Extracto
Mediante el uso de una etiqueta de secuencia expresada algoritmo bioinformático, se identificó que
Lin28 homólogo B
(
Lin28B
) pueden tener un patrón de expresión oncofetal lo que puede facilitar la detección de células de cáncer en adultos. También se informa de que es un marcador potencial de las células madre de cáncer. Por lo tanto, hemos tratado de verificar personajes oncofetal-stemness de
Lin28B
y poner a prueba su potencial como marcador de células madre de cáncer como el circulante en pacientes con HCC adultos.
Lin28B
mRNA se examinó en un panel de tejido fetal, tejido adulto y tumores.
Lin28B
se sobre-expresa o hacerlo caer en las células HepG2 para evaluar su potencial como marcador de células madre similares. RT-qPCR para
Lin28B
se realizó en las células mononucleares de sangre periférica de pacientes con HCC recibir cirugía (n = 96) y controles no HCC (n = 60) y se analizaron su importancia clínica.
Lin28B
mostraron un patrón de expresión oncofetal. Su sobreexpresión podría regular al alza marcadores stemness (Oct4, Nanog y SOX2) y mejorar la formación de tumorsphere
in vitro
.
Lin28B
caída tuvo efectos opuestos. Circulantes
Lin28B
se detectó en las células mononucleares de sangre periférica en 3 casos (5%) de los controles no-HCC y 32 casos (33,3%) de los pacientes con CHC. En los pacientes con HCC, que circula
Lin28B
se asoció con alto grado tumoral (p = 0,046), de gran tamaño (p = 0,005), la etapa alta AJCC (P = 0,044) y el estadio BCLC (P = 0,017). Circulantes
Lin28B
se asoció significativamente con una menor supervivencia libre de recurrencia (P & lt; 0,001). Circulantes
Lin28B
separados HCC etapa temprana en 2 curvas de supervivencia sin recidiva (p = 0,003). En el análisis multivariante, que circula
Lin28B
era una variable independiente asociada con la recurrencia precoz (P = 0,045) y la recurrencia de HCC etapa temprana (P = 0,006). En conclusión, el gen oncofetal
Lin28B
es un potencial oncofetal de células de cáncer de tallo como marcador de células tumorales que se correlaciona con la recurrencia del CHC después de la hepatectomía en circulación. Circulantes
Lin28B
podría redefinir las etapas tempranas de la AJCC. Nuestro hallazgo apoya el posible uso de un TNMc (C para las células tumorales circulantes) sistema de estadificación en HCC
Visto:. Cheng S-W, Tsai H-W, Lin Y-J, Cheng P-N, Chang Y-C, Yen C-J, et al. (2013)
Lin28B
es un oncofetal circulante Cáncer de Células Madre-Como el marcador asociado con la recurrencia del carcinoma hepatocelular. PLoS ONE 8 (11): e80053. doi: 10.1371 /journal.pone.0080053
Editor: Xin Wei Wang, del Instituto Nacional del Cáncer, Estados Unidos de América
Recibido: 11 Abril, 2013; Aceptado: 30 de septiembre de 2013; Publicado: 14 Noviembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Cheng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este era con el apoyo de DOH101-TD-C-111-003 subvención del Departamento de Salud, Taiwán, conceder NSC 97-2320-B-006 -027 -MY3 y otorgar NSC-99-2628-B-006-034-MY2 de la Consejo nacional de Ciencia, Taiwán, y NCKUH Beca de investigación (95) N ° 67 del hospital de la Universidad nacional Cheng Kung, Taiwán. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el carcinoma hepatocelular (CHC) es una causa importante de muerte por cáncer en Taiwán y uno de los cánceres más comunes en todo el mundo [1]. Por lo tanto, es imperativo para identificar biomarcadores para predecir el desarrollo de HCC y el resultado clínico. Alfa-fetoproteína (AFP) y glipicano-3 son marcadores tumorales actuales para el CHC. Ambos pertenecen a oncofetal genes que se definen como los genes expresados en los embriones o fetos, apagada o suprimida en el tejido adulto, pero re-expresado en células tumorales [2,3]. oncofetales genes /proteínas tienden a ser buenos marcadores tumorales debido a la baja expresión de fondo en los adultos. En un estudio anterior, hemos utilizado un enfoque bioinformático y experimental combinado para buscar nuevos genes oncofetales [4]. Se categorizaron 6118 etiqueta de secuencia expresada (EST) bibliotecas en 3 grupos: inmaduros (n = 483), maduro (n = 1.724), y el tumor (n = 3911). Mediante el uso de las frecuencias calculadas del gen AFP en cada grupo como referencia para establecer los umbrales de análisis bioinformático, se identificaron 44 genes desconocidos con éxito con los posibles patrones de expresión oncofetales. Uno de los genes, LRRC16B se estudió más [4]. El resultado apoya que este algoritmo bioinformático puede llevar a cabo genes oncofetales con funciones importantes. También estuvieron presentes en nuestra lista de genes es el gen
Lin28 homólogo B Opiniones (
Lin28B
), que era desconocido en ese momento. Las frecuencias calculadas de
Lin28B
gen en las bibliotecas de inmaduros, y grupos tumorales maduros fueron 22, 5 y 28, respectivamente, con una relación entre los grupos maduros tumoral y tumoral (/maduro) estimado en 5,6 (Tabla S1 ).
