Extracto
Antecedentes
Los microARN (miRNA) son pequeñas, no codificantes moléculas de ARN de 20 a 22 nucleótidos que regulan la expresión de genes mediante la unión a su región no traducida 3 '(3'UTR). El aumento de la participación implicado datos alterada miARN en el progreso del cáncer. Hemos informado anteriormente de que CYP2J2 epoxigenasa promueve fenotipos de cáncer humano. Pero si, y cómo CYP2J2 está regulado por los genes miARN no se entiende.
Métodos y resultados
Utilizando el análisis de la bioinformática, encontramos sitios diana potenciales para miARN let-7b en el 3'UTR de CYP2J2 humano. Luciferasa y ensayos de Western blot reveló que CYP2J2 fue regulada por let-7b. Además, let-7b disminuyó la actividad enzimática de CYP2J2 endógeno. Por otra parte, let-7b puede disminuir la proliferación celular y promover la apoptosis de las células tumorales a través de las células de la represión postranscripcional de CYP2J2. xenoinjertos de tumores se indujeron en ratones desnudos por inyección subcutánea de células MDA-MB-435. El vector de expresión let-7b, pSilencer-let-7b, se inyecta a través de vena de la cola cada 3 semanas. Let-7b inhibió significativamente el fenotipo tumoral por la orientación CYP2J2. Por otra parte, la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real y el Western Blot se utilizaron para determinar los niveles de expresión de let-7b y
CYP2J2
proteína de 18 pulmón emparejado cáncer de células escamosas y de los tejidos pulmonares normales adyacentes; el nivel de expresión de CYP2J2 fue inversamente proporcional a la de let-7b.
Conclusiones
Nuestros resultados demostraron que la disminución de expresión de let-7b podría conducir a la alta expresión de la proteína CYP2J2 en cancerosa tejidos. Estos hallazgos sugieren que los genes miARN let-7b reduce la expresión CYP2J2, lo que puede contribuir a la inhibición de fenotipos tumorales
Visto:. Chen M, C Chen, Yang S, W Gong, Wang Y, Cianflone K, et al. (2012) Let-7b inhibe el cáncer humano Fenotipo Al dirigirse citocromo P450 epoxigenasa 2J2. PLoS ONE 7 (6): e39197. doi: 10.1371 /journal.pone.0039197
Editor: Gangjian Qin, Northwestern University, Estados Unidos de América
Recibido: 19 de diciembre de 2011; Aceptado: 16-may de 2012; Publicado: 25 Junio 2012
Derechos de Autor © 2012 Chen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo recibió el apoyo de subvención del Programa Nacional de Investigación básica = "973 =" (Nº 2012CB517801) y la SNCF (Nº 30930039 y 81070236). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
citocromo P450 humano (CYP) epoxigenasa, CYP2J2, cataliza la epoxidación de ácido araquidónico en cuatro regioisómeros de ácido cis-epoxieicosatrienoicos (5,6-EET; 8,9-EET; 11,12-EET; y 14,15-EET) [1]. Esta enzima parece estar expresado principalmente en corazón y los vasos células endoteliales [2], y también se ha encontrado en una variedad de tejidos incluyendo el hígado, pulmón, riñón, y tejidos gastrointestinales [3]. Debido a diferencias en la eficacia catalítica de las isoformas de P450 resultados individuales en diferentes perfiles de EET para cada [4], 11,12- y 14,15-EETs son los metabolitos del ácido araquidónico producidos principalmente en diversas células y tejidos [5], [6] .
Varios estudios han informado de que los EETs tienen diversos efectos biológicos dentro del sistema cardiovascular. Las EETs liberadas del endotelio activado canales de potasio sensibles al calcio y resultaron en la hiperpolarización de las células musculares lisas y la relajación vascular [7]. Por otra parte, las concentraciones fisiológicas de EETs o sobreexpresión de
CYP2J2
reducida vascular molécula de adhesión celular 1-expresión (VCAM-1) y la adhesión de leucocitos impedido a la pared vascular [8]. Los efectos inhibidores de EETs mostrar que tienen efectos anti-inflamatorios en el sistema vascular independiente de su membrana-hiperpolarización efectos [8]. Además, los EETs también promovió la proliferación endotelial celular, la migración y la angiogénesis mediante la activación de ambos activada por mitógenos proteína quinasa (MAPK) y fosfatidilinositol 3-(PI3) -kinase /Akt [9].
