Extracto
Los anestésicos locales se utilizan con frecuencia en la aspiración con aguja fina de lesiones de la tiroides y el control locorregional de cáncer de tiroides persistente o recurrente. La evidencia reciente sugiere que los anestésicos locales tienen un amplio espectro de efectos que incluyen la inhibición de la proliferación celular y la inducción de la apoptosis en tipos neuronales y otras de células. En este estudio, hemos demostrado que el tratamiento con lidocaína y bupivacaína resultó en una disminución de la viabilidad celular y la formación de colonias tanto de 8505C y K1 en una forma dependiente de la dosis. La lidocaína y la bupivacaína inducida por apoptosis y necrosis en altas concentraciones, como se determina por citometría de flujo. La lidocaína y la bupivacaína causadas interrupción del potencial de membrana mitocondrial y liberación de citocromo c, acompañada por la activación de la caspasa 3 y 7, la escisión de PARP, y la inducción de una mayor proporción de Bax /Bcl-2. Sobre la base de microarray y análisis de la vía, la apoptosis es el cambio prominente transcripcional común a la lidocaína y la bupivacaína tratamiento. Por otra parte, la lidocaína y la bupivacaína atenuadas 1/2 (/2 ERK1) actividad de la quinasa regulada por señales extracelulares e indujeron la activación de la proteína p38 quinasa activada por mitógenos (MAPK) y c-Jun N-terminal quinasa. inhibidores farmacológicos de MAPK /ERK quinasa y p38 MAPK suprimen la activación de caspasa 3 y la escisión de PARP. Tomados en conjunto, nuestros resultados, por primera vez demuestran los efectos citotóxicos de los anestésicos locales sobre las células del cáncer de tiroides y implican las vías de MAPK como un mecanismo importante. Nuestros hallazgos tienen relevancia clínica potencial en que el uso de anestésicos locales puede conferir beneficios no reconocidos previamente en el manejo de pacientes con cáncer de tiroides
Visto:. Chang YC, Hsu YC, Liu CL, Huang SY, Hu MC, Cheng SP (2014) Anestésicos locales inducir la apoptosis en células de cáncer de tiroides humano a través de la proteína quinasa activada por mitógenos Camino. PLoS ONE 9 (2): e89563. doi: 10.1371 /journal.pone.0089563
Editor: Yong Jiang, de la Universidad Médica del Sur, China
Recibido: 25 de Septiembre, 2013; Aceptado 22 de enero de 2014; Publicado: 21 Febrero 2014
Derechos de Autor © 2014 Chang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas de Consejo Nacional de Ciencia de Taiwán (NSC 100-2314-B-195-001-MY3), y desde Mackay Memorial hospital (MMH-10206 y MMH-e-101-10). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de tiroides es el más común de todos los cánceres del sistema endocrino, y la incidencia de cáncer de tiroides está aumentando en todo el mundo [1], [2]. La mayoría de los cánceres de tiroides son bien diferenciados con carcinoma papilar y folicular de tiroides siendo los tipos más comunes. Aunque el cáncer de tiroides bien diferenciado tiene un pronóstico favorable en general, las tasas globales de recurrencia podría ser tan alta como 35% [3]. enfermedad persistente o recurrente se produce en gran medida en el cuello. Además, el desarrollo de recurrencia se asocia con una mayor mortalidad. las tasas de mortalidad por cáncer de treinta años se comunicaron a ser alrededor del 12% en los pacientes con recidiva local y el 43% en aquellos con recurrencia distante [3].
Las opciones de tratamiento para la enfermedad persistente o recurrente incluyen cirugía adicional y yodo radiactivo terapia. disección del cuello compartimental para la recidiva locorregional es recomendado por las directrices de la Asociación Americana de la Tiroides [4]. Otra alternativa de tratamiento con resultados prometedores es la inyección percutánea de etanol guiada por ultrasonido y la ablación por radiofrecuencia [5] - [7]. Durante el procedimiento, la infiltración de lidocaína al sitio de la punción y el tejido blando alrededor del tumor recurrente es un método simple y eficaz de control del dolor [8]. No se reportaron efectos adversos a excepción de que la calidad de imagen de ultrasonido puede estar comprometida con una gran cantidad de lidocaína [7].
