Extracto
ADAM 17 (enzima convertidora de TNF-α, TACE) es un objetivo potencial para la terapia del cáncer, pero los inhibidores de moléculas pequeñas reportados hasta la fecha no son específicas de este miembro de la familia ADAM. Este metaloproteinasa unida a la membrana es responsable de ectodominio derramamiento de sustratos patológicamente importantes, como el TNF-α y ligandos de EGFR. El objetivo de este estudio fue evaluar la farmacocinética, farmacodinámica y la eficacia antitumoral de la primera inhibidor específico, un anticuerpo ADAM17 IgG anti-humana, clon D1 (A12). Utilizamos xenoinjertos intraperitoneales de la línea celular de cáncer de ovario humano IGROV1-Luc en ratones Balb /c ratones desnudos, elegido porque se había informado anteriormente de que el crecimiento de estos xenoinjertos es inhibida por abajo ronda de TNF-α.
in vitro
, 200 nM D1 (A12) inhibió derramamiento de ADAM17 sustratos de TNF-α, α-TNFR1, TGF-α, anfirregulina (AREG), HB-EGF e IL-6R, a partir de células IGROV1-Luc , (4,7 nM IC
50 para derramamiento de TNF-α). En xenoinjertos IGROV1-Luc
in vivo
, D1 (A12) IgG mostraron propiedades farmacocinéticas adecuadas para estudios de eficacia, con una sola inyección i.p. dosis de 10 mg /kg D1 (A12) suficiente para mantener las concentraciones en plasma de fluidos y ascitis IgG por encima de 100 nM durante más de 7 días. La vida media plasmática fue de 8,6 días. A continuación, se realizó un estudio de eficacia, dosificación D1 (A12) o infliximab anticuerpo TNF-α anti-humana a 10 mg /kg q7d, la cuantificación de la carga tumoral IGROV1-Luc por bioluminiscencia. D1 (A12) IgG mostró una reducción significativa en el crecimiento del tumor (p = 0,005), 56% de control del vehículo. Sorprendentemente, D1 (A12) no redujo la concentración de circulación humana TNF-α, lo que sugiere que otra enzima puede compensar la inhibición de la ADAM17
in vivo
(pero no
in vitro
). Sin embargo, D1 (A12) hizo muestran claros efectos farmacodinámicos en los ratones, con una inhibición significativa de derramamiento de tumor de ADAM17 sustratos TNFR1-α, AREG, y TGF-α (reducciones de 4 a 15 veces, p & lt; 0,0001 para los tres) . Por lo tanto, D1 (A12) tiene actividad anti-ADAM17
in vivo
, inhibe el desprendimiento de ligandos de EGFR y tiene potencial para su uso en los tumores dependientes de ligando EGF
Visto:. Richards FM, CJ Tape , Jodrell DI, Murphy G (2012) anti-tumor efectos de un específico anti-ADAM17 anticuerpos en un cáncer ovárico
en Vivo
. PLoS ONE 7 (7): e40597. doi: 10.1371 /journal.pone.0040597
Editor: Olivier Gires, Universidad Ludwig-Maximilians, Alemania |
Recibido: 11 Abril, 2012; Aceptado: June 11, 2012; Publicado: 11 Julio 2012
Derechos de Autor © 2012 Richards et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. La investigación trabajo en este estudio fue financiado por el Cancer Research UK (www.cancerresearchuk.org), el número de concesión C96 /A8333. Presidente del Prof. Murphy fue financiado por una donación de caridad a la Univerity de Cambridge por Hutchison Whampoa Ltd.-Ella no es un empleado de Hutchison Whampoa, y Hutchison Whampoa no tienen intereses comerciales en cualquiera de investigación de los autores. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores han leído la política de la revista y tienen los siguientes conflictos: CJ cinta y G . Murphy se nombran como inventores en una solicitud de patente US61 /438354, que cubre el anticuerpo utilizado en estos estudios. Esto no altera la adhesión de los autores a todos los PLoS ONE políticas sobre el intercambio de datos y materiales. Todos los autores son empleados de la Universidad de Cambridge. Los autores declaran que no existen otros intereses en competencia.
Introducción
enzima TNF-α conversión (TACE, ADAM17) es una metaloproteinasa unida a la membrana responsable de la escisión y el ectodominio derramamiento de TNF-α, ligandos de EGFR y otros sustratos patológicamente importantes. La desregulación de ectodominio derramamiento está asociada con enfermedades autoinmunes y las enfermedades cardiovasculares, la neurodegeneración, la infección, la inflamación y el cáncer [1].
