Extracto
Objetivo
Para explorar los genes reguladores clave asociados con el cáncer de pulmón con el fin de reducir su incidencia y el progreso a través de silenciar estos genes clave.
Métodos
para identificar los genes reguladores clave implicados en el cáncer de pulmón, se realizó una combinación de conjunto de genes y análisis de la bioinformática para comparar los perfiles de transcripción de genes en cepas de células 3 monoclonales con capacidades metastásicas altas, medias o bajas, que fueron separados de la SPC SPC-A-1 líneas de células por ensayo de dilución limitante monoclone -A-1sci y. A continuación, analizó las actividades biológicas esos genes 'derribando su expresión en células SPC-A-1sci utilizando siRNA y shRNA vectores lenti-virus, seguido por la determinación de la capacidad de invasión y la migración de las líneas celulares derivadas in vitro, así como su potencial para inducir la aparición y la metástasis de cáncer de pulmón in vivo. Para examinar la relevancia clínica de estos hallazgos, se analizaron los niveles de expresión de los genes identificados en tejidos de cáncer de pulmón humano (n = 135) y se correspondía con los tejidos normales adyacentes mediante tinción inmunohistoquímica (IHC).
Resultados
Tres cepas de células monoclonales caracterizados con alto, medio o bajo capacidades metastásicas fueron seleccionados con éxito. conjunto de genes y la bioinformática análisis implican que la osteopontina, LAMB3 y ITGB1 eran los principales genes implicados en el cáncer de pulmón. Desmontables de estos genes suprime la invasión de células de cáncer de pulmón humano y la metástasis in vitro e in vivo. Los análisis de la muestra clínica indicó que la osteopontina, LAMB3 y ITGB1 los niveles de expresión de proteína fueron mayores en los pacientes con cáncer de pulmón, en comparación con los tejidos adyacentes no cancerosos, y se correlaciona con metástasis linfática.
Conclusiones
Nos confirmó que osteopontina, LAMB3 y ITGB1 desempeñaron un papel importante en la aparición y la metástasis del cáncer de pulmón, de este modo proporcionado claves importantes para comprender el mecanismo molecular de la metástasis y contribuir al tratamiento terapéutico del cáncer de pulmón
Visto:. Wang XM, Li J, Yan MX, Liu L, Jia DS, Geng Q, et al. (2013) Los análisis integradores Identificar osteopontina, LAMB3 y ITGB1 como críticos genes pro-metastásicos de cáncer de pulmón. PLoS ONE 8 (2): e55714. doi: 10.1371 /journal.pone.0055714
Editor: Xin-Yuan Guan, la Universidad de Hong Kong, China
Recibido: 12 Agosto, 2012; Aceptado: December 29, 2012; Publicado: 18 Febrero 2013
Derechos de Autor © 2013 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por las subvenciones del Programa Nacional de Investigación básica clave de China (2009CB521803), y "plan de acción para la innovación" de la Ciencia y Tecnología de Shanghai fondo (10140902400). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón sigue siendo la principal causa de muerte por cáncer en el mundo (
& gt; 1 millón de muertes al año en todo el mundo) [1] - [2]. La metástasis es un signo y una función de cáncer de pulmón maligno y es también la principal causa del fracaso de la muerte y el tratamiento relacionado con el cáncer de pulmón-[3]. Aunque más de un siglo de intenso trabajo se ha centrado en investigar el proceso metastásico, los mecanismos moleculares que facilitan la progresión del carcinoma in situ para el carcinoma metastásico permanecen en gran parte difícil de alcanzar. Es cierto, sin embargo, que la metástasis es un proceso de varias etapas dinámica y progresiva. Varios pasos distintos son discernibles en la cascada biológica de la metástasis: la pérdida de adhesión celular, aumento de la motilidad y la invasión, la entrada y la supervivencia en la circulación, se extendió en nuevo tejido y la eventual colonización de un sitio distante [4]. estudios de referencia considerables han determinado que sólo ciertas subpoblaciones de un tumor primario tienen el potencial invasivo y metastásico para someterse al proceso metastásico completa de la invasión, y la extravasación intravasación [5] - [6]. Que emerge de estos estudios fueron dos conceptos fundamentales para nuestro léxico del cáncer: 'subpoblaciones metastásico "y" ineficiencia metastásico "[7]. Por lo tanto, un estudio de los diferentes perfiles de expresión génica entre las subpoblaciones metastásicos y la ineficiencia metastásico mediante la tecnología de chip genético revelará los genes críticos implicados en la metástasis del cáncer.