Además de la acción bien establecida de analgesia y antiarrítmicos, los estudios han demostrado que los anestésicos locales tienen una amplio espectro de efectos que incluyen propiedades anti-inflamatorias y antimicrobianas [9]. Las observaciones recientes de su llamado a la prudencia chondrotoxicity en el uso clínico de las inyecciones intraarticulares [10]. Además, hay una creciente evidencia de que los anestésicos locales pueden ejercer acciones beneficiosas en el tratamiento del cáncer mediante la inhibición de la proliferación celular, la invasión y la migración [11] - [13]. Estos efectos parecen no relacionadas con su modulación de los canales de sodio [14]. En este sentido, hemos demostrado que la apoptosis juega un papel importante en la toxicidad local inducida por anestésicos celular de células de cáncer de mama [15]. Estudios previos sugieren que la apoptosis neuronal inducida por los anestésicos locales está mediada, al menos en parte, por mitogen-activated proteína quinasa (MAPK) [16], [17]. Sin embargo, poco se sabe si existen mecanismos similares se aplican a la citotoxicidad inducida por anestésicos locales en las células cancerosas.
Dado que los anestésicos locales se utilizan con frecuencia en la aspiración con aguja fina de lesiones de la tiroides y el control locorregional de cáncer de tiroides persistente o recurrente, sería interesante averiguar si los anestésicos locales tienen un efecto antiproliferativo sobre las células del cáncer de tiroides. Reportamos aquí que comúnmente se utiliza anestesia local, lidocaína y bupivacaína, inhibe el crecimiento celular y la apoptosis inducida de células de cáncer de tiroides humanos en concentraciones clínicamente relevantes. Por otra parte, de acuerdo con estudios anteriores y nuestro análisis de microarrays y la vía, se observó que las vías de señalización MAPK estaban involucrados.
Resultados
La inhibición del crecimiento celular y la formación de colonias por los anestésicos locales
la viabilidad celular de 8505C y células de cáncer de tiroides K1 se determinó incubando con lidocaína y bupivacaína concentraciones a las diluidas en serie durante 24 y 48 horas. La lidocaína y la bupivacaína inhibieron el crecimiento de ambas células de cáncer de tiroides de una manera dependiente de la dosis (Fig. 1A). A las 24 horas, la dosis eficaz mediana (ED50) de lidocaína fue de 7,3 mM para las células 8505C y 6,8 mM para las células K1, respectivamente. Estos fueron inferiores a la concentración de uso general de 1% de lidocaína (v /w) (42,67 mM). Del mismo modo, la DE50 a las 24 horas de bupivacaína fue de 3,1 mM para las células 8505C y 1,3 mM para las células K1. Ambos eran mucho más baja que la concentración clínica de 0,5% (w /v) de bupivacaína (17,34 mM).
(A) 8505C y K1 se trataron con diluciones en serie de la lidocaína y la bupivacaína, individualmente o en combinaciones, durante 24 y 48 h. Las barras de error representan el error estándar de la media. (B) A isobolograma conservador demuestra que la lidocaína y la bupivacaína actúa antagónicamente para inhibir el crecimiento celular de células de cáncer de tiroides. ED indica la dosis efectiva. La DE50 (X roja), Ed75 (cruces verdes), y la ED90 (círculos azules) se representan gráficamente. (C) El tratamiento con lidocaína y bupivacaína resultó en una reducción de la formación de colonias de la 8505C y líneas de células K1. Las barras de error representan el error estándar de la media. *, P & lt; 0,01
en comparación con el control
Para examinar si el efecto citotóxico se limita a tipo amida anestésicos locales, las células del cáncer de tiroides también fueron tratados con un éster de tipo local. anestésicos, procaína. La ED50 era 39,6 mM y 30,9 mM, respectivamente, lo que sugiere que el efecto correlacionada con la potencia, pero no la clase, de los anestésicos locales. Por otra parte, para excluir la posibilidad de que los cambios en el pH o la osmolalidad daría cuenta de los efectos citotóxicos, pH y osmolaridad de los medios de cultivo se determinaron para los experimentos. No hubo variaciones significativas en el pH o la osmolalidad (Fig. S1), indicando que los efectos observados eran farmacológica en la naturaleza.
sinergia fármaco se determinó por el índice de combinación (CI) y análisis de isobolograma de acuerdo con el efecto mediano métodos (Fig. 1B). El CI fue de 1,17 ± 0,03 para las células 8505C y 1,14 ± 0,06 para las células K1. Estos resultados sugieren que la combinación de lidocaína y bupivacaína produjo leve antagonismo.