ADAM17 se ha implicado en muchos tipos de cáncer. Se sobreexpresa en el cáncer de ovario [2], cáncer de mama [3], [4], adenocarcinoma ductal pancreático [5], carcinoma colorrectal [6], las células madre de cáncer gástrico [7], GIST [8], de células no pequeñas El carcinoma de pulmón [9], y el cáncer de cabeza y cuello [10], [11]. ADAM17 se informa que tiene un papel funcional directa en el control de la proliferación y /o migración de células derivadas de muchos tipos de tumores [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18] , [19], [20], y se ha implicado en el control de la migración de las células endoteliales [21] y la angiogénesis patológica [22], [23], que también es relevante para el crecimiento del tumor. ADAM17 puede ser activado por la quimioterapia, lo que resulta en el factor de crecimiento vertimiento, por lo tanto, contribuyen a la resistencia en modelos de cáncer de colon [15], [24]. ADAM17 también puede contribuir a la resistencia a trastuzumab (Herceptin
TM) en el cáncer de mama [25]. Por lo tanto, ADAM17 hace un objetivo atractivo para el desarrollo de los inhibidores, lo que tendría un amplio potencial terapéutico espectro en el tratamiento de pacientes con cáncer.
inhibidores moleculares pequeños de ADAM17 se han desarrollado pero ninguno ha demostrado la especificidad completa para ADAM17 . Por ejemplo, INCB3619 y INCB7839 inhiben ADAM10, ADAM17 y metaloproteinasas de la matriz MMP-2, MMP12 y MMP15 [9], [26], [27], [28]. Los dos inhibidores de ADAM17 que han progresado más lejos en el desarrollo [29] son DPC 333 (BMS-561392) [30] y TMI-005 (apratastat) [31]. Estos dos muestran una actividad inhibidora frente a otras MMP y no progresaron más allá de la Fase II de prueba debido a la toxicidad o la falta de eficacia. de amplio espectro inhibidores de MMP (marimastat, prinomastat, tanomastat), que también inhiben la Adams, no han progresado más allá de los ensayos clínicos de fase III, debido a la falta de eficacia y toxicidad significativa [32], [33], [34], [35], lo que sugiere que la especificidad es clave en el desarrollo de inhibidores de metaloproteinasas.
Un anticuerpo específico humana ADAM17 inhibitoria, D1 (A12), ha sido recientemente desarrollado, que inhibe la proteólisis de sustratos de ADAM17 (TNF-α, AREG, etc., ) en las células cancerosas
in vitro
[36]. El objetivo de los estudios reportados aquí fue evaluar la idoneidad de la (A12) de anticuerpos para uso terapéutico, D1 mediante la investigación de su farmacocinética, farmacodinámica y la eficacia antitumoral en ratones. Hemos elegido utilizar el modelo IGROV1-Luc de cáncer de ovario, que se ha informado de que TNF-α- dependiente [37].
Los altos niveles de expresión de TNF-α se han observado en el carcinoma de ovario [38 ], [39], [40], en particular del tipo de alto grado seroso [41], y un anticuerpo anti-TNF-α, infliximab (Remicade
TM), ha sido investigado por su eficacia contra el cáncer de ovario [42 ]. El modelo IGROV1-Luc es un modelo de xenoinjertos de tumores humanos de carcinoma de ovario intraperitoneal diseminada. células IGROV1-Luc secretan TNF-α y desmontables expresión de TNF-α por transfección de células IGROV1-Luc con anti-TNF-α shRNA se informó previamente para inhibir el crecimiento del tumor [37]. Se espera que la inhibición de ADAM17 por D1 (A12) de anticuerpos para inhibir la secreción de TNF-α y por tanto, inhibe el crecimiento de tumores IGROV1-Luc
in vivo
. Para la comparación, un grupo de ratones fueron tratados con infliximab, que se esperaba para reducir directamente funcional humano TNF-α, también conduce a la inhibición del crecimiento de los tumores IGROV1-Luc.
Materiales y métodos
Los anticuerpos y productos químicos
Aislamiento y purificación de anticuerpos humanos anti-ADAM17 anticuerpo D1 (A12) se ha descrito anteriormente [36]. Brevemente, D1 (A12) IgG se expresó mediante transfección de células HEK293 y se recogió el medio acondicionado. El anticuerpo se purificó a partir del medio mediante cromatografía en 2 columnas de proteína L (Pierce) seguido de 2 columnas Melon Gel (Pierce) y AKTA FPLC, y después se dializa en estéril salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4 y esterilizado por filtración. Infliximab (Remicade
TM, Janssen Biotech Inc.), una especie de regalo del profesor Peter Taylor (Kennedy Institute of Rheumatology), se disolvió en solución salina estéril. Control de IgG de plasma humano (R & amp; D Systems 1-001-A) se utilizó como control en algunos ensayos basados en células. N-TIMP-3 se preparó como se describe por Lee
et
al
[43]. Forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) se adquirió de Sigma, se disolvió en DMSO a 25 mg /ml y se diluyó a 100 ng /ml en medio de cultivo para los ensayos.