En nuestro trabajo anterior, se estableció una sublínea celular altamente invasiva (SPC -A-1sci) y una sublínea débilmente invasiva de células (SPC-a-1) por la selección in vivo en ratones NOD /SCID [8]. Estas líneas celulares proporcionan un modelo apropiado para estudiar el mecanismo metastásica de cáncer de pulmón. Aquí, nos separamos más de 2 cepas de células monoclonales de la línea celular SPC-A-1sci y una cepa de células monoclonales de SPC-A-1 (la línea celular de sus padres) que caracteriza con capacidades metastásicas altas, medias o bajas, respectivamente, limitando ensayo monoclone dilución. A continuación realizó gen chip combinada con la bioinformática análisis sobre estas tres cepas.
De acuerdo con los resultados de la matriz de genes, encontramos 2277 hasta reguladas y 2257 genes regulados entre las tres cepas de células. El análisis bioinformático reveló más detalles acerca de las funciones importantes, caminos, tendencias expresivas y los flujos de señales de estos genes diferentes. El gráfico resultante del modelo de flujo de señal indica un papel regulador clave de SPP1 (o osteopontina), LAMB3, MAPK1, y Jun en la metástasis de la línea de células SPC-A-1sci.
Con anterioridad, ha sido informaron que las células cambian sus propiedades de adhesión célula-célula, reorganizar su matriz extracelular (ECM) medio ambiente, y reorganizar sus citoesqueleto para facilitar la migración y la gran cantidad de evidencias invasion.A han indicado que la osteopontina facilitó la unión de las células a la ECM mediante la unión a varios tipos de integrinas (INTs), aumentaron la expresión y la actividad de MMP-2, y promueven el crecimiento del tumor y la metástasis a través de la activación de las vías de supervivencia [9] - [13]. La laminina también promovió la adhesión celular y la migración mediante la interacción con intercepciones [14] - [16]. A continuación, se verificó que se establecen ronda de osteopontina, LAMB3 y ITGB1 disminuyó la metástasis de la línea de células SPC-A-1sci a través de una serie de experimentos tanto in vitro como in vivo. Estos hallazgos han confirmado que la osteopontina, LAMB3, y ITGB1 jugó un papel importante en la metástasis de cáncer de pulmón y ofrecen pistas valiosas para el estudio del mecanismo de metástasis de cáncer de pulmón.
Materiales y Métodos
Declaración de ética
Todos los protocolos de experimentación con animales utilizados en este estudio fueron aprobados por la Comisión de Cuidado de animales de Shanghai de Medicina Experimental de la Universidad de Shanghai Jiaotong (ID aprobación SHCI-12-023).
Líneas celulares
El pulmón línea celular de adenocarcinoma humano SPC-A-1 se obtuvo del Instituto celular de la Academia de Ciencias de china (Shanghai, china). Esta línea celular se aisló originalmente de las piezas quirúrgicas de un hombre chino de pulmón avanzado con adenocarcinoma de Chest Hospital de Shanghai y el Instituto Celular de la Academia China de Ciencias en 1980 [17]. La línea celular humana de alta cáncer de pulmón metastásico SPC-A-1sci fue establecido por Yao Ming (Shanghai Jiaotong University, Instituto de Cáncer de Shanghai) [8]. Ambas líneas se cultivaron en medio DMEM que contenía 10% (v /v) de suero fetal bovino a 37 ° C, 5% de CO
2.
Limitar Aislamiento dilución Monoclone
SPC-A células -1sci se tripsinizaron y se resuspendieron en DMEM a una concentración de 100 células por 10 ml, de los cuales se añadió 0,1 ml a cada pocillo de placas de 96 pocillos que ya contienen 0,1 ml de 10% de FBS DMEM. Dos semanas más tarde, cada pocillo se observó bajo el microscopio, y 20 cepas de células monoclonales SPC-A-1sci fueron seleccionadas y propagadas.
Análisis de los datos de microarrays
El ARN total de cada línea celular fue cosechado usando el reactivo Trizol (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. El ARN total fue enviado a la biotecnología Shanghai Co, Ltd (Shanghai, China). El ARN total se hibrida a la Affymetrix U133 Plus 2,0 array (Affymetrix, Santa Clara, CA, EE.UU.) y se procesa de acuerdo con los protocolos técnicos de Affymetrix. algoritmos estadísticos se utilizaron en el análisis de datos de expresión GeneChip.
