Extracto
receptor específico de células fotorreceptoras (PNR /NR2E3 ) es un receptor nuclear huérfano que juega un papel crítico en el desarrollo de la retina y el mantenimiento de los fotorreceptores. Las mutaciones que causan enfermedades en el PNR tienen un efecto pleiotrópico que resulta en mayor o menor enfermedades de la retina. Recientemente, PNR se ha implicado en el control de las funciones celulares en células de cáncer. PNR se informó a ser una novela regulador de la expresión ER en las células de cáncer de mama, y la expresión de alto PNR se correlaciona con la respuesta favorable al tratamiento con tamoxifeno. Por otra parte, el PNR ha demostrado aumentar la estabilidad de p53 en células HeLa, lo que implica que el PNR puede ser una diana terapéutica en este y otros tipos de cáncer que conservan un gen p53 de tipo salvaje. Para facilitar aún más la comprensión de las funciones del PNR en el cáncer, que caracteriza el compuesto 11a, un sintético, agonista putativo PNR en varios ensayos basados en células. Curiosamente, mostramos que 11a no pudo activar PNR y su citotoxicidad era independiente de la expresión PNR, excluyendo PNR como un mediador de la citotoxicidad 11a. El análisis sistemático de los efectos citotóxicos de 11a en NCI-60 líneas celulares mostraron una fuerte correlación positiva de la citotoxicidad con la condición de p53, es decir, las líneas celulares de tipo salvaje de p53 fueron significativamente más sensibles a la 11a que p53 mutado o nula de células líneas. Además, el uso de HCT116 p53 + /+ y p53 - /- las líneas de células isogénicas que reveló que el mecanismo de la citotoxicidad inducida por 11a produjo a través de G
1 /S detención del ciclo celular de fase en lugar de la apoptosis. En conclusión, se observó una correlación de la sensibilidad 11a con la condición de p53, pero no con la expresión PNR, lo que sugiere que los tumores que expresan p53 de tipo salvaje pueden ser sensibles a este compuesto
Visto:. Zhao Z, Wang L, Wen Z, Ayaz-Guner S, Wang Y, Ahlquist P, et al. (2013) Los análisis sistemático de los efectos citotóxicos del Compuesto 11a, un agonista sintético putativo del receptor nuclear de fotorreceptores-específica (PNR), en líneas celulares de cáncer. PLoS ONE 8 (9): e75198. doi: 10.1371 /journal.pone.0075198
Editor: Eric Xu, Van Andel Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 14 de mayo de 2013; Aceptado: August 11, 2013; Publicado: 16 Septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Zhao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este proyecto con el apoyo de los Institutos nacionales de Salud CA125387 a WX, NIH subvención CA22443 a PA y la efectividad del Departamento de Defensa de esperanza Académico Premio W81XWYH-11-1-0237 a WX. PA es un investigador del Instituto Médico Howard Hughes. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
receptores nucleares de hormonas regulan una variedad de procesos biológicos esenciales, incluyendo el desarrollo, la diferenciación y la supervivencia celular [1-3]. Sus actividades y los niveles de expresión están estrechamente controlados, y la desregulación de los receptores nucleares (NR) y sus coregulators está implicado en enfermedades metabólicas y el desarrollo del cáncer [4-6]. NR son el segundo mayor familia de proteínas que son el blanco de los fármacos [7]. De los 48 receptores nucleares identificados en los seres humanos, aproximadamente la mitad son bien caracterizado con ligandos naturales conocidos. Los que se sometan restantes son los llamados receptores nucleares huérfanos porque sus ligandos fisiológicos siguen siendo desconocidos. A pesar de no tener ligandos naturales, los receptores nucleares huérfanos pueden ser dirigidos con ligandos sintéticos para el tratamiento de enfermedades humanas, por ejemplo, ROR sintético y LRH-1 agonistas se utilizan para tratar enfermedades metabólicas y autoinmunes [8]. ensayos de polarización fluorescente, luminiscente amplificado homogéneo de proximidad (AlphaScreen) ensayos, y resuelta en el tiempo de transferencia de energía de fluorescencia ensayos (TR-FERT) se han desarrollado de detección como de alto rendimiento (HTS) enfoques para identificar compuestos que se dirigen a receptores nucleares con fines terapéuticos [9- 12].