Por otra parte, otras evidencias indican que la sobreexpresión epoxigenasa o tratamiento EETs tienen posibles efectos perjudiciales. En publicaciones recientes, se encontró que los EETs derivados de CYP2J2 jugar un papel importante en una serie de procesos relacionados con el comportamiento de las células cancerosas y la patogénesis del tumor. Encontramos alta expresión de CYP2J2 en tumores humanos, así como en ocho líneas celulares de carcinoma de origen humano, pero no en los tejidos normales adyacentes y líneas celulares humanas no tumoral [10]. La sobreexpresión de CYP2J2 o adición de EETs exógenos acelerado notablemente la proliferación y la metástasis de las células cancerosas in vitro e in vivo [10], [11]. CYP2J2 sobreexpresión o adición de exógena EETs protegidos células de carcinoma humano de la apoptosis por la regulación positiva de las proteínas antiapoptóticas, Bcl-2 y Bcl-xL, y mediante la regulación negativa de la proteína proapoptótico, Bax [10]. En contraste, los inhibidores selectivos de CYP2J2 tenían efectos antitumorales significativos in vitro e in vivo y se asociaron con una reducción de la biosíntesis de EET [12]. En conjunto, todos los resultados demostraron las funciones importantes y reconocidos previamente de CYP2J2 y sus productos EET en la carcinogénesis.
El aumento de evidencias indican que los miRNAs juegan un papel importante en diversos procesos biológicos, tales como la proliferación, diferenciación y apoptosis durante el desarrollo [13], [14], [15]. Varios estudios han descrito de hecho la expresión aberrante en tumores humanos de miRNAs y su función de control de la expresión de ciertos oncogenes y genes supresores de tumores [16], [17], [18]. Por ejemplo, el miR-15a y miR-16 con frecuencia se eliminan o regulados a la baja en los carcinomas de células escamosas y adenocarcinomas del pulmón [19]. El microARN-101 está regulado por disminución en los tejidos de la vejiga carcinoma de células transicionales (TCC) e inhibe la proliferación celular y la formación de colonias en las líneas celulares TCC reprimiendo directamente oncogén EZH2 [20]. Un estudio reciente indica que los genes miARN-let-7a inhibe la expresión de MYC y revierte el crecimiento MYC inducida en células de linfoma de Burkitt [21]. Informes anteriores indican que let-7 no está bien expresado en una variedad de tumores humanos y la reducción de let-7 resultados a nivel de sobre-expresión (cyclinD, RAS, MYC) de los genes let-7-sensibles en los tumores [22], [23] , [24], [25]. Sin embargo, la función exacta de let-7 en el cáncer no se entiende todavía completamente. Nuestros datos muestran preliminar que let-7b es el regulado en tumores escamosos de pulmón humano, mientras que los niveles de proteína CYP2J2 está regulado, lo que sugiere que podría ser CYP2J2 humano post-transcripcionalmente regulada por let-7b. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio fue investigar la hipótesis de que el let-7b podría actuar como un supresor de tumores a través de la orientación CYP2J2.
Resultados
Let-7b se dirige a la 3'UTR de
CYP2J2
Para investigar si CYP2J2 se regula directamente por let-7b, se construyó un plásmido indicador de luciferasa que contiene el 3'UTR de CYP2J2 clonado aguas abajo del gen indicador de luciferasa (Figura 1A). Estamos transfectadas la luciferasa constructo en células HepG2 junto con let-7b o al azar let-7b. Se encontró que la transfección de PMIR /CYP2J2-3'UTR junto con let-7b resultó en una reducción significativa en la actividad reportera que aquellos de control y transfecciones aleatorios. Por otro lado, sin regulación a la baja significativa de la actividad de reportero PMIR podría determinarse cuando el reportero transfectadas PMIR (vector vacío) junto con let-7b o al azar let-7b en células HepG2 (Figura 1B). Para confirmar aún más que CYP2J2 es un objetivo de let-7b, se construyó siete mutantes (PMIR /CYP2J2-3? UTR mutantes, mutante-1, mutante-2 ... y mutante-6, respectivamente) en base a PMIR /CYP2J2-3? UTR. Entonces transfectadas estos constructos en las células (MDA-MB-435 y SK-MES-1) y se analizaron la actividad de informador de luciferasa. Los ensayos mostraron que la actividad de la luciferasa de PMIR /CYP2J2-3? UTR mutante no fue reprimida por let-7b, en comparación con el tipo salvaje PMIR /CYP2J2-3? UTR (Figura 1C y D). Entre los seis mutantes restantes (mutantes-1, 2-mutante ... mutante-6), la actividad de luciferasa de mutante-3 fue reprimida por let-7b, comparando con al azar y control (
P Hotel & lt; 0,05) ( Figura 1E). Por otra parte, el sitio de unión III coincide por completo la secuencia de semillas de let-7b si se permitió el apareamiento de bases bamboleo. Estos datos indican que CYP2J2 es uno de los objetivos de let-7b.