Bioinformática Análisis
Gene Ontología (GO) el análisis.
GO análisis se aplicó para analizar las principales funciones de la genes expresados diferencialmente de acuerdo con la ontología de genes, la clasificación funcional clave del NCBI. Por lo general, la prueba exacta de Fisher y la χ
2 test se utilizaron para clasificar la categoría GO, y se calculó la tasa de falso descubrimiento (FDR) para corregir el
P
-valor, con un FDR más pequeño corresponde a una menor error al juzgar la
P-valor
. El FDR se definió como, donde N
κrefers al número de test de Fisher
P-valores
menos de la χ
2 test
P-valores
. Hemos calculado
P
-valores para los GO clasificaciones de cada gen expresado diferencialmente. Enriquecimiento proporciona una medida de la importancia de la función: a medida que aumenta el enriquecimiento, la función correspondiente es más específica, lo que nos ayuda a identificar aquellos SMO en el experimento con descripciones funcionales más concretas. Dentro de cada una de las categorías, el enriquecimiento (Re) fue dado por: donde n
f
es el número de genes diferenciales dentro de la categoría en particular,
n
es el número total de los genes dentro de la misma categoría,
N
f
es el número de genes expresados diferencialmente en todo el microarray, y
N
es el número total de genes en el microarray [18] - [21].
Go-mapa.
The Go-mapa, una red de interacción del SMO significativas de los genes expresados diferencialmente, fue construido según las clasificaciones de ontología de genes para identificar las interacciones entre el Gos significativas directamente y de forma sistémica. Este mapa potencialmente resume las interacciones funcionales de los genes expresados diferencialmente en condiciones de enfermedad [22] - [24]
Pathway análisis
Del mismo modo, se utilizó la vía de análisis para determinar las vías significativas de.. los genes expresados diferencialmente de acuerdo con KEGG, Biocarta y Reatome. Una vez más, se utilizó la prueba exacta de Fisher y la χ
2 test para seleccionar las vías importantes, y el umbral de significación se estableció por el
P-valor
y FDR. El enriquecimiento se calculó según la ecuación descrita anteriormente [19], [21].
Ruta-Net.
Un Camino-Net fue construido para identificar directamente y sistémicamente las interacciones entre las vías significativas de los genes expresados diferencialmente en función de las interacciones entre las vías de la base de datos KEGG. Se proporciona un resumen de las interacciones de la vía de los genes expresados diferencialmente en condiciones de enfermedad y ayudó en determinar por qué se activó una determinada vía [23].
Señal de flujo
estímulo celular externa afecta celular comportamiento y se refleja en la interacción de proteínas y cinética de la expresión génica. Por lo tanto inferimos un gen regulador de red dinámica, calculado de acuerdo con la expresión pliegue de los genes y sus interacciones en las vías. Las relaciones de los datos de expresión de genes se infiere utilizando una red neural recurrente de tiempo continuo (CTRNN) como un modelo dinámico abstracto para la red de regulación de genes que media la decisión celular para migrar a un estímulo externo. El modelo describe la influencia mutua de los genes y su estímulo-respuesta como elementos dinámicos, independientemente de cómo una interacción o la estimulación, se realiza en términos biológicos concretos. El modelo CTRNN generalmente se describe como, donde denota la constante de tiempo, se refiere a la entrada externa,
denota el peso del gen
j
en el gen
i
, denota el desplazamiento del gen
j
, denota la función de activación sigmoide, y denota el gen
i
valor de expresión en el
t
tiempo punto. El uso de este algoritmo genético, se estimaron los parámetros del modelo [25]
transfección siRNA
siRNA oligonucleótidos con las siguientes secuencias fueron sintetizados por la compañía (Jima, Shanghai, China). ARNsi de control negativo, el sentido : 5'-NVND UCC GAA UGE GUC ACG Utt-3 'y antisentido: 5'-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3'; osteopontina siRNA, el sentido: 5'-CCA NVND UGA UGA UGA AUC T-3 'y antisentido: 5'-AUC AGA AGA NVND AUC agosto G-3'; LAMB3 siRNA, el sentido: 5'-CCA NVND UGA UGA UGA AUC T-3 'y antisentido: 5'-AUC AGA AGA NVND AUC agosto G-3'; ITGB1 siRNA, el sentido: 5'-CCA NVND UGA UGA UGA AUC T-3 'y antisentido: 5'-AUC AGA AGA NVND AUC agosto G-3'. Entrega de siRNAs se logró usando el reactivo Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Burlington, ON) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, 3 × 10
5 células /pocillo se sembraron en placas de 6 pocillos, cultivadas durante la noche para alcanzar el 50-70% de confluencia, después se lavó con DMEM sin suero y antibióticos. reactivo LipofectAMINE 2000 y siRNA se mezclaron y se añadieron a las células a concentraciones finales de 5 l /pocillo y 2,5 g /pocillo, respectivamente, seguido de incubación a 37 ° C durante 48 h.