NR2E3 /PNR es un receptor nuclear huérfano que es altamente expresado en células de la retina [13] y modestamente expresadas en próstata y de útero tejidos [14,15]. PNR activa la expresión de genes de varilla específica y suprime la expresión de genes de cono específica por abajo de la regulación de ciclina D1 y TBX2 [16-20]. Este patrón de regulación de genes define la doble función de PNR en la mediación del desarrollo y mantenimiento de los fotorreceptores [21]. Las mutaciones en PNR se han encontrado en diversas enfermedades de la retina, incluyendo el síndrome mejorado S-cono, formas autosómicas dominantes y recesivos de la retinitis pigmentosa, síndrome de Goldmann-Favre, y agrupadas degeneración de la retina pigmentaria [22-27]. Nuevas evidencias sugieren que el PNR podría tener importantes funciones en las células cancerosas mediante la regulación de la estabilidad de p53 y la expresión del receptor de estrógenos alfa (ER). En HeLa y líneas celulares de cáncer de p53 positiva HCT116, PNR estabiliza p53 por acetilación e induce la apoptosis [28]. En las líneas celulares de cáncer de mama ER-positivos MCF7 y T47D, PNR regula ER mediante la unión directamente a la región promotora ER, lo que aumenta ER expresión de genes [29]. La expresión del PNR también se asocia significativamente con la supervivencia libre de recidiva y una respuesta favorable en el tamoxifeno, los pacientes ER-positivo de cáncer de mama con ganglios negativos [29]. Estos estudios implican que PNR podría ser una diana terapéutica para enfermedades de la retina, cánceres de retención un gen p53 de tipo salvaje, y los cánceres de mama ER-positivos.
agonistas específicos PNR, naturales o sintéticos, se han identificado usando alto rendimiento ensayos de selección. Debido a apo-PNR se ha demostrado que interactúan con los co-represores N-COR, SMRT, y RetCoR [20,30], el PNR compuesto agonista sintético 11a se identificó utilizando de fusión dominio de unión a un ligando de dominio de unión a ADN GAL4 PNR β-lactamasa ensayo de transactivación y ensayo de liberación de NCOR [30,31]. Aunque 11a se probó en ensayos basados en células para efectos agonistas en el PNR y ha demostrado tener una toxicidad baja en las líneas celulares de control, 11a no se ha demostrado que se unen directamente PNR. Más bien, la evidencia reciente sugiere que 11a es poco probable que sea un agonista directo PNR [32]. Nuestro resultado está de acuerdo con esta conclusión después. Como PNR ha sido recientemente implicada en el cáncer de mama ER positivo y se muestra para regular la estabilidad de p53, este compuesto puede tener utilidad terapéutica. Sin embargo, la evaluación sistemática de la citotoxicidad compuesto era deficiente y las dianas celulares de 11a todavía no se han definido. En este estudio se evaluaron sistemáticamente los efectos citotóxicos de 11a en el Instituto Nacional del Cáncer de 60 líneas celulares [33] y se encontró que la citotoxicidad 11a es independiente de la expresión PNR, pero se correlaciona positivamente con la condición de p53, con mayor sensibilidad en líneas celulares de p53 de tipo salvaje que nula p53 /líneas de células mutantes. El uso de HCT116 p53 + /+ y p53 - /-. Isogénicas líneas celulares, hemos demostrado que los efectos citotóxicos de la 11a resulta en gran medida de p53 inducida por G
1 /S detención del ciclo celular en fase, con una contribución menor de la apoptosis
Materiales y Métodos
cultivo celular y tratamiento 11a
La línea celular LM2 fue una especie de regalo del Dr. Joan Massagué [34]. Las líneas celulares isogénicas HCT116 fueron una especie de regalo del Dr. B. Vogelstein [35]. Todas las otras líneas celulares se obtuvieron de la American Type Culture Collection (Rockville, MD). El HEK293T, MCF7, MDA-MB-231, LM2, MDA-MB-468, las líneas celulares isogénicas SKOV3, y HCT116 se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Gibco, Gaithersburg, MD) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) (Gibco) a 37 ° C con 5% de CO
2. La líneas celulares de cáncer de ovario OVCAR3 A2780 y se mantuvieron en RPMI-1640 (Gibco) suplementado con 10% FBS. La línea celular de cáncer de mama T47D se mantuvo en DMEM /F12 (Gibco) suplementado con 10% FBS. Compuesto 11a se adquirió de Pharmabridge Inc. (Pennsylvania Centro de Biotecnología, Doylestown, PA). El polvo 11a se disolvió en etanol y después primero en dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) a una concentración final de 8 mM. células asíncronas se sembraron 24 horas antes del tratamiento con 11a, de tal manera que las células eran de aproximadamente 50% -60% de confluencia en el momento de la adición de 11 bis. La concentración final de 11a en nM - gama M se consiguió por dilución de 11a en el medio fresco, y 0,1% de DMSO se utilizó como el control para cada experimento. All-trans retinoico ácido, doxorrubicina, etopósido, estaurosporina y 3-aminobenzamida fueron adquiridos de Sigma (St. Louis, MO).