A, representación esquemática de los sitios objetivo previsto de let-7b en el 3'UTR de CYP2J2. El 3'UTR de CYP2J2 fue clonado en un plásmido informador de luciferasa, denominado PMIR /CYP2J2-3'UTR. Una serie de mutantes llevó nucleótidos mutados en seis posibles sitios de unión para la región de semillas let-7b se generaron sobre la base de tipo salvaje PMIR /CYP2J2-3'UTR. Los mutantes de PMIR /CYP2J2-3'UTR se construyen mediante la mutación del sitio complementario (etiquetado por subrayado) en la región de la semilla let-7b a sus bases complementarias. B, la actividad luciferasa se analizó en las células HepG2 24 h después de la transfección con el plásmido reportero PMIR /o CYP2J2-3'UTR PMIR (vector vacío). C-D, de larga duración CYP2J2-3'UTR secuencia que contiene los sitios de unión de mutantes de la región de semillas let-7b se genera en función de tipo salvaje PMIR /CYP2J2-3'UTR. Estamos transfectadas estos constructos en las células (MDA-MB-435 y SK-MES-1) y se analizaron la actividad de informador de luciferasa. Tal y como esperábamos, let-7b no afectó a la actividad luciferasa de los mutantes en comparación con el tipo salvaje. E, los seis mutantes se transfectaron en SK-MES-1 en las células, además de let-7b o al azar let-7b. La actividad luciferasa de los seis mutantes no fue reprimida por let-7b. actividades de luciferasa de Renilla se utilizaron para normalizar la actividad de luciferasa de luciérnaga. Columnas, con una media de tres experimentos; bares, Dakota del Sur. *,
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. & Lt; 0,05
Let-7b Inhibe niveles de expresión de Endógeno CYP2J2 y su actividad enzimática in vitro
Para investigar los efectos de la let exógeno -7b en el nivel de proteína y la actividad enzimática de las proteínas endógenas CYP2J2, se examinaron los niveles de proteína de CYP2J2 en HeLa, TCA-8113, SK-MES-1, y MDA-MB-435 células después del tratamiento con let-7b durante 48 h (100 nM). El análisis de transferencia Western mostró que la sobreexpresión de let-7b downregulated significativamente la expresión de CYP2J2 en cuatro líneas celulares de cáncer (Figura 2A). expresión CYP2J2 relativa se cuantificó por densitometría (Figura 2B). Como en la Figura S1A y B, Western blots mostraron un efecto dependiente de la dosis de inhibidor let-7b y let-7b en la expresión de proteínas CYP2J2. Dada la inestabilidad del SET, se determinó la concentración del metabolito estable 14,15-DHET en medios de cultivo celular para confirmar la inhibición de let-7b en la actividad enzimática de CYP2J2. Los resultados mostraron que 14,15-Dhet niveles se redujeron de manera significativa por la transfección de let-7b (Figura 2C). Estos datos mostraron que CYP2J2 humano está regulado por disminución directamente por let-7b.