Además, los efectos de los anestésicos locales sobre el crecimiento de células tumorales se determinaron mediante ensayo clonogénico. Los resultados se muestran en la fig. 1C. Se observó una reducción significativa dependiente de la dosis en las colonias en las células 8505C y K1. las células del cáncer de tiroides no se formaron colonias tras el tratamiento con lidocaína & gt; 4 mm o bupivacaína & gt;. 0,8 mm
La inducción de la apoptosis por los anestésicos locales
Para determinar la base de la reducción de la viabilidad celular, celular se realizó el análisis del ciclo. No hubo detención del ciclo celular en células de cáncer de tiroides tratados con lidocaína y bupivacaína durante 6, 24, y 48 horas (datos no mostrados). Sin embargo, se observó un aumento dependiente de la dosis en la fracción sub-G1 (hypodiploid) después del tratamiento con lidocaína y bupivacaína (Fig. 2A). También usamos anexina V /yoduro de propidio (PI) de doble tinción para confirmación adicional de local de apoptosis anestésicos inducida en células de cáncer de tiroides. Como se muestra en la Fig. 2B, el tratamiento con lidocaína y bupivacaína resultó en la apoptosis de una manera dependiente de la dosis. Necrosis se observó también en altas concentraciones de lidocaína y bupivacaína. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la supresión del crecimiento por los anestésicos locales en las células del cáncer de tiroides implica la inducción de la apoptosis.
(A) 8505C y K1 se trataron con las concentraciones indicadas de la lidocaína y la bupivacaína de 24 h. Después de ello, se lavaron las células, se fijaron, y se tiñeron con yoduro de propidio (PI) y se analizaron para el contenido de ADN en diferentes fases del ciclo celular por citometría de flujo. (B) células de cáncer de tiroides se trataron con lidocaína y bupivacaína durante 48 h, y las células fueron posteriormente se tiñeron con fluoresceína conjugado de anexina V y PI y se analizaron por citometría de flujo. Las barras de error representan el error estándar de la media. *, P & lt; 0,05
en comparación con el control
Evaluación de la disfunción mitocondrial
Una disminución en el potencial de membrana mitocondrial es uno de los primeros eventos en la apoptosis.. integridad de la membrana mitocondrial se evaluó utilizando el colorante catiónico JC-1, una sonda altamente específico para la detección de cambios en mitocondrial ΔΨ
m. JC-1 forma agregados rojos en mitocondrias intactas, mientras que la fluorescencia verde es debido a la formación de monómeros JC-1 a bajo potencial de membrana mitocondrial. Como se muestra en la Fig. 3A, la lidocaína y la bupivacaína aumentaron significativamente la formación de JC-1 monómeros en 8505C y células K1 de una manera dependiente de la dosis. El porcentaje de células con baja ΔΨ
m fue ligeramente menor que el porcentaje de células apoptóticas tratadas con anestésicos locales en las mismas concentraciones
.
células 8505C y K1 (A) se trataron con las concentraciones indicadas de lidocaína y bupivacaína durante 16 h. ΔΨ
cambio m se controló mediante la carga con JC-1 y se analizó por citometría de flujo. Las barras de error representan el error estándar de la media. *, P & lt; 0,05
frente
control. (B) Las células de cáncer de tiroides fueron tratados con lidocaína (6 mM) y bupivacaína (2 mM) durante los períodos de tiempo indicados. El citocromo c de la mitocondria liberación de citosol se determinó por transferencia Western. Las transferencias fueron despojados y reprobed con un anticuerpo contra la actina para la igualdad de la carga.
A continuación trató de determinar si el citocromo c fue liberado de la mitocondria al citosol. Como era de esperar, un nivel más alto de citocromo c se midió en el citosol en ambas líneas celulares después del tratamiento con lidocaína y bupivacaína (Fig. 3B). En conjunto, estos datos sugieren que el tratamiento de células de cáncer de tiroides con anestésicos locales conduce a la activación de la vía apoptótica mitocondrial.