Para el análisis del ciclo celular, las células se privaron de suero durante 24 horas con el fin de lograr G
0 sincronización. Después, las células se les permitió volver a entrar en el ciclo celular, completándolo con DMEM más FBS al 10% que contiene las concentraciones indicadas de 11a.
empaquetadoras de retrovirus, la infección y la generación de la línea celular estable
El embalaje plásmidos PME-VSVG, pHIT60 y pLNCX fueron adquiridos de OpenBiosystems (Huntsville, AL). Los retrovirus se empaquetaron en células HEK293T transfectadas con 3,8 g PME-VSVG, 1,4 mg y 3,8 mg pHIT60 pLNCX-GFP o pLNCX-PNR usando reactivo de tránsito-LT1 (Mirus Bio) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Seis horas después de la transfección, el medio se cambió. Las partículas de virus se recogieron 24 a 48 horas más tarde usando un filtro de jeringa de 0,45 micras (Thermo Scientific).
Para infectar las células con retrovirus, los virus se mezclaron con un volumen igual de medio fresco suplementado con 10% FBS. Polybrene se añadió a una concentración final de 5 mg /ml con el fin de aumentar la eficacia de la infección. El medio se cambió 6 horas después de la infección. Las células se seleccionaron con G418 (800 mg /ml) durante una semana para generar líneas celulares estables que expresan GFP o PNR.
CellTiter Glo ensayos de viabilidad celular luminiscente
Uno mil células por pocillo fueron sembradas en cuadriplicado en una placa de 384 pocillos y se trataron con las concentraciones indicadas de 11a para una semana. Las células fueron entonces sometidas al ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter Glo de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega, Madison, WI). El IC
50 valores se calcularon utilizando el XLfit
TM complemento para Excel.
ensayos de reportero de luciferasa
El indicador de luciferasa impulsado por DR2, TLX y COUP-TFI plásmidos fueron regalos de tipo Dr. Ronald Evans. Coup-tfii plásmido fue una especie de regalo del Dr. Michael Gould. Los otros plásmidos se adquirieron de OpenBiosystems (Huntsville, AL). Los ensayos de luciferasa se realizaron utilizando el sistema de ensayo de luciferasa (Promega, Madison, WI). células HEK293T se sembraron en una placa de 96 pocillos (2 × 10
3 /pocillo). Después de 24 horas, las células fueron transfectadas utilizando el tránsito LT1 (Mirus Bio) con el reportero impulsado por DR2 20 ng de luciferasa, reportero de β-galactosidasa 10 ng y 20 ng del vector de expresión de CMV para el control, el PNR, TLX, COUP-TFI o coup-tfii. Se añadió el compuesto 11a 24 horas después de la transfección, y se determinó la actividad de luciferasa después de la incubación durante 24 horas adicionales. β-galactosidasa actividad se utilizó para normalizar la eficiencia de transfección.
Ensayos de proliferación celular
Las células (2 × 10
3 /pocillo) se sembraron en una placa de 96 pocillos. Después de 24 horas, se añadieron varias concentraciones de 11a a las placas. Las células se cultivaron durante 72 horas y luego de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (Sigma-Aldrich) solución (20 l por pocillo, 4 mg /ml en PBS) se añadió. Las células se incubaron a 37 ° C durante 4 horas. Después de desechar el sobrenadante, se añadieron 200 l de DMSO y la absorbancia se midió con un filtro de 540 nm en un lector de microplacas Victor X5 (PerkinElmer, Waltham, MA). Aproximadas IC
50 valores se calcularon utilizando GraphPad Prism Software (Versión 5.04, Gráfico-Pad Software Inc., San Diego, CA) y un registro de tres parámetros de regresión no lineal frente a la respuesta.
Cell Análisis de Ciclo
Las células se cosecharon por tripsinización, se centrifugaron y se fijaron en 80% enfriado con hielo gota a gota etanol con agitación continua. Antes del análisis, las células se centrifugaron, y se retiró el etanol. Los sedimentos celulares se resuspendieron en 1 ml de solución de PI /RNasa (/yoduro de propidio 50 mg ml, 50 mg /ml de RNasa A, 0,25% de Triton X-100 en PBS). La citometría de flujo El análisis se realizó con un FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA) con excitación a 488 nm. histogramas rojo fluorescente integrados se analizaron con Modfit LT (Verity Software House, Topsham, ME).