A, nivel de proteína de CYP2J2. HeLa, TCA-8113, MDA-MB-435, y SK-MES-1 células fueron tratadas con let-7b o 7b let-aleatorio (100 nM) durante 48 h. El nivel de proteína CYP2J2 fue examinado por Western blot. B, el nivel de proteína de CYP2J2 se cuantificó por densitometría. Columnas, con una media de tres experimentos; bares, Dakota del Sur. *,
P Hotel & lt; 0,05. se determinaron C, metabolito estable 14, 15-Dhet en HeLa, TCA-8113, y MDA-MB-435 células como se describe en Materiales y Métodos. Las células tratadas con exógenos hsa-let-7b producen menos EETs que los tratados con al azar let-7b. Puntos, con una media de tres experimentos; bares, Dakota del Sur. *,
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Let-7b Reduce el crecimiento de células cancerígenas e induce la apoptosis mediante la regulación negativa Directamente CYP2J2
Hemos informado anteriormente de que estimula la proliferación CYP2J2 de células de carcinoma y protege las células de carcinoma humano de la apoptosis [10]; por lo que era de interés para evaluar los efectos de la sobreexpresión de let-7b en la proliferación celular y la apoptosis cuando CYP2J2 endógena fue inhibida por let-7b. Se han tratado HeLa, TCA-8113, SK-MES-1, y las células MDA-MB-435 con exógenos let-7b o al azar let-7b durante 48 h. La tasa de proliferación se determinó a través del ADN de la célula EDU-Light ™ kit de proliferación celular (Ribobio, China). Los resultados mostraron una inhibición significativa de la proliferación celular por let-7b. Por ejemplo, en MDA-MB-435 y 1 células SK-MES-let-7b, redujo la proliferación celular en un 50% en comparación con el control negativo y al azar let-7b (Figura 3A). La apoptosis, medido por Anexina V y la tinción de yoduro de propidio, aumentó significativamente en las células transfectadas con let-7b (Figura 3B). Además, exógeno let-7b disminuyó el porcentaje de células EDU-positivos y el aumento de las células apoptóticas en células HeLa y TCA-8113 (Figura 3C y D). Para proporcionar evidencia adicional de que los efectos de la expresión let-7b sobre la proliferación celular y la apoptosis se relacionaron con CYP2J2, las células transfectadas con let-7b fueron tratados con C26 (10 M) (inhibidor CYP2J2 específica [12]) y 14,15-EET (250 nM) durante 48 h. Para reducir al mínimo la reducción en los niveles de 14,15-EET debido a la auto-oxidación, las células se estimularon con 14,15-EET o un volumen comparable de vehículo (DMSO) cada 6 h. Como era de esperar, los efectos de let-7b expresión en la proliferación celular y la apoptosis se potenciaron por C26 y abolida por 14,15-EET (Figura 3E y F). Además, para determinar si let-7b tratamiento afecta el crecimiento de células de H9c2 (células H9c2 no tienen
CYP2J2
), se utilizó la célula-Light ADN EDU ™ Kit Proliferación Celular y Anexina V y yoduro de propidio tinción para medir la proliferación celular y la apoptosis de las células H9c2. Como se muestra en la Figura S2A y B, no sólo la proliferación celular, sino también la apoptosis celular de las células H9c2 no se vieron afectados por el tratamiento inhibidor de let-7b o let-7b. Estos datos sugirieron que la sobreexpresión de let-7b resultó en disminución de la proliferación y la apoptosis activada de líneas celulares de carcinoma.
A, ensayo de proliferación a través de ADN EdU Cell-Light ™ Kit de proliferación celular que muestra disminución de la tasa de proliferación de MDA-MB- 435 y SK-MES-1 en las células tratadas con let-7b en comparación con las células tratadas con al azar let-7b o control. Las células teñidas de azul se tiñeron por Hoechst, y el rojo se añaden EdU-en las células. células EDU-positivos fueron calculados como (EDU adicionales que se encuentran células /células teñidas con Hoechst) × 100%. Columnas, con una media de tres experimentos; bares, Dakota del Sur. *,
P Hotel & lt; 0,05. B, porcentaje de células apoptóticas se incrementó en MDA-MB-435 y SK-MES-1 en las células tratadas con let-7b. La apoptosis se mide por la anexina V-FITC (eje x) y tinción con yoduro de propidio (eje y). Los porcentajes de células apoptóticas (porcentaje de células en el cuadrante superior derecho (anexina V-positivo, PI-negativas), además de las células en el cuadrante de bajo derecho (anexina V-positivo, PI-positivo) en el número de células total) se dan bajo el gráfico correspondiente. Columnas, con una media de tres experimentos; bares, Dakota del Sur. *,
P Hotel & lt; 0,05. C-D, los porcentajes de células apoptóticas y células EDU-positivos fueron analizados en células HeLa y TCA-8113 transfectadas con let-7b o al azar let-7b. células E-F, MDA-MB-435 y SK-MES-1 transfectadas con let-7b fueron tratados con C26 (inhibidor de CYP2J2 específica, 10 M) o 14,15-EET (250 nM). 48 h más tarde, se analizaron los porcentajes de células apoptóticas y células EdU-positivo. Columnas, con una media de tres experimentos; bares, Dakota del Sur. *,
P Hotel & lt; 0,05. G, let-7b sobreexpresión influido expresión de genes relacionados con el tumor en las células MDA-MB-35. sobreexpresión Let-7b en las células MDA-MB-435 downregulated significativamente PI3K, pAkt, y Perk pero aumentó Bax y nm-23 expresión. Los datos mostrados se repitieron tres veces.