La activación de caspasas por anestésicos locales
liberación de citocromo c se ha demostrado para activar las caspasas aguas abajo que en última instancia se requieren para inducir la apoptosis. por lo tanto, se examinó si la activación de caspasa estaba implicado en la inducción de apoptosis por los anestésicos locales. El tratamiento con lidocaína y bupivacaína resultó en la activación de la caspasa 3 y caspasa 7, y la escisión de PARP en 8505C y K1 dependiente de la dosis (Fig. 4A). Además, el ensayo de caspasa sustrato colorimétrico mostró que la actividad de caspasa 3 aumentó de una manera dependiente del tiempo en células 8505C después del tratamiento con lidocaína y bupivacaína (Fig. 4B). Estos resultados indican claramente que la activación de caspasas desempeña un papel importante en la apoptosis de las células de la tiroides cáncer inducido por los anestésicos locales
(A) 8505C y K1 se trataron con las concentraciones indicadas de lidocaína (L6, 6 mM;. L12, 12 mM) y la bupivacaína (B2, 2 mM; B4, 4 mM) durante 16 h. Se recogieron las células y las muestras se prepararon para el análisis de transferencia de Western. C, control. PARP, poli (ADP-ribosa) polimerasa. (B) Actividad de la caspasa 3 en lisados celulares de células 8505C tratados con lidocaína (12 mM) y la bupivacaína (4 mM) durante diferentes períodos de tiempo se determinó usando un ensayo de proteasa colorimétrico. Las barras de error representan el error estándar de la media.
Las proteínas de la familia Bcl-2 participan en el proceso de apoptosis al funcionar como promotores (
por ejemplo
, Bax) o inhibidores (
por ejemplo
, Bcl-2). Para activar la vía apoptótica mitocondrial, activa Bax forma un poro oligomérico y los resultados en la permeabilización de la membrana externa mitocondrial. Se encontró que el tratamiento con lidocaína y bupivacaína plomo a una reducción en los niveles de Bcl-2 con un aumento concomitante en los niveles de Bax (Fig. 4A). Por lo tanto, los anestésicos locales alteran los niveles de proteína de los miembros clave de la familia Bcl-2 en una forma que favorece un aumento en la relación de Bax /Bcl-2, que puede contribuir a la susceptibilidad de las células del cáncer de tiroides a la apoptosis.
análisis de la expresión génica firmas afectadas por los anestésicos locales
para identificar genes firmas de expresión que están asociados con las funciones biológicas de los anestésicos, los microarrays y enriquecimiento vía de análisis local se llevó a cabo para comparar los patrones de expresión en las células tratadas con 8505C lidocaína y bupivacaína. Los diez mejores vías identificadas por el análisis de la vía de enriquecimiento se enumeran en las Tablas 1 y 2. Es de destacar que el cambio de la transcripción más prominente en las células del cáncer de tiroides tratada con anestésicos locales es apoptosis. Otras vías comunes a la lidocaína y la bupivacaína tratamiento incluyen la remodelación del citoesqueleto y la diferenciación mieloide. Además, se utilizó
In silico herramientas En venta Ingenuity para identificar las vías según los informes relacionados con el mecanismo molecular del cáncer. La integración de los datos de microarrays de las células tratadas con lidocaína y la bupivacaína, la vía de análisis sugiere que la quinasa regulada por señales extracelulares (ERK) 1/2 y p38 MAPK son significativamente hacia arriba o hacia abajo reguladas en respuesta al tratamiento con anestésicos locales (Fig. S2).
la modulación de la vía MAPK señalización
Nuestro análisis de microarrays y enriquecimiento vía indica que las vías de MAPK probablemente están implicados en los mecanismos que median la acción de los anestésicos locales sobre el cáncer de tiroides Células. Para examinar esta posible relación, las proteínas celulares totales se extrajeron de las células 8505C y K1 tratados con lidocaína (12 mM) y bupivacaína (4 mM) durante diversos períodos de tiempo, y los lisados se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpos específicos contra fosforilada y total de ERK1 /2, p38 y c-Jun N-terminal quinasa (JNK), respectivamente. Como se muestra en la Fig. 5, se observó una disminución de la fosforilación de ERK1 /2. La lidocaína y la bupivacaína aumentaron significativamente la fosforilación de p38 y JNK. La lidocaína y la bupivacaína no tuvieron un efecto notable sobre la p38 total y el nivel de proteína JNK.