Cultivo celular
La línea IGROV1 humano de ovario de células de cáncer [44] fue infectada con un vector lentiviral que contiene una construcción de luciferasa [37], y esta línea celular IGROV1-Luc fue una especie de regalo de los profesores Fran Balkwill e Ian McNeish. Las células fueron cultivadas en medio RPMI-1640 que contiene 10% de suero bovino fetal. La línea celular dio negativo para micoplasma y el genotipo STR correspondió a la reportada para IGROV1 células en el panel NCI60. Además, la mutación de p53 informado (Y126C) se confirmó en estas células mediante secuenciación de ADN.
Los estudios en animales
Se realizaron todos los estudios del ratón, de conformidad con la Ley de 1986 del Reino Unido Animales (Procedimientos Científicos), bajo el número de licencia del proyecto 80/2346, con la aprobación del Comité de Ética Animal Research Institute de Cambridge CRUK y siguiendo directrices actuales del Reino Unido [45]. Balb /c desnudos ratones hembra se obtuvieron de Charles River Laboratories y se utilizaron a 6-10 semanas de edad (8 - 10 semanas para el estudio PK y 6 - 8 semanas para el estudio de eficacia). Los animales fueron alojados en grupos en jaulas ventiladas individualmente estériles. Los ratones fueron inyectados i.p. con 5 × 10
6 células IGROV1-Luc y se observaron diariamente durante el crecimiento del tumor y los signos clínicos. carga del tumor se cuantificó semanalmente por bioluminiscente de imágenes, como se describe a continuación.
Ambos anticuerpos se diluyeron en PBS estéril, pH 7,4 para la dosificación en ratones a 10 mg /kg. Para el estudio PK al menos 2 ratones por punto de tiempo se les administró por vía intraperitoneal con 10 mg /kg en un volumen de 9,5 ml /kg. Los ratones portadores de tumores se dosificaron para los estudios de PK ya sea 34 días después de la implantación del tumor (para los puntos de tiempo más cortos), o 27 días después de la implantación de 7 - 9 puntos de tiempo del día. Las concentraciones de D1 (A12) y infliximab en plasma, fluido de ascitis y homogeneizados tumorales se midieron por ELISA cuantitativa tal como se describe a continuación. Para el estudio de eficacia de los ratones se asignaron al azar en 3 grupos y i.v. dosifican con los anticuerpos en 10 mg /kg en un volumen de dosis de 4,76 ml /kg, o con PBS estéril como un control del vehículo. La primera dosis se administra el día 4 después de la inyección de las células tumorales, inmediatamente después de la primera sesión de imágenes bioluminiscentes, y cada 7 días a partir de entonces hasta el día 32. El día 32 los ratones fueron imágenes por última vez y se le dio una dosis final, entonces ellos eran matado al día siguiente, día 33, 20 horas después de la última dosis.
la sangre se recogió en tubos de heparina de litio, se centrifuga a 18.800 g durante 5 minutos y el plasma recogidos. fluido de ascitis se recogió de la cavidad abdominal y se centrifugó a 18.800 g durante 5 minutos para eliminar cualquier célula. Plasma y el líquido de ascitis fueron luego se congelaron y se almacenaron a -80 ° C. Los órganos y tumores se recogieron post mortem con la parte congelaron rápidamente y una parte fija en formalina tamponada neutra (Sigma). tejidos fijados con formalina fueron incluidos en parafina, seccionadas y teñidas con hematoxilina y eosina. Para el análisis de tejido tumoral por ELISA, se pesaron piezas de tejido congelado (aproximadamente 20 mg) se homogeneizaron en tubos MK-28R que contienen cuentas de metal usando un homogeneizador Precellys 24 (Bertin Technologies, suministrado por Stretton Scientific, Reino Unido) a 6000 rpm durante 50 segundos , dos veces. Las muestras se homogeneizaron en una concentración de 50 mg de tejido por ml de tampón (PBS, pH 7,4 con adición de cóctel inhibidor de proteasa (Sigma) y cóctel inhibidor de fosfatasa 2 (Sigma) cada diluyeron 1 en 100). El homogeneizado se centrifuga a 10.000 g durante 10 minutos a 4 ° C y el sobrenadante se utilizó para las pruebas ELISA (véase más adelante).
