), y CC-10 en las células Clara. Centros comerciales estaban parcialmente positivo para la SP-C, pero negativo para CC-10 y podoplanin (Fig. 3A-C). Este hallazgo sugiere que las células AT2 pueden estar presentes en el centro comercial.
A, CC-10, marcador de célula clara y B, podoplanin, alveolares de tipo marcador de células que fueron negativos. C, SP-C, marcador de células alveolares de tipo II fue parcialmente positiva en las células del centro comercial. D, p63 Delta N; E, queratina 5; F, keratin14; G, E-cadherina; H, LGR5; y yo, Lgr6 eran todos positivos en los centros comerciales. la señal de color marrón indica la tinción positiva por diaminobenzidina y la señal azul indica contrarrestar la tinción nuclear mediante hematoxilina. MALL se indica mediante una punta de flecha. CC-10, Clara proteína de 10 kD de células; SP-C, la proteína surfactante C; E-cadherina, cadherina epitelial; LGR, repeticiones ricas en leucina que contiene los receptores acoplados a proteínas G.
La naturaleza en estado latente del centro comercial y la escasez de mutaciones en los genes relacionados con el cáncer de pulmón nos llevó a especular que MALL podría ser una lesión y no regenerativa de una neoplasia temprana. Recientemente, se informó de marcadores de regeneración de las células de las vías respiratorias distales. En una regeneración de pulmón modelo de ratón se presentan después de la infección de virus de la gripe H1N1, p63, queratina 5, queratina y 14 se expresan en la regeneración de las células alveolares [26]. En otro estudio utilizando células pulmonares humanas derivadas, las células que expresan E-cadherina, LGR5 y Lgr6 poseía una capacidad similar a células madre de autorrenovación y diferenciación broncoalveolar [27]. La inmunohistoquímica reveló también que MALL expresó ΔNp63, queratina 5, queratina 14, E-cadherina, LGR5 y Lgr6 (Fig. 3D-I), lo que indica que MALL conserva una firma de tejido regenerativo alveolar.
microscopio electrónico hallazgos
Para examinar más a fondo las características de centro comercial, se evaluaron los pulmones de los ratones Aidon a través de microscopía electrónica de transmisión. MALL consistía en una monocapa de células sobre una membrana basal. Las células se columnar con núcleos alargados (Fig. 4A). Curiosamente, todas las células contenían vesículas secretoras inmaduras en la porción apical del citoplasma sin cuerpos lamelares (Fig. 4B). Estas vesículas fueron positivas para la tinción de PAS, lo que indica la presencia de mucina (Fig. 4C). Estos resultados indican que las células centro comercial son, de hecho, las células inmaduras mucosas. Como AAH humana contiene cuerpos lamelares [28], la estructura centro comercial es distinta de la AAH, a pesar de la nomenclatura inicial
Electron hallazgos microscópicos de MALL:. A, Información general de las células centro comercial. B, vista ampliada de la parte apical de las células centro comercial. Las flechas indican las vesículas secretoras inmaduras en el citoplasma de las células centro comercial. Un asterisco indica una célula basal adyacente a las células del centro comercial. C, la tinción de PAS demuestra que los materiales son teñidas positivamente en el ápice de las células Mall (puntas de flecha). D, micrografía electrónica que muestra una célula epitelial fagocítica dentro de centro comercial (asterisco). Inserción, mayor poder de vista de la célula epitelial fagocítica. Las flechas indican la membrana basal. Las puntas de flecha indican los cuerpos residuales dentro de la célula. AS, espacio alveolar; PAS, ácido periódico de Schiff.