8505C (A) y K1 células (B) fueron tratados con lidocaína (12 mM) y bupivacaína (4 mM) durante varios períodos de tiempo , y las actividades de ERK, p38, JNK y se examinaron por análisis de transferencia Western utilizando anticuerpos fosfo-específicos. También se midieron los niveles de proteína total de ERK, p38 y JNK.
Efectos de la inhibición de las proteínas quinasas activadas por mitógenos
A continuación, nos gustaría saber si las modulaciones de vías de ERK1 /2, p38 MAPK y JNK señalización representan la apoptosis inducida por los anestésicos locales. Con este fin, se examinaron los efectos de los inhibidores específicos de la activación de caspasa y PARP división. PD98059 es un inhibidor de MAPK /ERK quinasa (MEK), inhibiendo de este modo la fosforilación y la activación de MAPK. SB203580 es un inhibidor selectivo, reversible, y ATP a la competencia de MAPK p38, mientras que SP600125 es un inhibidor de JNK anthrapyrazolone que compite con ATP para inhibir la fosforilación de c-jun. Como se muestra en las Figs. 6A y 6B, PD98059 y SB203580, pero no SP600125, redujo la activación de la caspasa 3 y la escisión de PARP. Estos resultados fueron confirmados por la caspasa 3 ensayo de actividad (Fig. 6C). Co-tratamiento con PD98059 o SB203580 suprimido la actividad de caspasa 3, mientras que SP600125 paradójicamente aumenta la actividad de caspasa 3 después del tratamiento con anestésicos locales. Estos datos se Accordant con los resultados de análisis de la vía de enriquecimiento (Fig. S2) que ERK1 /2 y p38 MAPK vías de señalización están implicadas en la apoptosis inducida por los anestésicos locales.
células
8505C (A) y (B) K1 fueron cotreated con 30 PD98059 mu M (PD), 30 M SB203580 (SB), o 30 SP600125 mu M (SP), además de lidocaína 12 mM (L) o bupivacaína mM 4 (B) durante 16 h. Se recogieron las células y las muestras se prepararon para el análisis de transferencia de Western. C, control. C3, caspasa 3. PARP, poli (ADP-ribosa) polimerasa. (C) Actividad de la caspasa 3 en lisados celulares de células 8505C tratados con lidocaína (12 mM) y la bupivacaína (4 mM) con o sin inhibidores específicos de 24 h se determinó usando un ensayo de proteasa colorimétrico. Las barras de error representan el error estándar de la media. *, P & lt; 0,01
en comparación con el control
Discusión
Han pasado más de un siglo desde el primer anestésico local sintética se introdujo en el año 1900.. Los anestésicos locales se unen de forma reversible a un sitio receptor específico dentro del movimiento de los canales de sodio y de iones de bloque. Se cree que los efectos son reversibles con la recuperación de la función nerviosa y sin daño a las células neuronales. Sin embargo, los informes de lesión neurológica permanente han generado preocupación sobre la neurotoxicidad de los anestésicos locales [18]. La evidencia acumulada sugiere que los anestésicos locales pueden causar una rápida muerte neuronal a través de la activación de la apoptosis y necrosis [19], [20]. Por otra parte, varios estudios han informado de toxicidad anestésico local en otros tipos de células [21] - [23]. En el presente estudio, hemos demostrado en primer lugar, el efecto directo de la lidocaína y la bupivacaína inhibir el crecimiento celular y la formación de colonias de células de cáncer de tiroides.