ensayo de apoptosis medida por Anexina V /PI tinción
Las células se tiñeron con Alexa-488 Anexina V y PI, y se evaluó la apoptosis por citometría de flujo de acuerdo con el protocolo del fabricante (Invitrogen). Brevemente, 1 × 10
6 Las células se lavaron dos veces con PBS, y se tiñeron con 5 l de anexina V y 1 l de PI (100 g /ml) en 1 x tampón de unión durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. La citometría de flujo El análisis se realizó con el FACSCalibur. Tanto apoptótica temprana (anexina V-positivo, negativo PI) y tardía (anexina V y PI-positivo-positivo) células apoptóticas fueron incluidos en las determinaciones de muerte celular analizados por FlowJo (Árbol Star Inc., Ashland, Oregón).
análisis de transferencia Western
Las células se recogieron y se lisaron con tampón RIPA (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 0,5% desoxicolato de sodio, 1% de Triton X 100, DTT 1 mM, inhibidores de proteasa y benzonasa) . Después de la centrifugación, la proteína total se cuantificó usando la proteína BioRad ensayo (BioRad), y 25 g de proteína se resolvió SDS-PAGE. Las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa durante 1,5 horas a 0,35 A. Las membranas se bloquearon con 5% de leche sin grasa y se incubaron con el anticuerpo primario a temperatura ambiente durante 2 horas o durante la noche. Las membranas se incubaron con anticuerpo secundario durante 1 hora a temperatura ambiente y se visualizaron utilizando SuperSignal West Pico Substrato quimioluminiscente (Thermo Scientific, Waltham, MA) en la película de autorradiografía. anticuerpo anti-PNR se ha generado por la Genemed Síntesis Inc., TX. Dos péptidos KLH conjugados fueron sintetizados por Genemed Síntesis Inc.: PETRGLKDPEHVEALQD y LSQHSKAHHPSQP, correspondiente a los aminoácidos 331-347 PNR humanos y 353-365, respectivamente. Estos péptidos se utilizaron para inmunizar conejos. El antisuero se purificó por afinidad después de la extracción final para obtener anticuerpos específicos anti-PNR. Los anticuerpos anti-p53 y anti-p21 se obtuvieron de Pierce (Rockford, IL); anticuerpos anti-ciclina D1 y anti-Hsp90 se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA); anticuerpo anti-PARP se obtuvo de Señalización Celular Tecnología (Danvers, MA).
Análisis cuantitativo PCR en tiempo real
El ARN total fue extraído por medio de HP Total de ARN Kit (VWR Scientific, West Chester, PA) según las instrucciones del fabricante. 1 g de ARN se invirtió transcrito usando Superscript II RT de acuerdo con el protocolo del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA) y PCR cuantitativa se realizó utilizando SYBR tinte verde (Roche Scientific, Basilea, Suiza) y un instrumento CFX96 (BioRad, Hercules, CA ). Primers secuencias (IDT, Coralville, IA) utilizados en este estudio fueron los siguientes: TFII GOLPE: adelante, 5'-GCCATAGTCCTGTTCACCTC-3 '; revertir, 5'-GGTACTGGCTCCTAACGTATTC-3 '; RARB2: adelante, 5'-GTGGAGTTTGCTAAACGTCTG-3 '; revertir, 5'-TCATGGTGTCTTGTTCTGGG-3 '; NGFI-A: adelante, 5'-CAGCACCTTCAACCCTCAG-3 '; revertir, 5'-AGTCGAGTGGTTTGGCTG-3 '; 18S: adelante, 5'-CAGCCACCCGAGATTGAGCA-3 '; revertir, 5'-TAGTAGCGACGGGCGGTGTG-3 '.
El análisis estadístico
Todos los resultados son representativos de al menos tres experimentos independientes. La significación estadística de la IG
50 valores de la cepa silvestre, mutado, y las líneas celulares de p53 nulos se calculó utilizando una prueba no pareada de dos caras de Wilcoxon de suma de rangos. La significación estadística de la expresión génica en el análisis y ensayos de apoptosis QRT-PCR fue calculada utilizando una prueba t de Student bilateral.