Los homólogos mamíferos de lin-28,
Lin28
y
Lin28B
, se microARN proteínas de unión. Regulan let-
7 fotos: por la unión a la terminal de bucle de
let-7
familia precursores miARN y bloquear su transformación en miRNAs maduros, lo que resulta en la desrepresión de
let-7
objetivos, como
K-ras
y
c-Myc
[5,6].
Lin 28
es altamente expresado en embriones y células madre embrionarias [7]. Se puede reprogramar fibroblastos somáticos humanos para la pluripotencia cuando se co-expresada con
Oct4
,
Nanog
y
Sox2
[8]. Por lo tanto,
Lin28
puede implicar en el desarrollo embrionario y el mantenimiento de las células madre embrionarias. En cuanto a
Lin28B
, es capaz de promover la proliferación celular y la transformación, pero su función en el desarrollo embrionario sigue siendo poco clara [9-11].
Lin28B
se expresa frecuentemente en HCC y se asocia con un mal pronóstico de los pacientes, en comparación con
Lin28
[9-13]. Desde
Lin28
es conocido por ser un marcador de las células madre, que predijo
Lin28B
también se relaciona con stemness celular y es potencialmente un marcador para las células madre del cáncer. Tal idea fue apoyada por publicaciones recientes en las que
Lin28B
ha demostrado ser asociado a la troncalidad de líneas celulares de cáncer de próstata y de colon [14,15].
transcripción inversa cuantitativa en tiempo real PCR (RT-qPCR) de células separadas-Ficoll o la capa leucocitaria se ha utilizado para detectar la transcripción de las células tumorales como un sustituto para la detección de células tumorales circulantes (CTC) [16-20] . Para disminuir el nivel de fondo y aumentar la potencia de la diferenciación, los marcadores ideales deben tener baja probabilidad que se expresa en las células blancas de la sangre o células endoteliales. Sería aún mejor si no se expresan en cualquier tejido adulto en absoluto. Por lo tanto, en teoría, los genes oncofetales deben ser buenos marcadores tumorales en muestras de sangre periférica. Desde
Lin28B
es un candidato oncofetal gen que posiblemente esté relacionado con fenotipos de células madre, que es un potencial marcador tumoral sustituto para detectar el cáncer de células madre que han demostrado tener un valor altamente predictivo de recurrencia del cáncer y la metástasis [circulantes ,,,0],21,22].
por lo tanto, el propósito de este estudio fue verificar las características duales oncofetales y de células madre de cáncer de
Lin28B
y evaluar su importancia clínica cuando se detecta en las células circulantes en pacientes con HCC. La hipótesis planteada fue que circula
Lin28B
ha detectado en las células mononucleares de sangre periférica es un marcador de cáncer oncofetal-tallo-célula-como asociado con la recurrencia o peor supervivencia en el CHC.
Materiales y Métodos
líneas celulares tumorales
Las líneas celulares utilizadas en este estudio fueron hepática humana (Huh-7, HepG2 y PLC /PRF /5), de ovario (PA-1, TOV-21G, SK-OV -3, BG-1, NIH: OVCAR-3, y ES-2), renal (786-O y ACHN), la vejiga (T24 y TSGH-8301), mama (MCF-7), pulmonar (A549), y de colon (SW480) líneas celulares de cáncer. Huh-7 se obtuvo de JCRB. HepG2, PLC /PRF /5, PA-1, TOV-21G, NIH: OVCAR-3, ES-2, MCF-7, SW480, T24 y TSGH-8301 se obtuvieron de BCRC. A549 se obtuvo de ATCC. SK-OV-3 y BG-1 fueron una especie de regalo del Prof. Tzu-Hao Wang [23]. 786-O y ACHN fueron una especie de regalo del Prof. Yeong-Shiau Pu [24]. A549, NIH: OVCAR-3, SK-OV-3, y BG-1 se mantuvieron en DMEM /F12. T24, TSGH-8301, Huh-7, HepG2, MCF-7 y SW480 se mantuvieron en DMEM. 786-O y ACHN se mantuvieron en RPMI1640. PLC /PRF /5 y PA-1 se mantuvieron en MEM. ES-2 se mantuvo en 5a de McCoy. TOV-21G se mantuvo en MCDB105 y M199 (1: 1). Todos los medios se complementaron con 10% de suero bovino fetal, 100 U /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina (Gibco, Grand Island, NY, EE.UU.) con 5% de CO2 a 37 ° C.