Preparación de extractos de proteínas
las proteínas de las líneas de células SPC-A-1sci cultivadas que recibieron tratamientos de siRNA se recogieron y agruparon a partir de 10 pocillos de dos placas de 6 pocillos. Todos los procedimientos de extracción de proteínas se realizaron en hielo. Brevemente, las células se lavaron con PBS frío, raspada por rascador de células, después se transfirieron a tubos de 1,5 mL y se lisaron con 200 l de tampón de lisis enfriado en hielo por tubo. Después de una incubación de 40 min en hielo, los homogeneizados se centrifugaron a 12.000 g durante 10 min a 4 ° C. Se recogieron los sobrenadantes después de extractos de proteínas centrifugation.All fueron almacenadas a -20 ° C.
Análisis de Western Blot
Uso de la proteína total aislado arriba. SDS-PAGE (12%) Los geles se procesaron y posteriormente se transfirieron a membranas de nitrocelulosa a 4? C. Las membranas se bloquearon en PBS que contenía 5% de leche durante 2 horas, seguido de la adición de anticuerpos primarios contra osteopontina (1:400), ITGB1 (1:500), LAMB3 (1:500), y β-actina (1: 15000) anticuerpos primarios fueron incubados durante la noche a 4 ° C, seguido de incubación con anticuerpos secundarios conjugados con HRP apropiadas a temperatura ambiente durante 1,5 horas. Las membranas se lavaron con PBST (NaCl 150 mM, Tris 10 mM, pH 8,0, 0,05% de Tween-20), y las proteínas específicas se detectaron utilizando el sistema de HRP.
cuantitativa en tiempo real el análisis de PCR
ARN total de las líneas de células SPC-a-1sci cultivadas que recibieron tratamientos de siRNA se recogieron usando reactivo Trizol de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La transcripción inversa se logra utilizando reactivos de transcripción inversa (Takara) y siguiendo las instrucciones del fabricante. En tiempo real el análisis de PCR se realizó en un Sistema 7300 Real-Time PCR con SDS software Estudio RQ (Applied Biosystems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. moldes de cDNA se combinaron con SYBR verde premezcla que contiene Rox (Takara) para llevar a cabo las reacciones de PCR cuantitativos. Los cebadores utilizados para la PCR cuantitativa fueron los siguientes: La osteopontina hacia adelante: 5'-GACAGCCAGGACTCCATT-3 '; osteopontina inversa: 5'-GATGTCAGGTCTGCGAAA -3 '; LAMB3 hacia adelante: 5'-AGGCAAGAACTGTGAGCG-3 '; LAMB3 inversa: 5'-GGGTTGGCGTAGGTGAGT-3 '; ITGB1 hacia adelante: 5'-AATGTAACCAACCGTAGC-3 '; ITGB1 inversa: 5'-CAGGTCCATAAGGTAGTAGA-3 '; ß-actina hacia adelante: 5'-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG-3 '; ß-actina inversa: 5'-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3 '. La expresión génica se normalizó a ß-actina. Todas las reacciones se realizaron por triplicado.