Resultados
11a no tiene efectos agonistas hacia PNR en por células ensayos basados
para investigar las funciones celulares de PNR, se emplearon compuesto 11a (estructura que se muestra en la Figura 1A), un agonista putativo describen anteriormente PNR con un grupo ciclopropilo amida informado para conferir una alta actividad agonista hacia PNR (CE
50 & lt; 200 nM) [31]. Compuesto 11a se sintetizó y
datos de espectrometría de masas (figuras S1 y S2) 1H-NMR y se confirmó la estructura molecular correcto y el peso molecular de 11 bis. TLX, COUP-TFI y COUP-TFII están en la misma subfamilia de receptores nucleares como PNR [36], que se unen a una repetición directa del motivo GGTCA con una separación de 2 pb (DR2) [37]. Con el fin de evaluar la especificidad de 11a a PNR, la activación de PNR y estos receptores huérfanos estrechamente relacionadas, por 11a se compararon en un ensayo de informador de luciferasa impulsado-DR2 (Figura 1B y 1C). células HEK293T fueron transfectadas con vectores de expresión para PNR [13], TLX [38], COUP-TFI [39] o COUP-TFII [39] y un gen informador de luciferasa impulsado por DR2, y las células se trataron posteriormente con 11a usando concentraciones que van de 15 nM a 150 nM para minimizar el efecto citotóxico. A 15 nM, 11a no se active ninguno de los receptores nucleares probadas. A medida que la concentración aumentó, 11a activa ligeramente TLX, COUP-TFI y COUP-TFII de una manera dependiente de la dosis. Sin embargo, la activación PNR se observó sólo en la concentración más alta probada (& gt; 150 nM) (Figura 1B). Hemos observado que las concentraciones de 11a superior a 150 nm fueron la muerte celular inducida por citotóxicos y severa, lo que limita la precisión de ensayo indicador de luciferasa. Este resultado indica que 11a no tiene efectos agonistas obvias hacia PNR. Debido PNR fue la menos activa entre los cuatro receptores nucleares probadas en el rango indicado de las concentraciones de 11a (Figura 1C), nuestros resultados indican que la especificidad de 11a hacia PNR es baja y el agonismo de 11a no es probablemente un efecto directo, como se muestra en el estudio de liberación NCOR donde 11a también inhibió las interacciones RAR-NCoR [32] TRβ-NCOR y.
(a) estructura química de la 11a. células HEK293T transfectadas con las construcciones indicadas se trataron por triplicado con 0,1% de DMSO, 15 nM, 30 nM, 60 nM, 120 nM o 150 nM 11a. Los datos se expresan como unidades relativas de luciferasa se normalizaron con el control DMSO ± SD. (B) Comparación entre los diferentes receptores nucleares con concentraciones crecientes 11a. (C) Comparación entre varias dosis de 11a con diferentes receptores nucleares.
relacionados con el PNR Debido 11a activa los receptores nucleares COUP-TFI y COUP-TFII en el ensayo de luciferasa DR2 en la relativamente baja concentración de 30 nm (Figura 1) y sólo coup-tfii podrían ser detectados en todas las líneas celulares de cáncer de mama [40], se examinó si 11a podría alterar la expresión de COUP-TFII genes diana aguas abajo en MCF7 y T47D, dos líneas celulares de cáncer de mama positivo ER . COUP-TFII ha sido implicada en varios tipos de cáncer para los efectos supresores oncogénicos y tumorales [41]. En las células de cáncer de mama, RARB2 [42,43] y NGFI-A [44,45] son dos objetivos directos bien caracterizados hasta reguladas por coup-tfii. Todo trans-retinoico (ATRA) se había demostrado que aumentar el nivel de ARNm-TFII GOLPE, así como la mejora de coup-tfii expresión del gen diana aguas abajo [46]. De hecho, se encontró que 1 M atRA para aumentar el nivel de ARNm-TFII golpe de alrededor de 1,5 y 2,5 veces en las células MCF7 y T47D, respectivamente (Figura S3). Curiosamente, a pesar 11a no aumentó los niveles de ARNm de COUP-TFII en las dos líneas celulares, el tratamiento 11a dio lugar a la sobre regulación de COUP-TFII genes diana. En la línea celular MCF7, 0,1 M 11a indujo NGFI-A expresión génica a un nivel similar al de 1 M atRA. 1 M 11a NGFI-A expresión inducida ~ 5 veces más que la de 1 M atRA (Figura S3A). Debido a NGFI-A expresión es demasiado bajo para ser detectado en las células T47D, que mide otro gen diana COUP-TFII, RARB2. En las células T47D, atRA robusta aumentó el nivel de ARNm RARB2 por 30 veces. Aunque 11a también aumentó la expresión de RARB2 de una manera dependiente de la dosis, la magnitud de la activación no era comparable a atRA (Figura S3B). Estos resultados indicaron que posiblemente 11a regula la actividad COUP-TFII de una manera génicas y específico de la célula.