Además, se han detectado células similares a las células basales, que normalmente no se ven en el pulmón distal del ratón [29], en la parte basal de células MALL (Fig. 4A). Fuerte expresión de queratinas 5 y 14 sugiere que MALL originó a partir de esta célula-célula como basal. Además, hemos encontrado ocasionalmente células fagocíticas dentro de centros comerciales (Fig. 4D). Estas células tenían contacto directo con la membrana basal y cuerpos residuales en el citoplasma. Con esta observación, llegamos a la conclusión de que estas células eran células epiteliales realidad fagocíticas. Estas células representan una respuesta fisiológica a la apoptosis de sus vecinos epiteliales [30,31]. Por lo tanto, este hallazgo sugiere que la remoción del tejido muerto por las células epiteliales se produce en el epitelio de la vía aérea distal en ratones Aidon.
muerte celular mejorada en el tejido de los ratones Aidon
La presencia de células epiteliales fagocíticas en los centros comerciales nos llevó a especular que la muerte celular de pulmón se produce con mayor frecuencia en los ratones Aidon que los ratones WT. En el ensayo de TUNEL, nos encontramos de vez en cuando las células muertas dentro de centros comerciales (Fig. 5A). Sin embargo, las células muertas fueron reconocidos incluso en la zona exterior MALL. La aparición de células muertas fuera de centro comercial en los pulmones de ratones Aidon (0,43%) fue significativamente mayor que en los ratones WT (0,09%, P = 0,013; Fig. 5B, Tabla 2). Para examinar si la citotoxicidad AID es específico para el pulmón, se realizó la tinción de TUNEL de tejido hepático. El número de TUNEL-positivas hepatocitos aumento en ratones Aidon en comparación con los ratones WT (6,0% vs. 4,8%, P = 0,036; Fig. 5C, la Tabla 2). Este hallazgo indica claramente que la muerte celular inducida por AID-no es específico para el pulmón
tinción TUNEL de A, MALL.; B, pulmón de la AID Tg del ratón; y C, de hígado de ratón Tg AID. Las puntas de flecha indican las células TUNEL positivas. Ensayo de proliferación celular por medio del etiquetado EdU en el pulmón de los ratones Tg AID y ratones WT: D, figura representativa de la alameda de edu-positivo el día 1. Una punta de flecha indica MALL EDU-positivo (la región está rodeada por una línea discontinua). E, figura representativa de los pulmones de los ratones Tg AID en el día 20. Una punta de flecha indica MALL EDU-positiva y una flecha indica MALL EDU-negativo. La región de cada centro comercial está rodeado por una línea discontinua. TUNEL, la terminal desoxinucleotidiltransferasa (TDT) mediada por dUTP nick endlabeling; Edu, 5-etinil-2'- desoxiuridina.
Los números entre paréntesis indican la proporción de células TUNEL positivas para TUNEL células negativas.
La proliferación celular en los centros comerciales
MALL consiste en múltiples células inmaduras mucosas y un número limitado de células basales morfológicamente similares a las de los bronquios, que sirven como células madre para epitelios bronquiales. Si las células mucosas inmaduros se derivan de estas células basales, que puede ser la hipótesis de que la generación de MALL debe acompañar la división celular. Para comprobar esta hipótesis, se realizó un ensayo de proliferación por 5-etinil-2'- desoxiuridina (EDU) incorporado en la replicación de ADN. En primer lugar, se administró la inyección intraperitoneal de una dosis diaria de EdU a ratones Aidon durante 7 días consecutivos. La mitad de los ratones fueron sacrificados para la inspección de pulmón un día después de la última inyección EdU (día 1). Encontramos unas pocas células EDU-positivas dentro de los centros comerciales, lo que indica que estas lesiones tienen el potencial de llevar a las células proliferantes. Después de un análisis cuantitativo de imágenes adquiridas, el 91,1% (41/45) de los centros comerciales se encontró que contenía células positivas Edu (Fig. 5D).
A continuación, se examinaron los pulmones de la otra mitad de los ratones en el día Aidon 20. Curiosamente, sólo el 44,2% (19/43) de los centros comerciales tenían células positivas Edu (P & lt; 0,01 mediante la prueba de chi-cuadrado, figura 5E.). Esta disminución en EdU positividad durante los primeros 19 días puede ser interpretado por un escenario en el que los centros comerciales establecidos se convierten en tejido alveolar normal, como se generan nuevos centros comerciales, sin etiqueta. Esta transformación se cree que disminuye EdU positividad. Otro escenario es que las células se someten a MALL la muerte celular y se eliminan. Estas dos posibilidades no son mutuamente excluyentes. ¿Qué resultado es dominante es claro en la actualidad.