También investigamos las influencias de let-7b en la expresión de la proteína proapoptótico Bax y nm-23 proteínas antimetastásica y la activación de la señalización de PI3K /Akt y MAPK vías, las cuales juegan un papel importante en P450 epoxygenase- y la tumorigénesis mediada por EET y la metástasis [10], [11], [12]. Se encontró que la sobreexpresión de let-7b en las células MDA-MB-435 downregulated significativamente la PI3K, pAkt, las vías de pERK pero aumentó Bax y nm-23 expresión (Figura 3G). Resultados similares se observaron también en células MDA-MB-435 que trata con let-7b agomir (Figura S1C y D). Sin embargo, let-7b no afectó PI3K, pAkt, Bax y de las células H9c2 (Figura S2C). Especulamos que esto se debe a que las células H9c2 no tienen
CYP2J2
. Estos resultados indican que el efecto potenciador de CYP2J2 en la formación de tumores podría ser atenuada por let-7b.
Expresión nivel de proteína CYP2J2 y let-7b en el cáncer de pulmón humano y en tejidos normales adyacentes están inversamente correlacionados
Para investigar la asociación entre el nivel de let-7b y la expresión de CYP2J2 en los carcinomas humanos, la expresión de la proteína CYP2J2 y let-7b en 18 emparejado de pulmón cáncer de los tejidos escamosas humanas y tejidos no tumorales adyacentes fue examinado por Western blot y real -Tiempo de RT-PCR, respectivamente. Los resultados mostraron que CYP2J2 fue altamente expresado en la mayoría de las muestras de tejido de cáncer en comparación con los tejidos normales adyacentes (Figura 4A). Real-time RT-PCR se utilizó para determinar los niveles de let-7b maduras en 18 emparejados de pulmón humano tejidos de cáncer escamoso y tejidos no tumorales adyacentes. A pesar de los cambios de los valores -ΔΔCT [- (Ct
no tumoral de tejido? Ct
tejido canceroso)] fueron relativamente leves (de -1.85 a la 5.4, 2.6 ± 1.27), el pliegue del cambio (2
- ΔΔCT) de la expresión let-7b entre 18 emparejado de pulmón humano tejidos de cáncer escamoso y tejidos no tumorales adyacentes fue significativa (de 0,277 a la 42.22, 6.06 ± 2.43). En consecuencia, los resultados mostraron que los niveles de madurez let-7b se redujo significativamente en 14 tumores de pulmón en comparación con sus controles de la misma de entre 18 muestras analizadas (Figura 4B). A continuación se investigó una correlación entre el nivel de expresión let-7b y nivel de proteína CYP2J2 en humanos de pulmón cáncer de los tejidos escamosas. Y no es estadísticamente significativa correlación inversa entre el nivel de expresión let-7b y nivel de proteína CYP2J2 en 18 juegos de cáncer de pulmón y tumores escamosos tejidos no tumorales adyacentes pareados (Figura 4C). Por otra parte, se encontró que los niveles de expresión CYP2J2 tenía inversas para let-7b en cuatro pares de tejidos de cáncer de mama humano y no tumoral adyacente (Figura 4D y E). Y let-7b expresión en SK-MES-1 y las células MDA-MB-435 se muestra en la Figura S3.
A, los niveles de expresión de CYP2J2 en pulmón canceroso (C) y los tejidos no tumorales adyacentes (N) fue medido por análisis de transferencia Western. B, la comparación entre los niveles de expresión de let-7b en tejidos no tumorales de pulmón canceroso y adyacentes (n = 18). A pesar de los cambios de los valores -ΔΔCT [- (Ct
no tumoral de tejido? Ct
tejido canceroso)] son relativamente leves (de -1.85 a la 5.4, 2.6 ± 1.27), las veces los cambios de expresión let-7b entre 18 pares escamosas de cáncer y no tumoral adyacente tejidos del pulmón humano son significativas (0,277 a 42,22, 6,06 ± 2,43). C, relación entre la proteína CYP2J2 y let-7b expresión en el cáncer de pulmón y los tejidos no tumorales adyacentes apareados. El nivel de expresión de la proteína CYP2J2 se incrementó en 13 de las 18 series de cáncer de pulmón en comparación con los tejidos normales adyacentes (el pliegue de cambio & gt; 1). Como era de esperar, los niveles de let-7b se redujeron comúnmente en estos tumores en comparación con los tejidos normales adyacentes (el pliegue de cambio de & lt; 1). D-E, los niveles de expresión de CYP2J2 y let-7b en los tejidos cancerosos y adyacente no tumoral de mama (n = 4). Real-time RT-PCR se utilizó para determinar los niveles de let-7b maduros. El nivel de expresión U6 snRNA se utilizó para normalizar el nivel de let-7b relativa. Columnas, con una media de tres experimentos; bares, Dakota del Sur. *,