Desde 11a inducida por la muerte celular en las células HEK293T en concentraciones más altas y PNR fue mostrado para inducir la apoptosis en varios tipos de células [ ,,,0],28], se investigó más a fondo si estaba mediada PNR-citotoxicidad inducida por 11a. Debido PNR es indetectable por Western Blot en líneas celulares de cáncer de mama, varias líneas celulares de cáncer de mama PNR sobreexpresión estables, MCF7, MDA-MB-231, LM2 [34] y las células MDA-MB-468, fueron generados (Figura 2A). ensayos de proliferación celular de MTT se utilizaron luego para determinar la IC
50 valores para 11a en líneas de células de control que expresan GFP y líneas celulares PNR que sobreexpresan. El IC
50 valores en las células que sobreexpresan PNR fueron similares a las líneas de células de control correspondientes (Figura 2B-E), con IC
50 valores que van desde 0,05 hasta 0,7 M. Debido a que la sobreexpresión PNR no afectó la citotoxicidad 11a en cualquiera de las células de la prueba, nuestros resultados indican que la citotoxicidad inducida por 11a es probable independiente de PNR en estas células
.
células de cáncer de mama (A) se infectaron con retrovirus que expresan GFP o PNR. se detectó expresión PNR en la transferencia Western y Hsp90 se utilizó como control de carga. (B) MCF7, (C) MDA-MB-231, (D) y LM2-468 MDA-MB células de cáncer de mama (E) fueron tratados con concentraciones 11a que van desde 10
-8-10
-3 M durante 72 horas, y 11a IC
50 valores se obtienen mediante ensayos de proliferación celular MTT.
citotoxicidad 11a se correlaciona con la condición de p53 en NCI-60 líneas celulares
para investigar más a fondo el mecanismo de citotoxicidad y las dianas celulares de 11a, se utilizó el Programa de Desarrollo Terapéutica-60 NCI línea celular servicio de detección (DTP), un servicio de acceso público que asiste en la determinación de la citotoxicidad compuesto en un panel de líneas de células 60 cancerosas, a evaluar la citotoxicidad de 11a en 60 líneas de células [47]. Se recibieron los datos 11a de citotoxicidad para 58 de NCI-60 líneas celulares de DTP y GI
50 datos se muestran en las figuras S4-S6. Este estudio se compone de 60 líneas celulares de 9 diferentes tipos de cáncer: leucemia, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de colon, cáncer del SNC, melanoma, cáncer de ovario, cáncer renal, cáncer de próstata y cáncer de mama. El ensayo de sulforodamina B (SRB) se utilizó para obtener los valores de diferentes líneas celulares de cáncer GI
50 (inhibición del crecimiento del 50%). A pesar de la amplia gama de líneas celulares implicados, el IG
50 valores de 11a cayó en un rango estrecho (10
-6 a la 10
-5 M). Dado que nuestro estudio anterior sugiere que el PNR se estabiliza p53 mediante la modificación posterior a la traducción en HeLa y líneas celulares HCT116 [28], el próximo examinó si la sensibilidad 11a se correlacionó con el nivel de expresión de p53 o el estado de la mutación. El estado de la mutación de p53 de las líneas celulares NCI-60 se determinó anteriormente [48]. Las 58 líneas celulares que hemos recibido GI
50 datos de DTP se pueden clasificar en dos categorías: de tipo salvaje de p53 y p53 mutado /null (Tabla 1). Al comparar la GI
50 valores de los dos grupos (Figura 3), encontramos que las líneas celulares de p53 de tipo salvaje fueron significativamente más sensible que p53 mutado o líneas de células nulas, con IG medio
50 valores de 12,0 M y 19,9 M, respectivamente (p = 0,039, dos caras). Estos resultados implican p53 como factor determinante putativa de la citotoxicidad inducida por 11a.