arañazos de la cicatrización de heridas Ensayo
El ensayo de los arañazos que la curación se llevó a cabo con una ligera modificación de la descrita anteriormente [26]. Las células fueron cultivadas a aproximadamente el 90% de confluencia en placas de 24 pocillos a continuación de hambre en medio bajo en suero (FBS al 1% en DMEM) durante la noche. Un rasguño recta en la monocapa de células se realizó utilizando una punta de pipeta de 200 l para simular una herida. Las células se enjuagaron con PBS y se cultivaron con 1% de FBS en DMEM durante otras 24 h. Tres imágenes por pocillo se recogieron después de campos aleatorios utilizando un microscopio CKX41 (Olympus, Japón). El porcentaje de área herida que fue llenado se calculó como sigue: {(media anchura heridos - anchura media restante) /anchura media heridos} x 100 (%)
migración y la invasión ensayos
. ensayos de migración celular y la invasión se realizaron utilizando 6,5 mm cámaras trans pocillos (8 micras de tamaño de poro, Corning) como se ha descrito anteriormente, con algunas modificaciones [27]. Las células se sembraron a 100.000 células por pocillo en cámaras trans pocillos y recubiertas con Matrigel cámaras trans pocillos para ensayos de migración y la invasión. Los pocillos se lavaron con PBS después de 24 h para ambos ensayos. Las células que habían migrado y invadido a la parte basal de la membrana fueron fijadas y teñidas con H & amp; E o violeta cristal, visualizaron y se fotografiaron con un microscopio CKX41 a 400 × magnificación y un sistema DP20 Imaging (Olympus, Japón). Se obtuvieron imágenes de los tres campos al azar de los tres pocillos replicados, y se contó el número de células que habían migrado e invadido.
Los experimentos ShRNA
El vector de ARNhc Lenti-viral se construye como se ha descrito anteriormente [28]. En pocas palabras, el control negativo, osteopontina, LAMB3 y ITGB1 shRNA se subclonaron en el
Mlu
I /
Cla Webs Oficiales otros I del vector pLVTHM (Addgene) utilizando los siguientes oligonucleótidos: 5'-CGCGTCGTAGCGACTAAACACATCAATTttc aagagaAATTGATGTGTTTAGTCGCTATTTTTTGGAAT 3 'y 5'-CGATTCCAAAAAATAGCGACTAAACACATCAATTtctcttgaaAATTGATGTGTTTAGTCGCTACGA-3' para el control negativo, 5'-CGTCGGCCATGACCACATGGACGATTTT
CAAGAG
AAATCGTCCATGTGGTCATGGCTTTTTTGGAAT-3 'y 5'-CGATTCCAAAAAAGCCATGACCACATGGACGATTT
CTCTTG
AAAATCGTCCATGTGGTCATGGCCGA-3' para la osteopontina, 5'-CGCGTCGCCCGGATCCTAGATGCAAAGA
TTCAAGAGA
TCTTTGCATCTAGGATCCGGGTTTTTTGGAAT-3 'y 5'-CGATTCCAAAAAACCCGGATCCTAGATGCAAAGA
TCTCTTGAA
TCTTTGCATCTAGGATCCGGGCGA-3' y 5 'de LAMB3-CGCGTCGGTGTACAGATCCGAAGTTTCAT
TCAAGAG
ATGAAACTTCGGATCTGTACACTTTTTTGGAAT-3' y 5'-CGATTCCAAAAAAGTGTACAGATCCGAAGTTTCAT
CTCTTGA
ATGAAACTTCGGATCTGTACACCGA -3 'para ITGB1. Lenti generación de virus y la infección de las células SPC-A-1sci se realizaron como se ha descrito anteriormente.
Experimentos con Animales
De cinco a seis semanas de edad ratones desnudos masculinos fueron mantenidos bajo de patógenos específicos libres (SPF) condiciones. Los ratones fueron manipulados y alojados de acuerdo a los protocolos aprobados por la Comisión de Cuidado de Animales de Medicina Experimental de Shanghai. Para analizar la capacidad de metástasis in vivo de las células SPC-A-1sci con osteopontina noqueado, β3 laminina o β1 integrina, 2,0 × 10
se inyectaron células 6 SPC-A-1sci en las venas de la cola de ratones desnudos. Diez semanas más tarde, todos los ratones se sacrificaron, y los pulmones se retiraron y se procesaron para los estudios histológicos estándar por fijación en formalina al 10%. Las muestras fijadas se incluyeron en parafina, y se obtuvieron tres secciones en serie no secuenciales por animal. Las secciones fueron teñidas con H & amp;. E y analizó la presencia de metástasis
Tejidos Humanos NSCLC
Se obtuvieron muestras de los pacientes en este estudio tras consentimiento informado, de acuerdo con un protocolo establecido, aprobado por el Comité de ética de la Escuela Universitaria de Shanghai Jiao Tong. Los datos no contienen ninguna información que pueda conducir a la identificación de los pacientes. pares emparejados (n = 135) de los tejidos de cáncer de pulmón y los tejidos no cancerosos adyacentes se utilizaron para la construcción de una micromatriz de tejido (Shanghai Biochip Co., Ltd. Shanghai, China) como se describe previamente (34). La tinción inmunohistoquímica se realizó para detectar la expresión de osteopontina, LAMB3, y ITGB1 en los tejidos de cáncer de pulmón y los tejidos no cancerosos emparejados. Los anticuerpos primarios contra la osteopontina, LAMB3, y ITGB1 se obtuvieron de Sigma (1:250), Santa Cruz (01:50), y Abgent (01:50). La puntuación se mide por el porcentaje de células positivas con las siguientes intensidades de tinción: menos de 5% obtuvo "0"; 5-24% marcó "1"; 25-49% marcó "2"; 50-74% marcó "3"; y más del 74% marcó "4".