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. & Lt; 0,05
let-7b-mediada Desmontables de CYP2J2 inhibe el crecimiento tumoral y la metástasis
Además, se investigó la influencia de dejarlo 7b sobre el crecimiento tumoral en un modelo in vivo. Para generar un modelo de xenoinjerto de tumor, 2 × 10
se inyectaron 6 MDA-MB-435 células por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones desnudos. Dos semanas después de la inyección, cuando los tumores habían crecido hasta aproximadamente 40 mm
3, el let-7b vector de expresión pSilencer-let-7b se inyectó en ratones a una dosis de 4 mg /kg peso corporal a través de la vena de la cola cada 3 semanas. Como se esperaba, los ratones inyectados con pSilencer-let-7b a través de vena de la cola mostró una reducción significativa en el volumen del tumor en comparación con los controles (Figura 5A). Durante el período de tratamiento, se determinó el nivel de 14,15-DHET en la orina de ratones desnudos y encontramos una reducción significativa de la 14,15-DHET en el grupo de tratamiento let-7b en comparación con los controles (Figura 5B). Al final del período de tratamiento, let-7b resultó en una disminución significativamente el peso del tumor, pero el peso corporal no había cambiado (Figura 5C). También tratamos las células MDA-MB-435 con agomir let-7b (150 nM) o agomir de control durante 48 h y, a continuación, inyectamos estas células en el flanco derecho de ratones desnudos. Después de 4 semanas, se realizaron las necropsias y se pesaron todos los tumores por ratón. Let-7b agomir resultó en una disminución significativa del peso del tumor (figura S4). Por otra parte, el nivel de madurez let-7b fue validado por tiempo real de RT-PCR; resultados mostraron que el tratamiento pSilencer-let-7b resultó en un aumento significativo tanto en tumor y órganos (Figura 5D y E). Western blot mostró una marcada disminución del nivel de expresión de la proteína CYP2J2 y un aumento significativo del nivel de expresión de la proteína proapoptótico Bax y nm-23 proteínas antimetastásica en los ratones tratados 7b-let-en comparación con los controles (Figura 5F). Estos resultados sugieren que let-7b puede inhibir la expresión y las funciones de promoción de tumores de CYP2J2. Se inyectaron
MDA-MB-435 células por vía subcutánea en el flanco derecho de ratones desnudos para generar el modelo de ratón de cáncer de mama. Dos semanas más tarde, los ratones recibieron el tratamiento let-7b azar. El vector de expresión let-7b (plásmido pSilencer-let-7b) se inyectó en ratones a través de una vena de la cola a una dosis de 4 mg /kg de peso corporal cada 3 semanas. A, el eje X se marcó como los días de tratamiento pSilencer-let-7b. El volumen del tumor se midió semanalmente y se calcula como la televisión (mm
3) = longitud x anchura
2 × 0,5236. B, la medición del nivel de 14,15-DHET en la orina ratones desnudos se realizó por ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Puntos, con una media de tres experimentos; bares, Dakota del Sur. *,
P Hotel & lt; 0,05. C, peso medio del tumor y el peso corporal de control y de tratamiento de let-7b grupos después del crecimiento durante 8 semanas. Columnas, significan; bares, Dakota del Sur. *,
P Hotel & lt; 0,05 frente al control. D-E, la expresión de la madurez let-7b en los tumores y órganos primarios fue validado por tiempo real RT-PCR. Columnas, con una media de tres experimentos; bares, Dakota del Sur. *,
P Hotel & lt; 0,05. F, análisis de transferencia Western mostró alteración del nivel de expresión de la proteína CYP2J2 y genes relacionados con el tumor de muestras tumorales.