Las bibliotecas de ADNc y emparejados muestras de tumor y el tejido no tumoral
Las bibliotecas de ADNc fetal adquiridos a BioChain (Hayward, CA, EE.UU.) se compararon con bibliotecas de ADNc de adultos humanos normales adquiridos de Clontech (Becton-Dickenson, Franklin Lakes, NJ). emparejado tumor y el tejido no tumoral de varios órganos se recogieron de pacientes ingresados para cirugía en el Hospital de la Universidad Nacional Cheng Kung, en Tainan, Taiwán.
clasificación celular magnética para enriquecer células EpCAM +
EpCAM-positivas PLC /PRF /5, las células Huh-7 y HepG2 se aislaron mediante clasificación celular magnética (MCS) utilizando partículas magnetizables monodispersed de acuerdo con la instrucciones del fabricante (Cellection
TM Pan ratón kit IgG) usando el anticuerpo anti-EPCAM (Epitomics, Burlingame, CA). EpCAM
+ y EpCAM
- células PLC /PRF /5, Huh-7 y HepG2 fueron zadas para los ensayos de Western blot
infección retroviral
Se utilizó un sistema de retrovial. sobreexpresan
Lin28B Hoteles en las líneas celulares de HCC. pMSCVpuro (BD Clontech), los vectores de pMSCV-LIN28B y pSUPERretro se co-transfectaron en células de paquetes GP2-293T con plásmidos VSV-G utilizando el método de fosfato de calcio para 48 h. El celular HepG2 se sembró en 1 × 10
6 células por pocillo en una placa de 6 cm y se incubaron durante la noche bajo 5% de CO
2 a 37 ° C. Retrovirales sobrenadante se añadió con 8 ng /ml de polibreno (Sigma, St Louis, MO, USA), y se utiliza para infectar células HepG2. Se seleccionaron las poblaciones de células HepG2 expresan bien agrupados o pMSCVpuro pMSCV-LIN28B con 0.7μg /ml de puromicina (Sigma-Aldrich, St Louis, MO).
shRNA producción lentivirus
Se utilizó un lentiviral shRNA sistema para derribar
Lin28B Hoteles en las líneas celulares de HCC. plásmidos que expresan pLKO.1 pequeña horquilla RNA (shRNA) fueron adquiridos de la Instalación Nacional de ARNi Core (Academia Sinica, Taipei, Taiwán). Las partículas de lentivirus se obtuvieron del ARNi Core, el Centro de Investigación de Medicina Clínica, Hospital de la Universidad Nacional Cheng Kung. Para derribar la expresión Lin28B, el shRNA de
Lin28B gratis (TRCN0000219860, orientar secuencia: 5'-CATAACAGGTCTTCTTCATAT-3 ') fue aprobado. Un plásmido pLKO_TRC005 se utilizó como control negativo.
Western blotting
células recogidas se disolvieron por tampón de lisis (lisis completa M, EDTA libre, Roche) en hielo y se centrifugaron a 10.000 xg, 4 ° C durante 20 minutos. Entonces, 100μg de proteína se cargó y se separó por 12% SDS-PAGE y se transfirió a una membrana de fluoruro de polivinilideno (Millipore, Billerica, MA, EE.UU.). Baja cantidad de proteína (40μg) se cargó en la clasificación celular magnética ensayo debido al número de células total menor recogida. Los anticuerpos primarios incluidos conejo anti-Lin28B (tecnología de señalización celular), ratón anti-Oct4 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), de conejo anti-Nanog (Epitomics, Burlingame, CA), de conejo anti-Sox2 (Epitomics, Burlingame, CA ), de conejo anti-EpCAM (Epitomics, Burlingame, CA) y el ratón anti-β-actina (Millipore).