Análisis estadístico
Los resultados se presentan como la media ± desviación estándar. Las comparaciones de los datos cuantitativos se analizaron por
t de Student
entre los dos grupos (de dos colas;
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado significativo). Se utilizó la prueba exacta de Fisher para comparar las variables cualitativas. Los análisis se realizaron con SAS 9.0 para Windows.
Resultados
Las diferentes cepas de la SPC-A-1sci Línea de pantalla de células diferentes metastásico Potenciales
En nuestro trabajo anterior, un gran línea celular de cáncer de pulmón metastásico (llamado SPC-a-1sci) se estableció a partir de la línea celular de cáncer de pulmón humano metastásico mal SPC-a-1 a través de tres ciclos de selección in vivo. La significativamente mayor potencial metastásico del SPC-A-1sci línea celular con relación a la línea de SPC-A-1 ha sido demostrado por una serie de experimentos in vivo e in vitro. Para explorar las causas del alto potencial metastásico de la línea de células SPC-A-1sci, obtuvimos aún más las cepas de células monoclonales SPC-A-1sci H y SPC-A-1sci M de las células SPC-A-1sci y el SPC monoclonal cepa de células -A-1L de la línea celular SPC-A-1 por dilución limitante ensayo clonal, como se describe previamente, con ligeras modificaciones (Figura 1A).
(A) Morfología de cinco cepas de células monoclonales seleccionados a partir de el SPC-A-1sci y líneas de células SPC-A-1 por ensayo de dilución limitante. Las células de los padres SPC-A-1sci y SPC-A-1sci H y de células SPC-A-1sci M cepas de toda la forma de exposiciones giro. (B) Las actividades de la motilidad de SPC-A1sci, SPC-A1sci H, SPC-A1sci M, SPC-A-1 y células SPC-A1 L se determinaron mediante ensayos de curación de la herida a los arañazos. (C) Invasión ensayos de SPC-A-1sci, SPC-A1sci H, SPC-A1sci M, SPC-A-1 y células L SPC-A1 (400 aumentos). (D) Los ensayos de migración de SPC-A-1sci, SPC-A1sci H, SPC-A1sci M, SPC-A-1 y células SPC-A1L (400 aumentos). Se llevaron a cabo tres experimentos independientes; los resultados se expresan como la media + SD; * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01, *** P & lt;. 0.001
Para explorar el potencial metastásico de SPC-A-1sciH, SPC-A-1sciM y SPC-A-1L , la curación de heridas a los arañazos (Figura 1B) y los ensayos de migración e invasión se realizaron (Figura 1 C, D). Los resultados mostraron que las tres cepas de células monoclonales presentan marcadamente diferentes potenciales metastásicos; SPC-A-1sci H tenía potencial metastásico una parecida a la de SPC-A-1sci, SPC-A- L tenía un potencial similar metastásico a SPC-A-1, y SPC-A-1sciM tenían un potencial metastásico intermedio.
Los análisis bioinformático de cepas de células monoclonales con alta, media y baja metastásico Potenciales
en primer lugar, hemos identificado los genes expresados diferencialmente en al menos dos veces en el SPC-a-1sciH, las células SPC-a-1sciM comparan respectivamente a las células SPC-a-1L. Se encontró que un total de 4534 genes son expresados diferencialmente como la intersección de SPC-A-1sciH vs SPC-A-1L y SPC-A-1sciM vs SPC-A-1L. De estos genes, los genes se upregulated 2277 y 2257 se downregulated genes.