bioluminiscente de imágenes
Los ratones fueron anestesiados utilizando isoflurano luego se inyecta por vía intraperitoneal con 150 mg /g de peso corporal D-luciferina en PBS (Caliper Life Sciences) y bioluminiscente de imágenes con una cámara de dispositivo de carga pareja (200 IVIS, Xenogen, Alameda CA) se inició 10 minutos después de la inyección. Se obtuvieron imágenes para grupos de 3 ratones con un campo de 13 cm de vista, se va a agrupar (factor de resolución) de 8 (medio), parada de F = 1, la exposición = 1 a 10 segundos.
se analizaron
Los datos utilizando Vida imagen 3.2 (Xenogen) y se presentan como media Resplandor (unidades: fotones /s /cm
2 /estereorradián) para cada ratón, de una región de tamaño constante de interés dibujado sobre el abdomen del ratón. La media y la desviación estándar se expresaron para cada grupo de tratamiento. Importancia entre los grupos tratados y de vehículos se calculó utilizando en la prueba.
cuantitativa ELISA
Por tanto D1 (A12) y IgG humanos infliximab, placas de ELISA se recubrieron con 50 l /pocillo 100 nM anti- IgG humana (Abcam ab700) en PBS. Después de lavar con PBS-Tween (0,1% v /v) y el bloqueo con PBS-leche (5% v w /), se añadieron 50 l de muestra a cada pocillo (ya sea 50 l de plasma, homogeneizado de tejido, o concentraciones conocidas de D1 (A12) o IgG infliximab para las curvas estándar. (0-1000 rango nM, diluido en matriz en blanco (plasma o homogeneizado de tumor de los ratones sin tratar)) Después de la incubación y el lavado de la IgG humana se detectó mediante la incubación con anti-humano-kappa cadena-HRP ligera de anticuerpo (Bethyl A80-115P) (1:2000 en PBS-leche), seguido, después del lavado, por 50 l de 3,3 ', 5,5'-tetremethylbenzidine (TMB) se incubaron a temperatura ambiente durante 2 minutos después se inactivó con 50 l 1M HCl absorbancia se midió a 450 nm Los parámetros farmacocinéticos se calcularon mediante un modelo no compartimental en WinNonlin v5.1 (Pharsight)
ELISAs para sustratos ADAM17 se realizaron con R & amp...; kits D Systems DUOSET: TNF-α humano (TNFSF1A, gato No. DY210.), TNFR1-α humano soluble (TNFRSF1A, gato No. DY225.), humano TGF-α (cat No. DY239.), AREG humano (cat . No. DY262), IL-6R humano (cat. Nº DY227) y HB-EGF humano (DY259). El kit DY210 se confirmó que era específico para TNF-α humano mediante el ensayo de ratón TNF-α recombinante con este kit, no hubo reactividad cruzada.
Cuando se utilizaron los homogeneizados tumorales, las concentraciones primas nm en solución homogeneizado eran convertido a nmoles por mg de tejido y, a continuación, utilizando el supuesto de que es de 1 g /ml, se calculó la concentración molar en el tejido densidad del tejido.
la inmunohistoquímica
la inmunohistoquímica se realizó en fijado en formol, secciones de tumor y el hígado en parafina después de la recuperación de antígeno mediante digestión con enzimas (proteinasa K) a 37 ° C durante 10 minutos. La IgG humana con la que los ratones habían sido dosificado (D1 (A12) o infliximab) se detectó por unión de un Biotina-SP-conjugado AffiniPure F (ab ') 2 fragmento de burro anti-IgG humana (H + L) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), seguido por tinción con DAB + cromógeno. Las láminas fueron escaneados utilizando un ScanScopeXT (Aperio Technologies, Inc.) de 20 aumentos y las imágenes escaneadas fueron vistos usando el software v10 del espectro (Aperio Technologies Inc). No se realizó la manipulación de imágenes.