Esfera ensayo de formación de
ensayo de formación de Esfera se llevó a cabo como se describe anteriormente [25]. Brevemente, las células HepG2 se sembraron en placas de cultivo de 6 pocillos no recubiertos (BD Labware, Bedford, MA) en DMEM /F-12 medio libre de suero (cajón) contenían 1% NEAA MEM, 1X N2, 20 ng /ml de EGF, 10 ng /ml bFGF, 100 mg /ml de penicilina G, y 100 U /ml de estreptomicina (Invitrogen, Grand Island, NY). Después de 9 días de cultivo, los pocillos se examinan bajo un microscopio invertido con un aumento de x20, y el número de esferas de & gt;. 50 micras de diámetro fueron contados bajo un microscopio de luz
Los pacientes, muestras y datos clínicos
ciento diecinueve pacientes que tenían HCC primaria se sometió a una hepatectomía en el hospital de la Universidad Nacional Cheng Kung desde enero de 2006 hasta diciembre de 2011, se incluyeron. Antes de la cirugía muestras de sangre entera fueron enviados a la recogida de células mononucleares de sangre periférica. Los pacientes con un diagnóstico previo de cáncer, metástasis a distancia antes de la hepatectomía, márgenes quirúrgicos positivos, fueron excluidos de un diagnóstico de colangiocarcinoma hepatocellur-combinada (CHC), o la mala calidad del ARN de la muestra. Diez pacientes fueron excluidos debido a un margen quirúrgico positivo o un diagnóstico de CHC y 13 pacientes fueron excluidos debido a la mala calidad del ARN de la muestra. Los 96 pacientes restantes se incluyeron en estudio (Figura S1). El intervalo de seguimiento fue de cada 3 meses. La recurrencia de HCC fue documentado en los hallazgos típicos de la tomografía computarizada o resonancia magnética con o sin nivel de AFP en suero elevada o la confirmación patológica. la supervivencia libre de recurrencia (RFS) se definió como el tiempo desde la cirugía hasta la primera aparición de recidiva local o distante. la supervivencia específica de la enfermedad (DSS) se definió como el tiempo desde la cirugía hasta la muerte relacionada con HCC. Los sujetos fueron censurados en la última cita de seguimiento o en la muerte sin recurrencia. Los perfiles de los pacientes de los 96 pacientes con HCC se muestran en la Tabla S2. La duración media de seguimiento fue de 19,7 meses (rango, 0.1-41.5 meses). Cuarenta pacientes (41,7%) tenían HCC recurrente (duración media hasta la recurrencia, 7 meses; rango, 1.5-31.6 meses), incluyendo la recurrencia local en 32 pacientes, metástasis en 5 pacientes, y tanto la recurrencia local y metástasis en 3 pacientes. Diez pacientes (10,4%) murieron de HCC (supervivencia media, 13,8 meses; rango, 1.6-21.9 meses). A modo de comparación, también se incluyeron 60 individuos sin HCC (grupo de no-HCC): 31 individuos sanos sin una enfermedad del hígado y 29 pacientes con hepatitis viral, incluyendo 8 pacientes con cirrosis (16 VHB y VHC 13). La edad media de los individuos sanos sin enfermedad hepática fue de 44,1 años (rango, 20-75 años, 10 hombres y 21 mujeres), y de los pacientes con hepatitis era de 49,4 años (rango, 24-67 años, 20 hombres y 9 mujeres ).
el consentimiento informado por escrito se obtuvo de cada paciente y el protocolo de estudio se ajusta a las directrices éticas de la Declaración de Helsinki 1975, como se refleja en una aprobación a priori por el experimento humano y el Comité de Ética de la Universidad Nacional Cheng Kung hospital en Tainan, Taiwán.
preparación de la muestra de sangre periférica
Las muestras de sangre se recogieron en tubos libres de pirógenos 10 ml con 0,12 ml de K
3EDTA 15% (BD Vacutainer K
3EDTA; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) y luego en capas en volúmenes iguales de gradiente de densidad de Ficoll-Hypaque (HISTOPAQUE-1077; Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania). células mononucleares de sangre periférica se recuperaron de la interfase. Los sedimentos celulares se lavaron y se recogieron para posterior extracción de RNA.
ARN extracción
ARN total de líneas de células y tejidos primarios se extrajeron usando el reactivo Trizol (Life Technologies, Carlsbad, CA). El ARN de las muestras de sangre se extrajo usando un kit (ARN QIAamp Blood Mini Kit; Qiagen). De acuerdo a los protocolos del fabricante
inversa-reacción en cadena de la polimerasa de transcripción (RT-PCR) y transcripción inversa cuantitativa en tiempo real PCR ( RT-qPCR)
ARN
2 mg fue transcrito inversamente utilizando superíndices II (Invitrogen, Grand Island, NY). Las secuencias de los cebadores semicuantitativo RT-PCR se muestran en la Tabla S3.
β-actina
se utilizó como gen de control interno de RT-PCR. El ADNc fue sometido a RT-qPCR utilizando un sistema LightCycler (Roche, Mannheim, Alemania). Para RT-qPCR en varios órganos adultos fetal y normal y muestras de sangre, los niveles de
Lin28B
se normalizaron a
GAPDH
que ha sido utilizado como un gen de referencia en la detección de células tumorales circulantes [19 , 26]. Para las muestras de hígado y tejido HCC, los niveles de
Lin28B
se normalizaron a
tirosina 3-monooxigenasa /triptófano proteína de activación 5-monooxigenasa, polipéptido zeta
(
PLA
) en vez de
GAPDH
porque había una amplia gama de variación en los niveles de expresión de
GAPDH Estar entre las muestras de hígado y tejidos HCC.