Para identificar con mayor precisión los genes clave relacionados con la metástasis del cáncer de pulmón, se aplicó el análisis bioinformático para analizar las diferencias funcionales entre las vías y SPC-A- 1sciM vs SPC-A-1L y SPC-A-1sciH vs SPC-A-1L, respectivamente (figuras S1, S2). Los resultados que se presentan en el Go-mapa revelaron las interacciones y las atribuciones de las funciones importantes de los genes expresados diferencialmente. Con un umbral de
P-valor
& lt; 0,0001, a partir del análisis funcional de los genes regulados diferencialmente expresados, se encontró que las funciones importantes se asocian principalmente con el conjunto de hemidesmosomas, la regulación positiva de la diferenciación de eritrocitos, la organización de la vesícula, sinaptogénesis, la organización de los microtúbulos y el citoesqueleto y la regulación, la detención del ciclo celular y la regulación, la adhesión celular y la endocitosis, la transcripción del ADN, la inactivación de la actividad MAPK, desfosforilación aminoácidos de la proteína y el transporte intracelular de proteínas. La proliferación celular, la diferenciación y la apoptosis también se vieron influidos, acompañado de las funciones de respuesta inmune y la inflamación correspondiente. Al mismo tiempo, la mayoría de los genes expresados diferencialmente reguladas por tenía funciones en la proliferación celular, incluyendo: la replicación del ADN y la regulación durante la mitosis, la organización del husillo, la duplicación del centrosoma y punto de control del ciclo celular, nucleótidos y regulación negativa de la proliferación de células epiteliales, así como respuesta a estímulos daño en el ADN a través de la reparación del ADN y la recombinación, el montaje y el desmontaje de la cromatina, hidratos de carbono, lípidos y metabolismo de aminoácidos y otros
.
a partir del análisis de la vía y la Ruta-Net, llegamos a la conclusión de que el hasta genes -regulated participan principalmente en la vía de señalización MAPK, vía de señalización Wnt, vía de señalización JAK-STAT, vía de señalización de TGF-beta, y la adhesión celular. Genes identificados también influyen en la capacidad de la célula para cambiar su citoesqueleto y la polaridad y están implicados en la aparición, la migración y el metabolismo de los tumores. Mientras tanto, las reguladas por los genes participaron principalmente en reparación de genes y la recombinación homóloga o se asociaron con el PPAR, TGF-beta, y las vías de señalización de p53, interacciones ECM-receptor y numerosas vías metabólicas (umbral de
P-valor
& lt;. 0.001) (figuras S3, S4)
de acuerdo con las vías significativos identificados anteriormente y las interacciones de los genes expresados diferencialmente que participan en las vías (de acuerdo con la base de datos KEGG), un modelo de flujo de la señal era construido. Una red de regulación cuantitativa, se calcula por una red neural utilizando las intensidades de señal de los genes expresados diferencialmente. Determinada a partir de la diferencia de peso entre los 2 genes y los genes que cada gen está relacionado con ese estado de SPP1, LAMB3, MAPK1 JUN como reguladores clave se demostró (Figura 2). Los niveles de expresión de osteopontina, LAMB3, y ITGB1 se midieron por qRT-PCR, y los resultados fueron concordantes con los perfiles de expresión génica. Los niveles de expresión de osteopontina, LAMB3 y ITGB1 fueron mayores en las líneas de células SPC-A-1sci H y SPC-A-1sci M que en la línea de células SPC-A-1 L (Figura S5).
modelo de flujo de señal de la unión de la expresión génica diferencial. El punto representa el gen y la dirección de la línea representa la dirección de la regulación. El número de la línea es el peso de regulación: cuanto mayor sea el peso, más gruesa será la línea y el más fuerte es la capacidad reguladora. La forma de flecha de destino de la línea representa el modo de regulación de la activación.