Resultados
Efecto de D1 (A12) de anticuerpos en células IGROV1-Luc
células tumorales in vitro
IGROV1-Luc
in vitro
secretada TNF-α, TNFR1-α, TGF-α, AREG, HB-EGF y IL-6R, todos los sustratos conocidos para la actividad derramamiento de ADAM17, en el medio de cultivo, incluso cuando no estimulada (Figura 1A). Cuando se estimularon con PMA las concentraciones de estas proteínas derramado en el medio de aumento de al menos 5 veces (aparte de IL-6R α, aumento de 2,7 veces). Este aumento estimulado por PMA fue inhibida por la adición de 200 nM D1 (A12) IgG (Figura 1A). La inhibición de la diseminación TNF-α por D1 (A12) era dependiente de la dosis, con una CI
50 en las células IGROV de 4,7 nM (Figura 1B). D1 (A12) fue un inhibidor más potente de derramamiento TNF-α de N-TIMP-3 (IC
50 de 72 nM), un inhibidor de metaloproteinasa naturales previamente demostrado para inhibir ADAM17 [43]. D1 (A12) IgG también inhibió derramamiento constitutiva de TNF-α en el medio durante un período más largo (Figura 1C). D1 (A12) no inhibió la proliferación de las células IGROV1-Luc
in vitro
en presencia de medio de crecimiento normal (datos no presentados), lo cual es consistente con el efecto del shRNA TNF-α en IGROV1-Luc células como se informó anteriormente [37].
(A) D1 (A12) IgG inhibe derramamiento inducida por PMA de sustratos ADAM17 en medio de cultivo celular IGROV1-Luc. El medio se recogió 90 minutos después de la adición de PMA (100 ng /ml), D1 (A12) IgG (200 nM) o control disolvente. Las proteínas se cuantificaron por ELISA. (B) la inhibición dependiente de la dosis de TNF-α por vertimiento horas de tratamiento previo 1 con D1 (A12), N-TIMP-3 o controlar el plasma humano IgG antes de la estimulación con PMA. (C) D1 (A12) IgG inhibe derramamiento constitutiva de TNF-α a partir de células IGROV1-Luc en medio de cultivo. El medio se recogió después de 48 horas de incubación con o sin IgG en 200 nM. Las barras de error indican la desviación estándar.
IGROV1-Luc El crecimiento del tumor
in vivo
Las células IGROV1-Luc creció y difundido por vía intraperitoneal en ratones desnudos (Figura 2A ), como se informó anteriormente [37], con masas tumorales individuales que muestra un aspecto histológico consistente con alto grado de adenocarcinoma seroso de ovario humano (M. Jiménez-Liñán, comunicación personal). Los mayores depósitos de tumores estaban en el páncreas, epiplón y mesenterio de todos los ratones. Por el punto final alrededor del día 32 a 35, los ratones portadores de tumores se habían desarrollado exudado peritoneal (fluido de ascitis). TNF-α humano, TNFR1-α, TGF-α, anfirregulina (AREG), y HB-EGF (sustratos ADAM17) fueron detectados en la circulación de ratones portadores de tumores IGROV1-Luc, con altas concentraciones de las concentraciones de las ascitis fluidas e inferior en el plasma (como se muestra en los grupos de control de vehículo del estudio de eficacia, mostrada más adelante).
(a) Ejemplo de el crecimiento de IGROV1-Luc tumor intraperitoneal, tal como se mide por bioluminiscencia, de 11 a 29 días después de la inyección de las células. (B y C) Farmacocinética de D1 (A12) en ratones desnudos después de una dosis única de 10 mg /kg i.p. N = 2 o más ratones por punto de tiempo. Las barras de error representan el error estándar de la media (B) Las concentraciones en plasma en ratones no portadores de tumor. (C) de plasma y ascitis concentraciones de fluido en ratones portadores de tumores IGROV1-Luc. (D) D1 (A12) IgG en el plasma del ratón: la capacidad para unirse a ADAM17 y FcγR1. Se recogió plasma en los tiempos indicados después de la administración a los ratones con una dosis única de 10 mg /kg D1 (A12). La actividad de unión
in vitro
se comparó con la capacidad de unión de D1A12 solución madre. Las barras de error representan el error estándar de la media.
Farmacocinética de D1 (A12) IgG
La farmacocinética (PK) de D1 (A12) de anticuerpos fueron investigados utilizando una única de 10 mg /dosis kg ip, en ratones no portadores de tumores (Figura 2B). los parámetros farmacocinéticos se calcularon para los ratones no portadores de tumores utilizando el programa de análisis no compartimental WinNonLin: Plasma C
max = 523 +/- 58 nm, T
máximo 2 días, la vida media de 8,6 días. luego más se realizó muestreo limitado en ratones portadores de tumores IGROV1-Luc (Figura 2C), en la que el D1 (A12) IgG mostró una cinética similar a la no tumoral ratones portadores. Después de una 10 mg /kg i.p. dosis el C
max fue de 425 +/- 51 nM en plasma y 391 +/- 19 nM en líquido ascítico, inferior a la del plasma C
max en los ratones sin tumores. Estos datos fueron suficientes para predecir que circula D1 (A12) por encima de concentraciones de 100 nM pueden ser mantenidos por dosificación 10 mg /kg una vez cada 7 días. 100 nM D1 (A12) es suficiente para hacer que la concentración de la inhibición máxima de la función ADAM17 en cultivo celular IGROV1 (Figura 1B).