PLA
tenía un nivel de expresión medio en el tejido del hígado [27] y sus niveles de expresión eran más estables entre muestras de tejido HCC. Ambos cebadores y sondas RT-qPCR se compraron (Applied Biosystems; secuencias no mostrados) o sintetizarse según el diseño de la sonda LightCycler Diseño de Software 2.0. Tanto las sondas TaqMan fluorescentes y las secuencias de cebadores de amplificación diseñados se enumeran en la Tabla S4. Cada curva estándar se calcula con diluciones seriadas (10
0-10
6 copias) de las plantillas de plásmidos. El ciclo umbral (Ct) de las muestras se convirtió en el número de copias del ARNm utilizando las curvas de calibración derivadas de diluciones en serie de construcciones de
Lin28B
y
GAPDH
, respectivamente. El ácido nucleico extraído de células HepG2 se utilizó como control positivo. Se incluyó un control negativo en el que el total de ARN plantilla fue reemplazado por agua estéril. El rango dinámico de la RT-qPCR para
Lin28B
era 10-10
6 copias de plantillas de plásmido (Figura S2). Un valor Ct de menos de 38 y mayor que cero indica la expresión positiva de
Lin28B
gen, mientras que un valor Ct igual o mayor que 38 o ningún valor Ct indica la expresión del gen negativo
Lin28B
.
El análisis estadístico
La diferencia en la formación entre tumorsphere
Lin28B
expresando y líneas celulares -knockdown se puso a prueba utilizando importancia para los estudiantes de
t-test
.
Lin28B
la expresión de ARNm en la sangre periférica se comparó entre los grupos utilizando la prueba de suma de rangos de Wilcoxon y se correlacionó con indicadores clinicopatológicas utilizando la prueba de chi-cuadrado o la prueba exacta de Fisher. las curvas y las probabilidades de supervivencia se estimaron utilizando el método de Kaplan-Meier, y se utilizó la prueba de log-rank para evaluar la significación de la diferencia entre los grupos. Se utilizó una licencia-un-out validación cruzada para determinar un valor de corte asociado con la supervivencia. Se utilizó un modelo de regresión de riesgos proporcionales de Cox univariante y multivariante para determinar la importancia de los diferentes factores pronósticos. Los análisis multivariados se ajustan simultáneamente por edad, sexo, tipo de infección viral, cirrosis, el grado del tumor, el estado de los tumores multifocales, nódulos satélites, invasión vascular, el tamaño del tumor,
American
Conjunto
Comité
en
cáncer
etapa (AJCC 7ª edición) , Barcelona-Clinic Liver Cancer (BCLC) etapa y AFP en suero. La significación estadística se fijó en
P Hotel & lt; 0.05. El análisis de las muestras de sangre periférica de 96 pacientes tendrá un 80% de potencia para detectar un riesgo relativo de 2,2 entre los
Lin28B gratis (+) y
Lin28B CD - pacientes con HCC (). Los supuestos de riesgos proporcionales fueron verificados por la martingala y la desviación gráficos de diagnóstico y ninguna desviación significativa de los supuestos del modelo de regresión de riesgos proporcionales existía.
Resultados
Las características de oncofetales Lin28B
Para probar si
Lin28B
es un gen oncofetal, su expresión fue examinado en un panel de ARN total humano (Master Panel II, BD Clontech) mediante RT-PCR (Figura 1A).
Lin28B
se expresa en cerebro fetal, hígado fetal, placenta adulto normal, los testículos, el cerebro y la médula espinal. No se expresó en otros tejidos adultos. El cambio de expresión de fetal a los tejidos adultos se cuantificó por RT-qPCR utilizando ARN total seleccionado de Fetal Humano tejido normal (BioChain) y los paneles Panel Master II (BD Clontech) de tejidos (Figura 1B).
Lin28B
se expresó en los órganos del feto, pero fue significativamente las reguladas en sus homólogos adultos, excepto en el cerebro.
A, RT-PCR mostró que
Lin28B
se expresa en el cerebro del feto y en el hígado y en los testículos, cerebro, la médula espinal y la placenta adulta. No se detectó en otros tejidos adultos. B, RT-qPCR mostró que
Lin28B
se downregulated notablemente del feto (barra cerrada) a los tejidos excepto en el cerebro adulto (barra libre). C, RT-qPCR se realizó utilizando pares de HCC (barra cerrada) y los tejidos del hígado no tumoral (barra libre). se observó en 8 muestras de HCC (53,3%); sobreexpresión de
Lin28B gratis (100 x & gt). NC, control negativo; PC, control positivo.