P53 p53 WT
Mut /Null
línea celular
conc. (M)
Línea celular
conc. (M)
Línea celular
conc. (M)
Línea celular
conc. (µM)
SR12.70HL-608.27KM1220.90OVCAR-551.50A54916.20K-5623.59SW-62030.50OVCAR-813.30NCI-H46018.20MOLT-47.36SF-26838.20ADR-RES3.16HCT-1165.39RPMI-82261.24SF-2955.27SKOV340.20LOX IMVI7.10EKVX2.84SF-53924.20786-021.10MALME-3M20.90HOP-6219.40SNB-1932.40RXF 39326.30SK-MEL-51.28HOP-9217.60SNB-7518.50SN12C27.50UACC-2573.46NCI-H22616.90U25121.40TK-1029.80UACC-6221.40NCI-H237.49M1416.80PC-312.10A49811.60NCI-H322M54.80MDA-MB-43514.50DU-14537.90ACHN13.70NCI-H52213.60SK-MEL-222.80MDA-MB-23116.50CAKI-114.20COLO 20512.40SK-MEL-2818.50HS578T53.40UO-3116.90HCC-299822.30IGROV124.20BT-5492.00MCF74.35HCT-1516.80OVCAR-315.70T-47D6.34average GI5011.96HT2915.90OVCAR-411.00average GI5019.92Table 1. 11a resultados de citotoxicidad para las líneas celulares 58 en la frecuencia de líneas de células NCI60
El GI
50 valores y estado de p53 (WT: tipo salvaje; Mut /nulo.: mutado o nula) se muestran para cada línea celular. Descargar CSV CSV
11a GI
50 valores (M) se representan frente a WT p53 y grupos Mut /null en el diagrama de caja. Se muestran los valores mínimos y máximos, valores de la mediana y los valores medianos. Importancia de ensayo se llevó a cabo mediante la prueba de suma de rangos de Wilcoxon no pareada de dos caras. *, P. & Lt; 0,05
La apoptosis no es el principal mecanismo que explica la citotoxicidad mediada por
11a
Para estudiar el mecanismo de citotoxicidad inducida 11a, se seleccionaron tres líneas celulares de cáncer de ovario con representante de estado de la mutación de p53: SKOV3 (p53 null), A2780 (p53 de tipo salvaje) y OVCAR3 (mutación p53, p.R248Q) [49]. Estas células se trataron con concentraciones crecientes de 11a (0-1 M), y la relación de PARP escindido de PARP total se utilizan como un indicador de la apoptosis [50]. La doxorrubicina se utilizó como control positivo para inducir la apoptosis en las células SKOV3 (Figura 4A). Incluso en las más altas concentraciones ensayadas, 11a sólo modestamente inducida por la escisión de PARP en las células SKOV3, pero no en células A2780 o OVCAR3 (Figura 4A). Sin embargo, el nivel basal de PARP escindido también fue mayor en las células SKOV3 en comparación con las otras líneas celulares. Para investigar cuantitativamente el efecto apoptótico de 11a, se realizó Anexina V /PI doble tinción. De acuerdo con los ensayos de PARP escindida, 11a solamente apoptosis modestamente inducida en las células SKOV3 pero no en células A2780 o OVCAR3 utilizando etopósido como control positivo (Figura 4B y la Figura S7). Se observaron efectos similares en la línea celular de cáncer de mama MCF7, donde tanto la doxorrubicina y la estaurosporina indujeron apoptosis significativa, mientras que 11a no indujo apoptosis en las concentraciones ensayadas (Figura 4C y 4D). En conjunto, estos datos indican que la apoptosis no es el mecanismo principal que representa la citotoxicidad inducida por 11a.
SKOV3, A2780 y células OVCAR3 cáncer de ovario (A) y células de cáncer de mama MCF7 (C) se trataron con las dosis indicadas de 11a o doxorrubicina durante 24 horas. Total de lisados de células se probaron para la escisión de PARP, usando el anticuerpo anti-PARP en transferencias de Western. ß-actina se utilizó como control de carga. Las flechas negras indican las posiciones de proteínas no escindidos y escindidos de PARP. (B) y (D) Después del tratamiento de 24 horas con 2 mM 11a, se recogieron las células y se tiñeron con Anexina V /PI y se sometieron a citometría de flujo. 50 M etopósido (B) o 1 M estaurosporina (STS) (D) sirvieron como controles positivos para la apoptosis. La significación estadística se muestra como ** p & lt; 0,01, *** p & lt;. 0,001 en comparación con el control de DMSO
11a induce G
1 detención del ciclo celular /S de una manera dependiente de p53
Desde 11a no inducir apoptosis significativa en ninguna de las líneas celulares ensayadas, la hipótesis de que la citotoxicidad inducida por 11a se puede atribuir a la detención del ciclo celular, lo que podría inducir la inhibición del crecimiento como se determina por la sulforodamina B (SRB) ensayo colorimétrico se utiliza para la detección de citotoxicidad línea celular NCI-60. Para discernir, además, si la citotoxicidad 11a correlacionada con el estado de p53, el cáncer colorrectal isogénica HCT116 p53 + /+ y p53 HCT116 - /- se utilizaron líneas de células [35]. Curiosamente, estas líneas celulares isogénicas mostraron sensibilidad diferencial a la 11a. La línea celular de p53 de tipo salvaje (IC