Además, se evaluó si la sobreexpresión de let-7b metástasis afectada. Al final del experimento, se extrajeron los bazos y una incisión vertical para contar las colonias tumorales metastásicas. Metástasis en sección longitudinal del bazo eran visibles a simple vista en forma de nódulos. Se observó una disminución significativa en el número medio de metástasis de bazo en ratones inyectados con pSilencer-let-7b comparación con los controles (Figura 6A). También se determinó la extensión de la metástasis de los ganglios linfáticos mediante la medición del peso de los ganglios linfáticos. Hemos encontrado que la inyección de pSilencer-let-7b a través de vena de la cola reduce el peso medio de los ganglios linfáticos axilares (Figura 6B). Además el análisis histológico después de hematoxilina y eosina de secciones de parafina mostró una marcada diferencia entre los ratones atímicos tratados con let-7b y los controles (Figura 6C y D): el tratamiento let-7b causó un aumento significativo en la incidencia de regiones necróticas en el tumor y bazo. En comparación con el grupo control, los focis metástasis eran más pequeñas y menos en las secciones de bazo del grupo de tratamiento let-7b. Además, la tinción de TUNEL de secciones demostró que el tratamiento let-7b resultó en un aumento significativo de células TUNEL positivas en los tumores y en ratones bazo (Figura 6E y F). Estos datos indican que el tratamiento let-7b puede inhibir la metástasis tumoral.
A, número promedio de metástasis de bazo de cada grupo (n = 6). Columnas, significan; bares, Dakota del Sur. *,
P Hotel & lt; 0,05 frente al control. B, el peso promedio de los nódulos linfáticos axilares para cada grupo. Columnas, significan; bares, Dakota del Sur. *,
P Hotel & lt; 0,05 frente al control. C-D, hematoxilina y eosina tinción de secciones de tumor (C1, C2) y el bazo (D1, D2). E-F, la tinción de TUNEL de tumor (E1, E2) y el bazo (F1, F2) secciones.
Discusión
En el presente estudio, hemos demostrado un nuevo mecanismo para el control de la función de promoción de tumores de CYP2J2. Bioinformática análisis predijo que let-7b es un regulador potencial de
CYP2J2
gen. El uso de líneas celulares de cáncer CYP2J2 de expresión y un modelo xenografs tumorales, hemos demostrado que el ser humano
CYP2J2
se posttranscriptionally regulada por let-7b y que la regulación postranscripcional es responsable de la función de promoción de tumores de CYP2J2. Además, en el cáncer escamoso de pulmón humano y los tejidos no tumorales adyacentes, se observó una relación inversa entre let-7b y CYP2J2 niveles de expresión.
Se ha hecho evidente que microRNAs regulan la expresión de genes diana mediante la unión a las regiones complementarias de la 3'UTR de sus genes diana [26], pero si hsa-let-7b regula la expresión CYP2J2 humana no se conoce. estudio previo ha demostrado que let-7 regula RAS a través de su 3'UTR [27]. En el presente estudio, ensayos de luciferasa mostraron que let-7b reprimió la actividad de la construcción de reporte que contiene la región 3'UTR del ARNm CYP2J2. La transfección de líneas celulares de carcinoma con let-7b y la inyección de pSilencer-let-7b producir madurar let-7b in vivo disminución de la expresión de proteínas CYP2J2 y la actividad enzimática, lo que sugiere que
CYP2J2
se posttranscriptionally regulada negativamente por let-7b.
Los estudios recientes han demostrado que el let-7 podría actuar como un supresor de tumores y que la reducción de let-7 resultados a nivel de gen let-7-sensible (cyclinD, RAS, MYC, etc.) sobreexpresión en tumores [22 ], [23], [24], [25]. Con el análisis de transferencia de Western y en tiempo real de RT-PCR, hemos demostrado una mayor expresión de la proteína CYP2J2 y menor expresión de let-7b en 18 tejidos de cáncer escamoso de pulmón humano pareadas en comparación con los tejidos no tumorales adyacentes. Por lo tanto, la alta expresión de la proteína CYP2J2 en tejidos de cáncer puede resultar de la disminución de expresión de let-7b, al menos en parte. Por supuesto, es probable que otro mecanismo (s) está implicado en la regulación de la expresión CYP2J2. Nuestro estudio anterior mostró que la sobreexpresión de CYP2J2 o additing EETs exógenos disminución de la apoptosis y el aumento de la proliferación celular en líneas celulares de cáncer y aumentaron el crecimiento tumoral y la metástasis de pulmón en un modelo de xenoinjerto murino [10]. Además, hemos encontrado recientemente que el Compuesto 26, el inhibidor selectivo de CYP2J2, reprimió significativamente la función de promoción de tumores de CYP2J2 [12].