A juzgar por el aumento gradual en el número de centros comerciales (Fig. 2A), parece probable que la tasa de generación MALL es ligeramente superior a la tasa de desaparición.
centro comercial y tumor de pulmón
Nuestros datos sugieren que centro comercial no es un tumor, pero una metaplasia de células en proliferación mucosa con la longevidad restringido. Para investigar la relación entre el centro comercial y de tumores de pulmón, que se desarrolla en aproximadamente el 10% de los ratones Aidon, En primer lugar confirmó la expresión de AID en el centro comercial por inmunohistoquímica (Fig. 6A). Este resultado fue consistente con el resultado de RT-PCR cuantitativa, se muestran 3 veces más alta expresión de AID en el centro comercial que rodea el tejido alveolar (S2 Fig.). A continuación, se examinaron las secciones de adenoma de Aidon ratones de pulmón. Curiosamente, se encontró que los centros comerciales están incrustados en ocasiones dentro del tejido tumoral (Fig. 6B y C). Además, la mayoría de las células tumorales expresan el p63 marcadores de regeneración de pulmón, queratina 5/14 y 5/6 Lgr (Fig. 6, D-H). La expresión de estos marcadores de regeneración a menudo se limita a una subpoblación de células tumorales, lo que probablemente refleja una instancia de heterogeneidad intratumoral. La presencia de MALL dentro de un tumor canceroso y su potencial proliferativo sugieren que el tumor de pulmón puede tener su origen en centro comercial en ratones transgénicos AID.
A, inmunohistoquímica para la AID en los centros comerciales. MALL se indica mediante una punta de flecha. B, SE tinción de los pulmones de los ratones Tg de ayuda con adenoma de pulmón. Un adenoma está demarcada por una línea de puntos. Región indicada por un rectángulo se amplía en C. C, puntas de flecha indican los centros comerciales dentro de adenoma de pulmón. La inmunohistoquímica para D, ΔNp63: E, queratina 5; F, queratina 14; G, Lgr 5; y H, Lgr 6 en el adenoma de pulmón.
La inducción de la expresión de AID en las células epiteliales alveolares humanos
Si se induce la expresión de AID en las células del epitelio alveolar por las citoquinas pro-inflamatorias, como era se muestra para los cánceres humanos del tracto gastrointestinal [5-7], la posible participación de AID en el cáncer de pulmón humano surgiría. Para examinar si los estímulos inflamatorios mejorar la expresión AID en las células epiteliales alveolares, el proceso se analizó por RT-PCR cuantitativa en células A549 de adenocarcinoma derivado de pulmón humano. las células A549 se estimulan con TNF, LT o IL1β α2 /β1 de 12 y 24 h. El ARN se analizó la expresión del ARNm de la AID por RT-PCR cuantitativa. AID expresión se indujo con éxito 12 h después de la adición de TNF o IL1β, mientras que la inducción por LTα2 /β1 fue marginal (Fig. 7).
La trama muestra el resultado de cuantitativa en tiempo real PCR de trascripción inversa de ARNm de la AID células de adenocarcinoma derivado de pulmón humano A549 estimuladas con factor de necrosis tumoral (TNF) α, interleucina (IL) 1β o linfotoxina (LT) α2 /β1 de 12 y 24 h. Los datos son la media ± SE; n = 3. SE, error estándar.
Discusión
En el presente estudio, hemos propuesto que MALL es una metaplasia de células mucosas que se desarrolla después de la lesión alveolar pulmonar inducida por AID y podría ser una lesión precancerosa para el cáncer de pulmón. Además, hemos demostrado que la expresión de AID se induce en las células alveolares humanos por las citoquinas pro-inflamatorias, lo que sugiere la participación de AID en la carcinogénesis pulmonar humano. Empezamos este estudio a partir de la suposición de que MALL puede ser un tumor en estadio muy temprano al igual que la AAH humana.