50 = 0.0337 M) era aproximadamente 10 veces más sensible que la línea celular nula p53 (IC
50 = 0,3188 M) en una pantalla piloto que realiza el cribado de moléculas pequeñas y Síntesis instalación (SMSSF) de la Universidad de Wisconsin (Figura 5A). La sensibilidad diferencial se confirmó más tarde usando el ensayo MTT proliferación donde p53 células de tipo salvaje (IC
50 = 0.36 mM) fueron más sensibles que las células nulas en p53 (IC
50 = 1,76 M) (Figura 5B). Para investigar más a fondo el mecanismo por el cual las dos líneas celulares isogénicas mostraron sensibilidades diferenciales para 11a, se evaluó los efectos apoptóticos de 11a en estas dos líneas celulares. Las células se trataron con concentraciones crecientes de 11a durante 24 horas, y la apoptosis se midió usando un ensayo de PARP-escote, en el que la relación de escisión de PARP indica el estado apoptótico. La Figura 5C muestra que sólo modesta escisión de PARP se observó en cualquiera de p53 + /+ o p53 - células HCT116 - /. Para examinar si la PARP juega un papel en la citotoxicidad mediada 11a, que las células con 11a y 3-aminobenzamida (3-AB), un inhibidor de PARP específica [51] co-tratados. la inhibición de PARP no afectó la citotoxicidad de 11a (Figura 5D), indicando que la citotoxicidad mediada 11a era independiente de la actividad PARP. El efecto apoptótico de 11a se examinó mediante la tinción con anexina V /PI. Mientras estaurosporina causó apoptosis severa, 11a no indujo ninguna apoptosis en las líneas celulares isogénicas en comparación con el control de DMSO (Figura 5E). Puesto que la proteína PNR fue indetectable en estas células, que PNR seguido de tratamiento con 11a sobre-expresada. Nuestros resultados refuerzan que la apoptosis efecto fue independiente de la PNR (Figura 5F)
(A) los valores de CI
50 de 11a en p53 y p53 + + /-. Líneas celulares HCT116 - /. Las células se sembraron por cuadruplicado en las placas de 384 pocillos y se trataron con las concentraciones indicadas de 11a para 7 días. La inhibición del crecimiento se determinó por ensayo de viabilidad celular luminiscente CellTiter Glo. (B) IC
50 valores de 11a se examinaron en los ensayos de viabilidad celular MTT después de 72 horas de incubación con 11a. (C) Las dos líneas celulares se trataron con 0, 1, 10, 100 o 1.000 nM 11a durante 24 horas y se sometieron a transferencia de Western usando anticuerpo anti-PARP para detectar la escisión de PARP. Hsp90 se utilizó como control de carga. (D) Las células fueron tratadas con concentraciones indicadas de 11a en la presencia o ausencia de 2 mM 3-aminobenzamida (3-AB) durante 72 horas y después se sometieron a ensayos de MTT. (E) Después del tratamiento de 24 horas con 1 mM 11a, se recogieron las células y se tiñeron con Anexina V /PI y se sometió a citometría de flujo. 1 M de estaurosporina (STS) sirvieron como control positivo para la apoptosis. La significación estadística se muestra como ** p & lt; 0,01, *** p & lt; 0,001 en comparación con el control de DMSO. (F) Las dos células fueron transfectadas con 1 g GFP o PNR durante 24 horas seguido de tratamiento con DMSO o 1 M 11a durante otras 24 horas. Western blot se realizó para examinar la escisión de PARP.
Estos estudios indican que la 11a podría tener efectos más profundos en la detención del ciclo celular de la apoptosis. Para examinar si la detención del ciclo celular inducida 11a, se sincronizaron las células en el G
0 /G
1 fase por privación de suero durante 24 horas. La Figura 6 muestra los resultados del análisis de perfil de ciclo celular de las células HCT116 síncronos tratados con DMSO o 50 nM 11a inmediatamente después de la liberación de la privación de suero. Cuando las células fueron tratadas con DMSO, la mayoría de las células estaban en fase S después de 12 horas (64% para las células p53 + /+ y 58% para p53 - /- células), y las células regresado a G
1 fase 24 horas después. Este resultado está de acuerdo con el ciclo normal de las células de 24 horas para estas líneas celulares isogénicas. Sin embargo, cuando las células de tipo salvaje de p53 sincronizado se trataron con 50 nM 11a, una concentración cerca de la citotoxicidad IC
50 de 33,7 nM, un G
1 /S detención del ciclo celular de fase se produjeron hasta 24 horas ( Figura 6B). Después del tratamiento con 11a durante 12 horas, sólo el 10% de las células volvió a la fase S en comparación con el 64% de los tratados con DMSO, y la mayoría de las células 11a tratados fueron detenidos en G
0 /G
1 fase (87%). El G
1 /S detención del ciclo celular fase se mantuvo después de 24 horas (Figura 6B).