Los mecanismos de toxicidad celular de los anestésicos locales no han sido completamente aclarada. En células de linfoma histiocítico U937, lidocaína indujo apoptosis en concentraciones por debajo de 12 mM y se indujo necrosis en concentraciones superiores a 15 mM [24]. Observaciones similares han sido reportados por otros [19], [20], [25]. En este estudio, tanto la apoptosis y necrosis participan en la muerte celular inducida por los anestésicos locales. Curiosamente, un ligero antagonismo se identificó con la combinación de lidocaína y bupivacaína. Parece probable que la lidocaína y la bupivacaína inducir la muerte celular por un mecanismo similar. Cuando una célula es incapaz de morir por apoptosis, puede someterse a la muerte celular necrótica. Es bien conocido que los niveles de ATP son un factor determinante de la manifestación de la muerte celular [26], [27]. La lidocaína y la bupivacaína, se mostró a disminuir los niveles de ATP y la viabilidad de las células de melanoma [28]. El modo de muerte celular probablemente depende de la duración de la exposición y las concentraciones de los anestésicos locales.
energética mitocondrial afectados por los anestésicos locales pueden ser responsables de la disminución de los niveles de ATP. Los anestésicos locales pueden llegar a las mitocondrias y este efecto es dependiente de la solubilidad en lípidos de la anestesia local [29] altamente. miopatía clínica y experimental inducida por bupivacaína ha informado que el resultado de la disfunción mitocondrial y el metabolismo energético reducido oxidativo [30], [31]. Específicamente, la bupivacaína suprime la respiración celular mediante la inhibición de los complejos I y III, acompañado de la producción de especies reactivas de oxígeno [32]. Irwin
et al.
Han demostrado que miotoxicidad bupivacaína se basó en el metabolismo oxidativo activa porque altamente glicolítica extensor largo de los dedos eran resistentes a la toxicidad inducida por bupivacaína [30]. No obstante, las células tumorales producen predominantemente energía a través de la glucólisis (efecto Warburg) [33]. Nuestros resultados están de acuerdo con los de unos pocos informes que demuestran que la disfunción mitocondrial también podría ser provocada por los anestésicos locales en células de tumores malignos [24], [25], [34].
Las mitocondrias son esenciales moduladores de la apoptosis , necrosis y la autofagia [27]. El intrínseca (mitocondrial) vía de la apoptosis está mediado por la liberación de pro-, y las proteínas anti-apoptóticas, incluyendo citocromo c. En nuestros experimentos, los anestésicos locales aumentaron la expresión de pro-apoptótica Bax y downregulated Bcl-2 expresión, dando lugar a una mayor relación entre los pro-apoptóticos y proteínas de la familia Bcl-2 anti-apoptóticas. Ese aumento de la relación Bax /Bcl-2 facilita la liberación de citocromo c mitocondrial, lo que induce posteriormente activaciones de cascada de caspasas que escinden PARP en fragmentos inactivos. Sin embargo, la lidocaína y la bupivacaína promovidos lesión mitocondrial en un grado menor que el de la apoptosis inducida por las mismas concentraciones de la anestesia local. Esto sugiere que un proceso mitocondrias-independiente también puede jugar un papel. Esta hipótesis está apoyada por los resultados de análisis de vías de enriquecimiento (Fig. S2), en el que estuvieron involucrados transcripcional alteraciones en los componentes de la vía del receptor de muerte.
microarrays celulares son poderosas herramientas experimentales para la identificación de nuevos objetivos farmacológicos y farmacogenómica . Unami y sus colegas informaron en primer lugar, que los genes relacionados con la apoptosis se transcripcionalmente regulados por bupivacaína acuerdo con el análisis de microarrays [34]. Recientemente, Lucchinetti
et al.
Demostró que múltiples programas de transcripción relacionados con la diferenciación celular, la tumorigénesis y la metástasis se vieron afectadas negativamente por la ropivacaína [35]. Los autores postulan que esto significa nuevos fundamentos para el uso perioperatorio de anestésicos locales en pacientes con cáncer. Nuestros datos están en concordancia con estos resultados y mostraron una fuerte asociación entre alteraciones locales anestésicos inducidos en la expresión génica y la apoptosis. Por otra parte, hemos identificado que la vía MAPK está implicada en los mecanismos moleculares de la apoptosis inducida por los anestésicos locales.