Para el cribado posible
Lin28B
expresión en diferentes tipos de tumores, RT-PCR se realizó en varias líneas celulares de cáncer humano.
Lin28B
se pudo detectar en el ovario, hepática, y las líneas celulares de cáncer colorrectal (Figura S3). Para examinar su expresión en tumores, RT-PCR se realizó en cinco casos de los tejidos tumorales y no tumorales emparejadas de 5 tipos de cánceres comunes (figura S4).
Lin28B
se sobreexpresa en algunos de los tumores de mama (1/5), útero (1/5), de pulmón (4/5), el hígado (1/5), y el ovario (1/5) , pero se expresó en niveles muy bajos en el tejido no tumoral. RT-qPCR para
Lin28B
expresión se llevó a cabo adicionalmente en 15 pares de tejido tumoral y no tumoral de HCC (Figura 1C). La sobreexpresión de la
Lin28B gratis (& gt; 100 veces) se observó en 8 muestras de tejido tumoral (53,3%). Estos resultados confirman la naturaleza oncofetal de
Lin28B
. Dos muestras de tejido hepático no tumoral (13%) mostraron bajo nivel de
Lin28B
expresión. Microscópicamente, una de estas dos muestras mostraron cirrosis con gran cambio de célula focal y el otro mostró hepatitis crónica con actividad interfaz suave. Los hallazgos histológicos mostraron ninguna diferencia obvia de los de las 13 muestras de tejido hepático no tumorales sin
Lin28B
expresión, en el que siete casos mostraron cirrosis y 6 casos mostraron hepatitis crónica con actividad de la interfaz. Cuatro casos se observó el cambio de células grandes y uno de los casos mostraron el cambio de células pequeñas.
La expresión elevada de Lin28B en EpCAM enriquecida con células madre-al igual que la población
EpCAM es un marcador de superficie que se informó de poder para enriquecer la hepática tallo-célula como población [28]. Por lo tanto, para investigar si
Lin28B
se expresa en las células madre de cáncer, se realizó clasificación celular magnética (MCS) para separar las líneas celulares de HCC en EpCAM
+ y EpCAM
- poblaciones. El nivel de proteína Lin28B se incrementó en EpCAM
+ PLC /PRF 5 células /y Huh-7 células (Figura 2A, panel superior), junto con el aumento de los niveles de marcadores de células madre, Sox2, Nanog y Oct4 en PLC /PRF 5 /células y SOX2 y Oct4 en células Huh-7 (Figura 2A, panel inferior). Por el contrario, EpCAM de captura no enriquecer la población de células madre similares en las células HepG2, ya que no había ninguna diferencia de Sox2, Nanog, o la expresión de Oct4 entre EpCAM
+ y EpCAM
- células HepG2 (Figura 2A, panel inferior). Lin28B también mostró diferencias entre estas dos poblaciones (Figura 2A, panel superior). Tomados en conjunto, nuestros resultados apoyan la idea de que Lin28B se expresa en subpoblaciones de células madre similares a las del cáncer. Los análisis
Western blot mostró que Lin28B se sobreexpresa en EpCAM capturado
+ PLC /PRF /5 células y Huh- 7 células, pero no en EpCAM
+ células HepG2 (a, panel superior). EpCAM
+ PLC /PRF /5 células demostrado niveles elevados de Sox2, Oct4 y Nanog; EpCAM
+ Huh-7 células, Sox2 y Oct4; pero EpCAM
+ células HepG2, ninguno (A, panel inferior). Lin28B-pMSCV HepG2cells mostró niveles de Oct4, Nanog, Sox2 y EpCAM en western blot (B) aumenta y formó más esferas que las células de control del vector (P = 0,032) (C). Las células SH-Lin28B HepG2 mostraron una disminución de los niveles de Oct4, Nanog, Sox2 y EpCAM en western blot (D) y tendían a formar un menor número de esferas que las células de control del vector (P = 0,059) (E). sh-Lin28B PLC /PRF /5 células y las células Huh-7 también disminuir la expresión de marcadores de células madre (F). Menor cantidad de proteína (40μg) se cargó en el ensayo de MCS que eso (100μg) cargado en la
Lin28B
-overexpression ensayo debido a la menor cantidad de células totales recogidas en el ensayo de MCS. Diferentes sistemas virales fueron utilizados en los experimentos: retrovirus en
Lin28B
sobreexpresión de ensayo y lentivirus en
Lin28B
knock-down ensayo. El crecimiento celular fue más lenta cuando están infectadas con lentivirus. MCS, separación celular magnética. La barra de escala en C y E, 50 micras.