La detección de D1 (A12) de anticuerpos por ELISA no significa necesariamente que el anticuerpo se había conservado su actividad, ya que podría ser parcialmente desnaturalizado, por lo que la actividad de unión del D1 plasma (A12) de anticuerpos se evaluó (Figura 2D y la Figura S1). El anticuerpo D1 (A12) a partir del plasma de los ratones en todos los puntos de tiempo de 1 a 9 días retiene la capacidad de unirse ADAM17 (100% en el día 9, en comparación con el D1 (A12) solución madre). Por el contrario, la capacidad de D1 (A12) para unirse a FcγR1 humano disminuyó con el tiempo, con la unión después de 9 días en el ratón solamente 32% de la unión de D1 (A12) solución madre.
Los estudios de eficacia y farmacodinámica
Una vez establecido que la D1 (A12) anticuerpo tiene características adecuadas de PK, probamos el efecto de la dosis semanal en xenoinjertos IGROV1-Luc con 10 mg /kg D1 (A12) (n = 11), en comparación con 10 mg /kg de infliximab (n = 8) y el vehículo de PBS (n = 12). Antes de la primera dosis el día 4 después de la inyección de células no hubo una diferencia significativa en la carga tumoral entre los grupos: Promedio Resplandor (x 10
6 p /s /cm
2 /Sr) 2,71 +/- 1,35 , 2,92 +/- 1,23 y 2,65 +/- 0,91 (A12) para los grupos D1 vehículo, infliximab y, respectivamente. El tamaño del tumor en el punto final en el día 32 se presenta en la Figura 3. El D1 (A12) grupo tenía una carga tumoral significativamente menor (Med Resplandor x 10
6 p /s /cm
2 /Sr) en el día 32 de 23,3 +/- 9,1 en comparación con el grupo de vehículo (41,8 +/- 17,2, p = 0,005). La carga tumoral media en el grupo D1 (A12) en el punto final era 56% de la de control del vehículo. En contraste no hubo inhibición del crecimiento del tumor en ratones tratados con infliximab comparación con el vehículo, con la carga tumoral de 39,1 +/- 11,6 en el grupo de infliximab (p = 0,68).
Crecimiento de IGROV1-Luc i.p. xenoinjertos en ratones dosificados semanalmente con vehículo, 10 mg /kg de infliximab o 10 mg /kg D1 (A12), medida por bioluminiscencia. Se muestra la media y la desviación estándar de 32 días la carga tumoral, expresado como medio Resplandor. N = 12 para vehículo, n = 8 para infliximab y N = 11 para D1 (A12).
Para confirmar que se habían alcanzado las concentraciones terapéuticas de anticuerpos, la concentración de D1 (A12) e infliximab se determinó en el plasma y el líquido ascitis (Figura 4A) y en los homogeneizados tumorales (Figura 4B). Como era de esperar, no IgG humana se detectó en ninguna de las muestras del grupo tratado con vehículo. D1 (A12) e infliximab estuvieron presentes en altas concentraciones en plasma y el líquido ascitis en el grupo de tratamiento apropiado, y ambos anticuerpos fueron detectables en el tumor de los dos páncreas y epiplón. La concentración de D1 (A12) fue mayor en tumor de infliximab, pero infliximab fue mayor en plasma y el líquido ascitis que D1 (A12)
.
Las muestras se tomaron al final del estudio (día 33), 20 horas después de la última dosis de anticuerpo. Concentraciones (A) en plasma y el líquido ascitis. Las barras horizontales representan la media y la desviación estándar. (B) Las concentraciones en los homogeneizados de tejido de tumor en el páncreas y el epiplón. (C) La inmunohistoquímica para detectar IgG humana en el tumor IGROV1-Luc y el hígado. Top: ratón ID 901, se trató con D1 (A12), con una flecha marca la posición de un vaso sanguíneo; media: Identificación del ratón 903, tratados con infliximab; abajo: Identificación del ratón 902, tratado con vehículo. Las imágenes fueron tomadas a 20 aumentos.