En cultivos primarios de neuronas, se encontró que la bupivacaína y ropivacaína para activar p38 MAPK y JNK pero no ERK1 /2 [16] . Además, la inhibición farmacológica de estas quinasas atenúa la neurotoxicidad
in vitro
. Los autores observaron que la degeneración axonal inducida por la lidocaína se evita por el inhibidor de p38 MAPK, pero no por la inhibición de la caspasa [36]. Harato
et al. También
demostró que el tratamiento inhibidor p38 MAPK atenuó la caspasa 3 muerte actividad y celular inducida por bupivacaína [37]. En otro estudio, la vía p38 MAPK está implicada en la apoptosis inducida por bupivacaína en el neuroblastoma SH-SY5Y células humanas [17]. En línea con los resultados en la apoptosis neuronal, se encontró que la activación de p38 MAPK desempeña un papel crucial en la apoptosis inducida por anestésicos locales en células de cáncer de tiroides. regulación negativa de la proliferación es una función altamente conservada e importante de p38 en diversos tipos de células [38]. Curiosamente, la actividad p38 upregulated se ha informado en cáncer papilar y folicular de tiroides [39]. La idea es apoyada por la expresión basal de las proteínas fosfo-p38 en este estudio (Fig. 5). El doble papel de p38 MAPK en la biología del cáncer de tiroides sigue siendo una zona prácticamente sin explotar, a pesar de la vía Ras-Raf-ERK haber sido estudiado ampliamente en el cáncer de tiroides
.
En el presente estudio, la actividad de ERK1 /2 fue suprimida por lidocaína y bupivacaína. Joo
et al.
Demostrado que la lidocaína suprimió significativamente el aumento de la respuesta ERK1 /2 en un modelo de rata de dolor neuropático [40]. Más recientemente, el litio se demostró para proteger contra la lesión neuronal bupivacaína inducida a través de la inversión de la supresión de ERK1 /2 señalización [41]. Existe una creciente evidencia de una interferencia entre las vías de MAPK. Por ejemplo, p38 y activación de la vía JNK en la inducción de la apoptosis pueden regular negativamente la vía de ERK [42]. También vale la pena señalar que existe una disminución paradójica en la activación de la caspasa después del tratamiento con PD98059. Muchas alteraciones genéticas han sido implicados en el cáncer de tiroides, y la activación aberrante de la ruta Ras-Raf-ERK es más frecuente [43]. La inhibición de la vía MAPK las células del cáncer de tiroides detenciones en fase G1 [44]. Por lo tanto, una explicación plausible para nuestros resultados es que ERK1 /2 inhibición aumento de la susceptibilidad de las células del cáncer de tiroides a otros mecanismos de inhibición del crecimiento como la detención del ciclo celular y necrosis, que no implican la activación de caspasa.
Conclusiones
en resumen, nuestro estudio descifrado los mecanismos moleculares responsables de la citotoxicidad inducida por los anestésicos locales en las células del cáncer de tiroides, presentando la participación de MPak vías de señalización y sugerir posibles beneficios del uso de anestésicos locales en la práctica clínica.
Materiales y Métodos
cultivo de células y reactivos
el carcinoma de tiroides líneas celulares 8505C humana y K1 se adquirieron de la Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares (DSMZ, Braunschweig, Alemania) y la Colección Europea de cultivos celulares (ECACC, Salisbury, Reino Unido), respectivamente. células 8505C se cultivaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada de 5% de CO
2 en medio RPMI 1640 (Invitrogen /Gibco, Carlsbad, CA) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS). K1 se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (Gibco) mezclado con F12 de Ham (Gibco) y MCDB 105 (Sigma, St. Louis, MO) en medio 2:1:1 proporciones, suplementado con 10% de FBS y L-2 mM glutamina. Tanto 8505C y K1 han sido autenticada ser líneas celulares de cáncer de tiroides únicos [45]. La lidocaína, bupivacaína, procaína, PD98059, SB203580, y SP600125 se obtuvieron de Sigma. Osmolalidad de los medios de cultivo para los experimentos se analizó mediante el método de depresión del punto de congelación utilizando una avanzada 3320 Micro osmómetro (Advanced Instruments, Norwood, MA).