Las células SPC-A-1sci transfectadas con siRNA contra la osteopontina, LAMB3, y ITGB1 pantalla de baja migración y la invasión in vitro
Para explorar las funciones de la osteopontina, LAMB3 y ITGB1 en la metástasis del cáncer de pulmón, las células transfectadas SPC-a-1sci con siRNA-osteopontina, siRNA-LAMB3 o siRNA-ITGB1 y realizado ensayos de migración y la invasión. RT-PCR y análisis de transferencia Western demostraron knock-down eficaz de osteopontina, LAMB3, y ITGB1 en las células SPC-A-1sci (Figura 3A, B). células SPC-A-1sci transfectadas con cualquiera de siRNA-osteopontina, siRNA-LAMB3 o siRNA-ITGB1 muestran capacidades de migración e invasión significativamente más bajos en comparación con la línea celular de sus padres SPC-A-1 Ciencia (Figura 3C, D). A continuación, el ARNm de osteopontina y los niveles de expresión de proteínas se midieron en SPC-A-1sci cuales transfectadas con siRNA contra LAMB3 y ITGB1, los resultados mostraron knock-down de LAMB3 y ITGB1 niveles de expresión no tenía ninguna influencia sobre la expresión de la proteína de OPN. LAMB3 y ITGB1 tuvieron los mismos resultados (Figuras S6A, B). Para determinar la relación entre la osteopontina, LAMB3 y ITGB1, transfectadas las células SPC-A-1sci con siRNA-osteopontina + siRNA-LAMB3, siRNA-osteopontina + siRNA-ITGB1, siRNA-ITGB1 + siRNA-LAMB3 y siRNA-osteopontina + siRNA-LAMB3 + siRNA-ITGB1, la capacidad de migración y la invasión de estas células co-transfectadas con dos o más siRNA se redujo significativamente en comparación con la capacidad de invasión y la migración de las células co-transfectadas con un siRNA ((Figuras S6 C, D, e). los resultados indican un papel trans-regulación de la osteopontina, LAMB3 y ITGB1 en la metástasis del cáncer de pulmón.
(a) RT-PCR se realizó y mostró efectiva knock-down de la expresión mediada por siRNA-osteopontina, siRNA-LAMB3 y siRNA-ITGB1. (B) Western blot mostró disminución de la expresión de osteopontina, LAMB3 y ITGB1. Migración (C y D) y ensayos de invasión de SPC-A-1sci, SPC-A1sci /siRNA-osteopontina, SPC-A-1sci /. siRNA-LAMB3 y SPC-A1sci /siRNA-ITGB1 (400 aumentos) se realizaron tres experimentos independientes, los resultados se expresan como la media ± SD; * P & lt; 0,05, ** P & lt; 0,01, *** P & lt;. 0.001
Knock-down de osteopontina, LAMB3, y ITGB1 En SPC-A-1sci células como resultado una baja potencial metastásico En vivo
Para conocer más a fondo si la osteopontina, LAMB3 y ITGB1 están involucrados en la metástasis del cáncer de pulmón in vivo, de 4 a 6 semanas de edad, los ratones hembra desnudos fueron divididos en 4 grupos randomnly y recibieron inyección en la vena de la cola de 2 x 10
6 células SPC-A-1sci transfectadas con el control shRNA-negativo, shRNA-osteopontina, shRNA-LAMB3 o shRNA-ITGB1. Diez semanas más tarde, se recogieron los pulmones para el análisis inmunohistoquímico (Figura 4)
Imágenes representativas histológicas de los pulmones del ratón inspeccionados para detectar la presencia de lesiones microscópicas (20 ×, superior; 400 ×, inferiores). Diez semanas después de cola- vena inyecciones con células SPC-a-1sci expresan de forma estable shRNAs contra el control negativo (shRNA-NC, izquierda 1), osteopontina (shRNA-osteopontina; izquierdo 2), β3 laminina (shRNA-LAMB3, justo 2), y β1 integrina ( shRNA-ITGB1, justo 1).
también contó a los ratones con metástasis de cáncer de pulmón y ganglios metastásicos en cada grupo. Como se muestra en la Tabla 1, se detectaron pocas metástasis ganglionares de pulmón en los ratones inyectados con células SPC-A-1sci transfectadas con shRNA-osteopontina, shRNA-LAMB3 o shRNA-ITGB1. Por el contrario, las metástasis pulmonares fueron evidentes en los ratones inyectados con células de control negativo. Por lo tanto, es evidente que la osteopontina, LAMB3 y ITGB1 juegan un papel importante en el proceso metastásico de la línea celular de cáncer de pulmón SPC-A-1sci.
osteopontina, Niveles de expresión y LAMB3 ITGB1 en cáncer de pulmón son asociados con la enfermedad avanzada, grado histológico, y metástasis de ganglios linfáticos
Para validar los efectos de la osteopontina, LAMB3 y ITGB1 expresión en el cáncer de pulmón, se compararon sus niveles de expresión en tejidos de cáncer de pulmón humano (n = 135) y emparejado tejidos normales adyacentes mediante tinción inmunohistoquímica (IHC).