Para investigar la distribución de D1 (A12) e infliximab en el tejido tumoral, inmunohistoquímica anti-IgG humana se llevó a cabo en secciones de parafina de los tumores (Figura 4C). Los dos anticuerpos terapéuticos fueron detectables tan fuerte tinción IHC en el hígado, y ambos también eran detectables en el tejido tumoral, pero parecieron estar limitados a los vasos sanguíneos de la distribución.
Para determinar si el anticuerpo tenía efectos farmacodinámicos se analizaron las concentraciones en el plasma y el líquido ascítico de los productos de la actividad sheddase ADAM17, es decir, soluble humano TNF-α, soluble TNFR1-α, TGF-α y anfirregulina (AREG) (Figura 5). Los cuatro de las proteínas analizadas mostraron concentraciones significativamente más altas en el líquido ascítico que en el plasma. Como se esperaba, hubo una reducción significativa en sTNF-α en el fluido de ascitis de los ratones tratados con infliximab en comparación con vehículo (reducción de 3,7 veces, p & lt; 0,0001). Sorprendentemente, no hubo una reducción significativa en sTNF-α en la D1 (A12) ratones tratado con (P = 0,06). Sin embargo, D1 (A12) sí mostró claros efectos farmacodinámicos, reduciendo significativamente la ascitis concentraciones en líquido de soluble de TNFR1-α (reducción de 4,4 veces, P & lt; 0,0001), AREG (reducción de 5,4 veces, P & lt; 0,0001) y TGF-α ( reducción de 15 veces, P & lt; 0,0001). D1 (A12) también redujo significativamente las concentraciones plasmáticas de soluble de TNFR1-α (P & lt; 0,0001), AREG (P = 0,012) y el TGF-alfa (P = 0,005)
Las concentraciones de los productos escindidos de ADAM17. sustratos en plasma y el líquido ascitis en el punto final (día 33), medida por ELISA. Las barras horizontales representan la media y la desviación estándar. Los asteriscos indican los grupos significativamente diferentes (P & lt; 0,05). Del grupo de control PBS en el mismo tipo de fluido
Discusión
Hemos investigado la actividad biológica de D1 (A12), un anticuerpo monoclonal específico para ADAM17 humano, que inhibe la función ADAM17 por la inhibición de varios dominios del ectodominio. Hemos demostrado que el anticuerpo (a concentraciones nanomolares) inhibe el desprendimiento de sustratos ADAM17 incluyendo TNF-α y AREG en células IGROV1-Luc
in vitro
.
Las propiedades de PK de la D1 (A12 ) IgG en ratones se encontró que eran adecuados para estudios de eficacia. La vida media en plasma es consistente con los valores publicados para la vida media de los anticuerpos IgG humanos en plasma de ratón [46]. El plasma y ascitis C
max fueron más bajos en el tumor ratones que el plasma C
max en los ratones sin tumores que llevan. Sin embargo, esto no es sorprendente dado el volumen de fluido corporal total mayor en los ratones portadores de tumor debido a la ascitis compartimento de fluido. Las concentraciones en plasma y líquido ascítico de D1 (A12) IgG fueron muy similares dentro de cada ratón individual, tanto de los estudios PK y de eficacia, lo que sugiere que el anticuerpo es capaz de equilibrar entre estos dos compartimentos después de IP o IV de la dosificación. Hemos demostrado que D1 (A12) de anticuerpo es estructuralmente estable en la circulación del ratón, conservando la capacidad de unirse a ADAM17 humano hasta 9 días después de la dosificación. Sin embargo, la capacidad de D1 (A12) para unirse a FcγR1 humano disminuyó con el tiempo en el plasma de ratón, de manera que sólo el 32% de la actividad de unión se mantuvo después de 9 días en el ratón. La capacidad de unión FcγR1 reducida puede ser debido a receptores de Fc solubles presentes en suero de ratón. Por ejemplo, el ratón FcRn se une IgG1 humana con alta afinidad [47] y es responsable de la larga
in vivo
vida media de los anticuerpos [48].