Aumento en stemness vitro con Lin28B sobreexpresión
Debido a que por células EpCAM no podía enriquecer el
Lin28B
expresando el vástago al igual que la población en las células HepG2, establecimos un
Lin28B
-overexpression HepG2 equipo estable por una infección retroviral para investigar el efecto de Lin28B en fenotipos similares a las células madre. marcadores de células madre representativos se analizaron por transferencia Western. En comparación con el control de vectores, Lin28B sobreexpresión regulada positivamente los marcadores de células madre: Sox2, Nanog, y EpCAM. Un aumento leve de Oct4 también se observó (Figura 2B).
Para determinar el efecto de
Lin28B
el tumor esfera-formación, tanto
Lin28B células que expresan
y control se cultivaron en suspensión para generar esferas como un indicador de un cáncer de tallo como la propiedad
in vitro
[25,29,30]. Como se muestra en la Figura 2C,
Lin28B
que expresan las células HepG2 mostraron un aumento tumorsphere formación de capacidad en comparación con las células de control del vector (P = 0,032).
Por el contrario, derribando
Lin28B
en la línea celular HepG2 downregulated la expresión de Oct4, Nanog, Sox2 y EpCAM (Figura 2D) y tendió a reducir la formación tumorsphere (P = 0,059) (Figura 2E). Por otra parte, derribando
Hoteles en Lin28B 5 células PLC /PRF /y células Huh-7 también regulado por disminución de la expresión de los marcadores de células madre (Figura 2F).
Detección de Lin28B mRNA en el periférico células de la sangre de los pacientes HCC
RT-qPCR se aplicó a examinar la expresión de
Lin28B
en la sangre periférica células circulantes. La reacción fue lineal desde 10 hasta 10
6 copias de plantillas de plásmido purificado (Figura S2). La expresión de
Lin28B
se pudo detectar cuando una célula HepG2 se agrupó con 10
7 leucocitos en aproximadamente 3 ml de sangre entera (Figura S5). Sobre esta base,
Lin28B
mRNA se detectó en 3 casos (5%) de los controles no-HCC (1 en el grupo sano y 2 en el grupo de la hepatitis) y en 32 casos (33,3%) del grupo CHC (figura 3A). La gama de Ct fue 30,57 a 37,94 para las muestras positivas.
Lin28B
se expresó en 3 casos (5%) en los controles no HCC (1 en el grupo sano y 2 en grupo hepatitis) y en 32 casos (33,3%) en el grupo HCC. (Bar: media; dot Negro: no detectable) (A). Los pacientes con HCC recurrente tenían significativamente más altos niveles de expresión de
Lin28B
que los pacientes sin HCC recurrente. (P & lt; 0,001). (Bar: media; dot Negro: no detectable) (B). De Kaplan-Meier análisis mostró que
Lin28B
se asoció significativamente con una menor supervivencia libre de recurrencia (P & lt; 0,001) (C). Relación de
Lin28B
/
GAPDH ARNm
mayor que 10
-3 tendido a asociar con la supervivencia específica de la enfermedad (p = 0,094) (D).
Lin28B
se asoció significativamente con una menor supervivencia libre de recurrencia en la etapa AJCC pacientes I-II (p = 0,003) (E), pero no en pacientes en estadio IIIA AJCC-IVA (P = 0,419) (F).
Lin28B
se asoció significativamente con una menor supervivencia libre de recurrencia en AJCC estadio I (p = 0,030) (G) y los pacientes en estadio II (P = 0,030) (H).
los pacientes con HCC recurrente tenían significativamente más altos niveles de expresión de
Lin28B
que aquellos sin recurrencia (P & lt; 0,001) (Figura 3B). La expresión de
Lin28B Hoteles en células circulantes se asoció significativamente con el hígado no cirrótico (P = 0,021), alto grado tumoral (p = 0,046), de gran tamaño tumoral (p = 0,005), la etapa alta AJCC (P = 0,044) y la etapa BCLC (P = 0,017) (Tabla 1). El nivel de circulante Lin28B tenido una asociación significativa con la etapa de alta BCLC (fase B a enfermedades C frente a A1 a enfermedades A4) (P = 0,022) (Figura S6A) y tenía una significación marginal en asocia con una elevada etapa AJCC (IIIC al IVA enfermedades frente a I a IIIB enfermedades) (P = 0,066) (Figura S6B). El análisis de Kaplan-Meier mostró que el circulante