ensayo de viabilidad celular y análisis de la combinación de fármacos
Cell ensayo de viabilidad se realizó por triplicado para cada experimento como se describe anteriormente [46]. Brevemente, 8505C y K1 se sembraron en placas de 96 pocillos un día antes se añadió lidocaína y bupivacaína (individualmente o en combinaciones) en las concentraciones indicadas. Para el ensayo colorimétrico de bromuro de tiazolilo azul tetrazolio (MTT), 100 l de reactivo MTT (/ml 5 mg; Sigma) se añadió al cultivo celular y se incubaron las células a 37 ° C durante 4 h. Los cristales de formazán convertidos a partir de sales de tetrazolio por células viables se solubilizaron con isopropanol acidificado. La absorbancia se midió con Varioskan Flash (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) a longitud de onda de 570 nm. La absorbancia de las células de control (incubado sin drogas) se definió como 100%.
sinergia fármaco se determinó por el CI y isobolograma analiza de acuerdo con los métodos de la mediana del efecto descrito por Chou y Talalay [47]. Sobre la base de las curvas de dosis-respuesta a partir de ensayos de MTT, se calcularon los valores de CI. El sinergismo, aditividad y antagonismo se definen como CI & lt; 1, CI = 1 y CI & gt; 1, respectivamente. En el gráfico isobolograma, puntos de datos que caen en combinación, por encima, y por debajo de la línea oblicua representan un aditivo, antagonista, y el efecto sinérgico, respectivamente.
formación de colonias de ensayo
Para ensayo de formación de colonias , 400 células /pocillo fueron sembradas en placas de seis pocillos, se dejaron adherir durante 24 h, y se trataron con las concentraciones indicadas de la lidocaína y la bupivacaína de día 2. Después de 8 a 15 días, las colonias se tiñeron con 3% de cristal violeta y las colonias que contiene & gt;. se contaron las 50 células
análisis del ciclo celular
el efecto de la lidocaína y la bupivacaína sobre el ciclo celular se analizó mediante tinción con PI y citometría de flujo [48]. Después del tratamiento con lidocaína y bupivacaína durante 6, 24, y 48 h, se recogieron las células del cáncer de tiroides, se lavaron suavemente, y se fijaron en etanol al 70% frío a 4 ° C durante la noche. Las células fijadas (1 × 10
6) se incubaron con RNasa A durante 30 minutos a temperatura ambiente, y se tiñeron con una solución de IP utilizando el kit de reactivos de ADN BD Cycletest Plus (BD Biosciences, San Jose, CA) en la oscuridad. Posteriormente, las células se analizaron en un citómetro de flujo FASCalibur (BD Biosciences) equipado con software CellQuest Pro. La distribución de células en G0 /G1, S y G2 /M fases del ciclo celular se estimó usando el software ModFit LT (Verity Software House, Topsham, ME). Como una estimación de la proporción de células apoptóticas, el porcentaje de células hipodiploides se calculó en el histograma de ADN.
Análisis de apoptosis de las células
apoptosis celular se analizó mediante el isotiocianato de anexina V-fluoresceína ( FITC) kit de detección de apoptosis (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA) según las instrucciones del fabricante. las células del cáncer de tiroides se trataron con las concentraciones indicadas de lidocaína y bupivacaína durante 24 a 72 h. se cosecharon y se lavaron Tanto las células flotantes y unidas, seguido de incubación con 5 l de anexina V-FITC y 5 l de PI para 15 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de la incubación, se añadieron 400 l de solución de tampón de unión, y citometría de flujo se realizó el análisis.
Determinación del potencial de membrana mitocondrial (ΔΨ
m)
potencial de membrana mitocondrial se determinó por citometría de flujo usando el ΔΨ
colorante fluorescente m dependiente de JC-1 (CS0390; Sigma). JC-1 es un colorante lipófilo, catiónicos que que pueden entrar selectivamente en las mitocondrias, y sufre un cambio reversible en la emisión de fluorescencia de acuerdo con la ΔΨ
m. Las células sanas con alto ΔΨ
m formarán JC-1 agregados y la fluorescencia roja, mientras que las células apoptóticas con baja ΔΨ
m contendrá monomérica JC-1 y fluorescencia verde. Después del tratamiento con lidocaína y bupivacaína durante el tiempo indicado, se recogieron las células del cáncer de tiroides y se incubaron con JC-1 durante 20 min a 37 ° C de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras fueron luego sometidos a citometría de flujo.
análisis de transferencia de Western
se extrajeron las proteínas celulares totales, cuantificados, y se sometieron a electroforesis en gel de acuerdo con procedimientos estándar como se describió anteriormente [49].