Las propiedades de PK y estabilidad de D1 (A12) IgG en la circulación del ratón indicó que las dosis semanales debe mantener las concentraciones suficientemente altas como para ser biológicamente activa
in vivo
, se realizaron estudios de eficacia por lo que en el modelo IGROV1-Luc. D1 (A12) de anticuerpos mostró efectos antitumorales, con la carga tumoral al final del estudio aproximadamente 56% del grupo de control del vehículo. Este era un efecto antitumoral modesto, y algunas posibles explicaciones para esto se discute más adelante.
homogeneizados tumorales habían concentraciones de D1 (A12) IgG por encima de la IC celular
50, pero el análisis de IHC mostró limitada la penetración más allá de los vasos sanguíneos del tumor. Similar limitada penetración se ha observado en los xenoinjertos de tumores para la alta afinidad anti-HER2 anticuerpo trastuzumab [49], que sin embargo es un fármaco eficaz
in vivo
. Distribución de anticuerpos monoclonales en el tejido tumoral se ha demostrado que estar limitado por penetración a través de las paredes capilares y también por factores adicionales una vez que el anticuerpo ha cruzado la pared del vaso sanguíneo [50]. La penetración de D1 (A12) puede ser mejor en los tumores con los vasos más permeables que las de los tumores IGROV1. Sin embargo, la penetración del tumor limitado de D1 (A12) IgG en los tumores IGROV1-Luc no impidió que el anticuerpo que tiene efectos farmacodinámicos claras (derramamiento de sustratos de ADAM17, véase más adelante). Curiosamente, D1 (A12) la concentración fue mayor en tumor de infliximab, pero menor en el plasma y fluido de ascitis que infliximab, quizás reflejando la ubicación del objetivo para cada anticuerpo (ADAM17 en la membrana plasmática de la célula tumoral, frente a TNF-α circulante que es presente en altas concentraciones en el plasma y ascitis).
Para determinar si los anticuerpos estaban golpeando sus objetivos y que tiene efectos farmacodinámicos, ensayos de ELISA de los sustratos de ADAM17 se realizaron en plasma y ascitis muestras de fluido al final de la eficacia estudiar. ratones tratados con vehículo mostraron concentraciones mucho más altas de soluble TNF-α, TNFR1-α, AREG y TGF-α en líquido ascítico que en el plasma, lo que sugiere que estas proteínas no se equilibran libremente entre los compartimentos de plasma y ascitis, en contraste con el dosificado IgG que se equilibre entre los compartimentos.
Comparación de la D1 (A12) grupo tratado con los controles del vehículo mostró que D1 (A12) inhibió significativamente el desprendimiento de sustratos ADAM17, el EGFR ligandos TGF-α y AREG, y TNFR1-α. Sin embargo, D1 (A12) no inhibió significativamente TNF-α derramamiento
in vivo
, que fue sorprendente porque derramamiento TNF-α fue inhibida por D1 (A12) en las células IGROV1-Luc
in vitro
. La falta de inhibición de TNF-α derramamiento de
in vivo
podría explicar el efecto antitumoral relativamente modesta del anticuerpo, el TNF-α, porque se pensaba que era un motor clave del crecimiento tumoral en este modelo, basado en el shRNA obra de Kulbe,
et
al
[37], pero los datos infliximab confunde esta hipótesis (véase más adelante).
ADAM17 se ha considerado la enzima clave responsable de vertimiento TNF-α de, pero nuestros resultados con la (A12) D1 anticuerpo sugieren que otra enzima puede compensar cuando la actividad ADAM17 se inhibe en células cultivadas IGROV1-Luc
in vivo gratis (pero no
in vitro
). Esto puede ser ADAM10: ADAM10 ha mostrado actividad sheddase TNF-α en fibroblastos murinos deficientes ADAM17 [51] y se ha implicado en la producción de TNF-α en el linfoma de células del manto [52]. También, Hikita et al [53] mostró que mientras ADAM17 es de hecho el principal sheddase TNF-α en los macrófagos, ADAM10 es también un sheddase TNF-α en células 293A transformadas por adenovirus de riñón embrionario humano, NIH3T3 fibroblastos de embrión de ratón y células endoteliales murinas. También, cuando se sobreexpresa, ADAM19 puede ser capaz de contribuir a TNF-α derramamiento [54]. Estos datos sugieren que para la inhibición de TNF-α derramamiento de tumores
in vivo
, puede ser necesaria la inhibición de tanto ADAM17, ADAM10 y ADAM19. En el
in vivo
estudios de las células tumorales habrían sido expuestos a D1 (A12) durante 28 días, y si los mecanismos compensatorios eran lentos para desarrollar, esto podría explicar por qué esta compensación no se observó en el em
in vitro
ensayos que se realizaron más de 48 horas o menos. Otra posible explicación para la falta de inhibición de TNF-α derramamiento de
in vivo
es que derramar en trans puede estar ocurriendo, donde ADAM17 murino en células huésped, que no serían objeto de regulación por D1 (A12), podría escindir TNF-α en células tumorales humanas adyacentes. Para nuestro conocimiento trans-derramamiento no se ha informado de ADAM17, pero tiene para la escisión de ADAM10 ephrin A5 [55].