En el presente estudio, hemos descrito un nuevo mecanismo para la supresión de CYP2J2. Se han tratado las líneas celulares de carcinoma con let-7b y encontramos que la sobreexpresión de let-7b resultó en disminución de la proliferación y la apoptosis de las células cancerosas activa. También se encontró que el tratamiento pSilencer-let-7b significativamente el crecimiento tumoral inhibido en un modelo de xenoinjerto de tumor. A pesar de regulación a la baja de CYP2J2 por pSilencer-let-7b no dio lugar a la erradicación de los tumores, la correlación inversa entre el nivel de expresión de CYP2J2 y let-7b en el tejido canceroso humano y la eficacia de la inhibición de las funciones de promotores de tumores de CYP2J2 reveló la beneficio terapéutico potencial de let-7b en los cánceres humanos.
en nuestro estudio anterior, se informó de que los EETs protegen a las células endoteliales de la apoptosis mediante la activación de la fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) /Akt y MAPK vías de señalización [25] . En el estudio actual, la sobreexpresión de let-7b suprimió la expresión de la proteína CYP2J2 y sus productos EET in vitro e in vivo. También se encontró que let-7b podría inhibir la proliferación y mejorar la apoptosis, de células tumorales humanas mediante la inhibición de la vía PI3K /Akt y MAPK vías de señalización y mediante la activación de la proteína proapoptótica Bax y la proteína antimetastásica nm-23, ambos de los cuales están involucrados en P450 epoxygenase- y la tumorigénesis mediada por EET y la metástasis [10]. Nuestros datos sugieren que el efecto de EETs derivados de CYP2J2 en la formación de tumores fue mediada por let-7b. Los 11 miembros de la familia let-7 tienen genes diana y funciones similares en la proliferación celular, debido a la gran similitud entre sus secuencias [23], [28]. En el presente estudio, se centró en el efecto de let-7b en la expresión de CYP2J2. Efectos de los otros miembros de la familia let-7 sobre la expresión CYP2J2 y la proliferación de las células cancerosas necesitan más estudios.
En conclusión, nuestros datos confirman que la expresión let-7b es con frecuencia disminuye en cánceres de pulmón de células escamosas. Nuestro trabajo también indicó que CYP2J2 humano está regulado posttranscriptionally por let-7b, que se traduce en la alta expresión de la proteína CYP2J2 en los carcinomas humanos. Nuestro estudio demostró un nuevo mecanismo por el cual la tumorigénesis mediada por EET y CYP2J2- y la metástasis se asocian con let-7b. Además de MYC y RAS, let-7b puede funcionar como un supresor de tumores mediante el bloqueo de CYP2J2.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Este estudio fue aprobado por la Junta de Revisión hospital de Tongji y Tongji Medical College. Los sujetos reclutados dieron su consentimiento informado por escrito. La investigación se ajusta a los principios esbozados en la Declaración de Helsinki. Todos los protocolos experimentales con animales cumplieron con la "Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio", publicado por los Institutos Nacionales de Salud de Estados Unidos.
Líneas Celulares
La línea celular de adenocarcinoma de cuello uterino humano HeLa, línea celular de hepatoma humano HepG2 de hígado, lengua humana carcinoma de células escamosas TCA-8113, y de pulmón humano línea celular de cáncer escamoso SK-MES-1 se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Manassas, Virginia). Las células se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Invitrogen, Carlsbad, California) con 10% de suero bovino fetal (FBS) a 37 ° C en presencia de 5% de CO
2 a humedad constante. La línea celular de carcinoma de mama humano MDA-MB-435 también se obtuvo de la American Type Culture Collection y se cultivó en RPMI 1640 suplementado con 10% de FBS y se mantuvo a 37 ° C en 95% de aire /5% de CO
2 .
predicción MicroARN objetivo
RNAhybrid (http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/cgi-bin/rnahybrid_submit) fue utilizado para la predicción de genes miARN objetivo. Encontramos cuatro sitios diana potenciales (sitio I, el sitio III, IV sitio, y el sitio VI) en el 3'UTR de CYP2J2 humana para let-7b. Además, también comparó la secuencia de let-7b de la secuencia de longitud completa de CYP2J2-3'UTR con el software DNAMAN (LynnonBiosoft, Quebec, Canadá). También encontramos otros dos sitios potenciales bingding (sitio II y sitio de V), además de los cuatro sitios diana potenciales descritos anteriormente (Figura 1A).
Construcción de plásmidos
La secuencia de longitud completa de CYP2J2 humana -3? UTR se amplificó por PCR usando los cebadores 5'-GCGACTAGTGTATCACCATTTCCCCAGTCAGTCA-3 '(cebador CYP2J2-3'UTR-ex) y-3 5'-GCGAAGCTTCATGGGAATAAGTGTCTGATGGAGG' (cebador CYP2J2-3'UTR-reversa). bares, Dakota del Sur. bares, Dakota del Sur. bares, Dakota del Sur.