Lin28B
se asoció significativamente con la disminución de la SSR (P & lt; 0,001) (Figura 3C). La expresión de
Lin28B Hoteles en células circulantes no se asoció significativamente con la disminución del DSS (P = 0,140). Mediante el uso de un método de validación cruzada de dejar uno de salida, relación de
Lin28B /GAPDH ARNm
mayor que 10
3 (n = 15) tendían a ser asociado con una disminución de DSS (P = 0,094) ( Figura 3D). Factores
Grupo
Lin28B gratis (-) (%)
Lin28B gratis (+) (%)
P
-valor
Edad & lt; 60 años old35 (70) 15 (30) años 0.470≥60 old29 (63) 17 (37) SexMale46 (67) 23 (33) 1.000Female18 (67) 9 (33) Virus infectionNone10 (83) 2 (17) 0.551HBV34 (61) 22 (39) HCV16 (67) 8 (33) HBV + AVC4 (100) 0 (0) CirrhosisAbsent28 (56) 22 (44) 0.021
* Present36 ( 78) 10 (22) tumor grade1-255 (71) 22 (29) 0.046
* 39 (47) 10 (53) multifocal tumorsAbsent53 (65) 28 (35) 0.551Present11 (73) 4 (27) noduleAbsent51 satélite (67) 25 (33) 0.859Present13 (65) 7 (35) tamaño tumoral & lt; 5 CM45 (78) 13 (22) 0,005
* ≥ 5 CM19 (50) 19 (50) vascular invasionAbsent35 (71) 14 (29) 0.312Present29 (62) 18 (38) AJCC stageI, II y IIIA, IIIB62 (70) 27 (30) 0,044
* IIIC, IVA2 (29) 5 (71) BCLC stageA1-A441 (77) 12 (23) 0,017
* B-C23 (53) 20 (47) suero AFP los niveles de & lt; 50 ng /ml44 (73) 16 (27) 0.074≥ 50 ng /ML20 (56) 16 (44) Tabla 1. Correlación de circulación
Lin28B
resultados de la prueba con indicadores clinicopatológicas de carcinoma hepatocelular.
* P & lt; 0,05. El grado del tumor por el sistema de clasificación Edmondson y Steiner. AJCC, Comité Conjunto sobre el Cáncer 2010; BCLC, Barcelona-Clinic Liver Cancer; AFP, alfa-fetoproteína. CSV Descargar CSV
El análisis univariante reveló que el grado del tumor (p = 0,047), la invasión vascular (p = 0,038), la etapa AJCC (P & lt; 0,001), BCLC etapa (P = 0,030) y circulando
Lin28B
(P = 0,001) se asociaron significativamente con la disminución de la SSR (Tabla 2). En el modelo multivariado, la cirrosis (p = 0,043), AJCC etapa (P = 0,001) y circulando
Lin28B gratis (P = 0,047) fueron variables independientes asociadas con la disminución de la SSR (Tabla 2). El grado del tumor (p = 0,035), la etapa AJCC (P & lt; 0,001), la AFP en suero (P = 0,014) y circulando
Lin28B gratis (P = 0,001) se asociaron significativamente con la recurrencia precoz de menos de un año en el univariante modelo (Tabla 3). AJCC etapa (P = 0,004) y circulando
Lin28B gratis (P = 0,045) se asociaron significativamente con la recurrencia precoz de menos de un año en el modelo multivariado (Tabla 3). En cuanto a DSS, nódulo satélite (P = 0,047) y la etapa AJCC (P = 0,046) fueron las variables independientes en el análisis multivariado (Tabla S5). Sin embargo,
Lin28B /GAPDH ARNm
mayor que 10
-3 no era un parámetro independiente de DSS.
RFS RFS
univariante multivariante
Factor
Grupo
HR
95% IC
P
HR
95% CI
*Tumor stage<0.001
*0.001
*I/II~IIIB3.421(1.396-8.385)4.929(1.293-18.785)I/IIIC~IVA36.35(3.731-353.236)50.281(4.202-601.720)BCLC stage0.030
*0.085A1/A2-A42.986(1.209-7.374)3.632(1.073-12.288)A1/B-C2.361(1.124-4.961)3.320(0.730-15.110)Serum ng/ml1.642(0.876-3.076)0.1220.778(0.323-1.873)0.575Lin28B-/+2.918(1.559-5.463)0.001
*2.248(1.012-4.995)0.047
*Table 0.05. years0.616(0.293-1.295)0.2010.479(0.189-1.215)0.121SexMale/female0.570(0.233-1.396)0.2190.742(0.276-2.000)0.556Viral /Both1.152(0.104-12.724)2.777(0.156-49.508)Cirrhosis-/+0.576(0.104-12.724)0.1470.437(0.153-1.250)0.123Tumor stage<0.001
*0.004
*I/II~IIIB3.782(1.521-9.405)4.040(0.948-17.221)I/IIIC~IVA37.631(3.860-366.894)47.592(3.692-613.500) stage0.0630.304A1/A2-A42.015(0.639-6.351)2.532(0.606-10.582)A1/B-C2.856(1.190-6.850)2.787(0.536-14.502)Serum ng/ml2.457(1.198-5.038)0.014
*0.964(0.344-2.698)0.944Lin28B-/+3.637(1.749-7.563)0.001
*2.649(1.022-6.862)0.045
*Table 0.05.